Abstract
CDKN2A plakater (koder p16
INK4A og P14
ARF) sletting, noe som resulterer i både Rb og p53 inaktivering, er den mest vanlige kromosomale avvik i humane kreftformer. For å kartlegge nøyaktig delesjonsstoppunkter er viktig for forståelsen av den molekylære mekanismen for genomisk omleiring, og kan også være nyttig for kliniske anvendelser. Imidlertid, nåværende fremgangsmåter for bestemmelse av brytningspunktet er enten av lav oppløsning eller krever isolasjon av relativt rene kreftceller, som kan være vanskelig for kliniske prøver som vanligvis er forurenset med forskjellige mengder av normale vertsceller. For å overvinne dette hinderet, har vi utviklet en ny tilnærming, utpekt Primer Tilnærming Multiplex PCR (PAMP), for berikende stoppunkt sekvenser etterfulgt av genomisk flislegging rekke hybridisering for å finne de svake punktene. I en serie proof-of-concept eksperimenter, var vi i stand til å identifisere kreft-avledet
CDKN2A
genomiske brytningspunkt når mer enn 99,9% av villtype genom var til stede i et modellsystem. Denne konstruksjonen kan skaleres opp med bioinformatikk støtte og kan brukes til å validere annen kandidat kreft-assosiert loci som er avslørt av andre mer systemiske men lavere throughput analyser
Citation. Liu YT, Carson DA (2007) A Novel Approach for Bestemme Cancer Genomisk stoppunkter i nærvær av Normal DNA. PLoS ONE 2 (4): E380. doi: 10,1371 /journal.pone.0000380
Academic Redaktør: David Levens, National Cancer Institute, USA
mottatt: 20 februar 2007; Godkjent: 27 mars 2007; Publisert: 18 april 2007
Copyright: © 2007 Liu, Carson. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes delvis av tilskudd til UCSD NanoTumor Center of Excellence for Cancer nanoteknologi (CA119335), CA23100 (DAC) og AI36214-12S1 (YT L.) fra National Institutes of Health
Konkurrerende interesser:. den forfattere (Y.-TL DAC) har levert en foreløpig patentsøknad basert på denne studien
Innledning
Svulster utvikles gjennom kontinuerlig akkumulering og utvalg av tilfeldig muterte gener.. Mens sett av fordelaktige mutasjoner er valgt i tumorer, kan nøytrale eller til og med svakt skadelig mutasjoner også oppstå på grunn av genomiske ustabilitet og genetisk drift. Nylig har mye arbeid blitt brukt til å identifisere i primære humane kreft peke mutasjoner i eksoner kreftrelaterte gener. Imidlertid har systemisk kartlegging av genomiske DNA-rearrangementer ligget etter, på grunn av tekniske vanskeligheter med å detektere små delesjoner, tumor heterogenitet, og nødvendigheten av å rense ondartet fra normale celler [1]. Historisk slikt arbeid ble gjort av tidkrevende og arbeidskrevende genetikk og molekylær kloning på etablerte kreftcellelinjer [2], [3], [4]. En av de mest slående eksemplene er homozygot sletting av
CDKN2A product: (
INK4A /ARF
) tumor suppressor locus, som ble oppdaget i denne og andre laboratorier [3], [4], [5], [6], [7], [8].
CDKN2A
slettinger forekomme tidlig i kreftutvikling [9], [10], [11]. Den p16
INK4a (en av de
CDKN2A
produkter [12]) protein begrenser cellecyklusprogresjonen av Rb sti og kan være ansvarlig for nedgangen i replikasjonspotensialet av stamceller under aldring [13] . Den P14
ARF (det andre alternativet leseramme av
CDKN2A product: [14]) genprodukt regulerer uttrykket av MDM2, omsetningen av p53, og dermed styrer den cellulære svar på stress (anmeldt i [6 ], [7], [8], [15], [16], [17]). Fordi Rb og p53 trasé er sentrale for kreft gate-holder og omsorgsrelasjoner [18], [19], sterke seleksjonspress finnes for avbrudd av hele
CDKN2A
gensegment på begge kromosomer. Få andre slettinger er også preget, selv om det er ventet at flere vil bli funnet når flere data fra gruppe basert komparativ genomisk hybridisering (matrise-CGH) rapporteres og også gjennom Kreft Genome Atlas (TCGA) prosjektet [20], [21 ], [22], [23], [24]. Det vil være viktig å validere relevansen av disse genomiske rearrangements til kreftutvikling, siden mange av de genomiske strukturelle endringer kan være rett og slett på grunn av genom instabilitet i kreft. Storskala studier med kliniske prøver vil være den mest pålitelige bekreftelsen.
Mens punktmutasjoner og veldig små innskudd eller slettinger i genomisk DNA kan påvises ved ekson re-sekvensering, kan det være vanskeligere å oppdage genet doseendringer av større genomiske fragmenter, særlig delesjoner [1]. Nåværende etablerte teknikker for kartlegging sletting, inkludert Southern blotting [25], fluorescerende
in situ
hybridisering (FISH) [26], kvantitativ PCR [26], [27], [28], [29], [ ,,,0],30], og matrise-CGH [31] stole på fravær av et påvisbart villtype signal [1]. Dette er problematisk når et betydelig antall av normale celler er til stede i en tumorprøve. Array-CGH har potensial til å analysere endringer i DNA-kopiantallet på en genom-bred skala med forholdsvis høy oppløsning, avhengig av om Bacs, PCR-produkter eller oligonukleotider er brukt til oppstillingselementene. Imidlertid er disse teknikker ofte ikke hvor det er en heterogen cellepopulasjon eller prøver av dårlig kvalitet [31]. FISH er mindre utsatt for nærvær av heterogene cellepopulasjoner, men har relativt lav oppløsning og er vanskelig å skalere opp. Bortsett FISH, de andre teknikkene som er nevnt er ikke praktisk for å kartlegge genomiske trans og inversjoner. End-sekvense profilering ble utviklet for å løse dette problemet, men tilnærmingen var kostbart og vanskelig å skalere opp [32]. Derfor er det et behov for å utvikle en skalerbar tilnærming for å detektere slike genomiske strukturelle endringer i faste tumorer hvor heterogene cellepopulasjon er tilstede.
Her vi rapporterer en ny tilnærming, betegnet som Primer Tilnærming Multiplex PCR (PAMP), å anrike små mengder av slettede genomiske DNA-sekvenser i nærvær av villtype-DNA. De genomiske plasseringer av beriket sekvensene blir deretter dekodet av en genomisk flislegging array og bekreftet ved sekvensering.
Resultater
CDKN2A
locus
CDKN2A
ligger på kromosom 9p21 (figur 1). Det koder to proteiner i forskjellige leserammer: p16
INK4A og P14
ARF, som begge har 3 eksoner og aksje eksoner 2 og 3.
CDKN2B plakater (p15
INK4B) og
MTAP
(methylthioadenosine fosforylase) (ikke vist) er centromeric og telomeric nabogener henholdsvis [3], [17], [33], [34]. BAC klone RP11-149I2 inneholder hele
CDKN2A
genomisk fragment og ble brukt som mal for å generere prober (unntatt gjentatte regioner) for utskrift på minigenomic flislegging array. Hyppigheten av repeterende sekvenser spådd av RepeatMasker vises nederst i diagrammet.
genomisk kartet dekker ca 55 kb rundt
CDKN2A
ifølge Ensemble [59].
CDKN2A Twitter /B er plassert på kromosom 9p21 og deres RNA produkter er kodet av det motsatte strand.
CDKN2A
koder 2 proteiner (p16
INK4A og P14
ARF) som deler de samme eksoner 2 og 3. De første eksoner av
INK4A Hotell og
ARF
er ca 20 kb fra hverandre.
CDKN2B
koder p15
INK4B som er homolog til p16
INK4A. I tillegg til transkripsjoner, viser kartet også repeterende sekvenser (Gjenta) og tilgjengelig BAC klone (menneskelig tilepath kloner), RP11-149I2.
Primer Tilnærming Multiplex PCR (PAMP)
det er vanskelig å oppdage en liten brøkdel av slettede mutant genomisk DNA i nærvær av et stort overskudd av villtype DNA med matrisen CGH eller andre populære molekylærbiologiske verktøy [26], [27], [35]. I typisk forurenset tumorprøver, er genomisk DNA består av forskjellige forhold mellom WT og
CDKN2A
mangelfull DNA. Vi forsøkte å dra nytte av det faktum at en kortere slettet genomsekvens bør fortrinnsvis forsterkes sammenlignet med en mye lengre WT-sekvens ved hjelp av «tilnærmet» flankerende primere (figur 2A) [36].
effektiviteten av PCR-amplifisering er omvendt relatert til avstand oppstrøms og nedstrøms primere. I dette eksempel, for å forsterke primere genomiske sekvenser rundt locus av interesse (LOI) er inndelt i 20 grupper: 10 hver for seg (F1-F10) og bakover (R1-R10) grupper (A). Selv om alle av de mulige forover og revers primer-par er for langt fra hverandre for PCR-amplifikasjon i vill-type genomet, er visse par av primere bringes nærmere ( «tilnærmet») på grunn av delesjon (F3 og R3) i mutert genomet. Multiplex PCR-reaksjoner er satt og representert som en matrise for å inkludere en forover og en revers primer gruppe. De forventede PCR Resultatene er vist som grå skala skygger i matrisen (B). Dette eksempelet viser at bare gruppe parene nær bruddpunkt gi PCR-produkter (F3-R3, F3-R4, F4-R3).
Den tilnærmingen er illustrert i figur 2. I dette eksempelet forholdsvis jevn i avstand grunning (gjennomsnitt 1 kb hverandre) som omgir locus av interesse er delt inn i 20 grupper for PCR. Det er 10 grupper hver på forover primere, F1, F2 …, F10 og revers primer R1, R2, …, R10, henholdsvis (figur 2A). Derfor finnes det 100 par (F1-R1, F1-R2, …, F1-R10; F2-R1, F2-R2, …, F2-R10; …;. F10-R1, F10-R2, …, F10- R10) av PCR-reaksjoner (figur 2B). Det er forventet at bare ett eller to par med PCR-reaksjoner vil produsere spesifikke PCR-produkter som spenner over grensedelesjon, siden de andre primerparene bør være for langt fra punktet for effektiv amplifikasjon. Deretter alikvoter fra hver reaksjon kan blandes for å hybridisere med en enkelt genomisk flislegging array. I motsetning til tradisjonelle matrise-CGH, er det forventet at bare flekker som representerer genomiske sekvenser i nærheten av de svake punktene skal teoretisk lyser opp, noe som ble bekreftet i de følgende eksperimenter.
For å kunne øke gjennomstrømningen og redusere kostnadene for reagenser hver fremover (F1-10) og revers (R1-10) primer gruppe kan ha flere primere. Derfor hver PCR-gruppen (for eksempel F1-R1) pair blir multipleks PCR. Derfor har vi utpekt denne prosedyren som Primer Tilnærming Multiplex PCR (PAMP).
Sletting stoppunkt kloning av PAMP og minigenomic flislegging rekke
Vi rapporterte tidligere at Detroit 562 cellelinjen har en omtrentlig 20 kb (inkludert
INK4A
eksoner 1 og 2) sletting på kromosom 9p21 [3]. Vi brukte denne cellelinjen for å teste vår skanning sletting tilnærming. Fire grupper (F
A, F
B, R
Y og R
Z) av primere ble brukt for fire PAMP reaksjoner (figur 3A) ved hjelp av genomisk DNA templat enten fra Detroit 562 (
CDKN2A
mangel) eller HEK293 (
CDKN2A
vill type) cellelinjer. Porsjoner på alle 4 PAMP reaksjonsprodukter ble samlet og merket for hybridisering på en
INK4A
minigenomic flislegging utvalg som dekker ca 25 kb, inkludert alle de eksoner av
INK4A
. Som forutsatt i fig 2, bare flekker med sonder i nærheten av de stoppunkter hybridisert til amplikonene når Detroit 562 genom-DNA ble anvendt som et templat (figur 3B). Nesten ikke noe signal ble detektert når HEK293 genomiske DNA ble anvendt som et templat. Kontroll HEK293 prøven hadde en betydelig høyere signal på Cot-1 DNA flekker til tross for sin generelle absolutte signalintensiteten er lav.
(A) Fem grupper av primere (F
A, F
B, R
X, R
Y og R
Z, de små piler og pilspisser) i nærheten av de potensielle brytningspunkt ble generert for PAMP basert på vår forrige kartlegging [3]. Den kartlagt
CDKN2A
stoppunkter i Detroit 562 cellelinjen (figur 5) er angitt for avklaring. Den «E1», «E2» og «E3» betegnelser (blå fonter) er relative posisjon
INK4A
eksoner. Den første ekson av
ARF
er lenger til høyre i diagrammet, og er ikke omfattet av denne matrisen. Flislegging prober for matrisen, er angitt med to vekslende farger (kort svart og oransje linjer) for enkel identifisering. (B) Den første raden i
INK4A
minigenomic utvalg ble oppdaget med flislegging prober vist i panel A. Cot-1 DNA (repeterende sekvens av genomisk DNA) flekker er angitt på denne matrisen. Resten av plassene er silde sperm DNA. Både Cot-1 og sildesperm-DNA anvendes som ikke-spesifikke kontroller. Denne rekken ble hybridisert med merkede prøver avledet fra to cellelinjer. De samme sett med primere (F
A, F
B, R
Y og R
Z) ble brukt for PAMP reaksjoner på Detroit 562 (mutant) og HEK293 (villtype) genomisk DNA til kartlegge potensielle
CDKN2A
stoppunkter. De amplikonene ble merket med forskjellige fargestoffer, hvilket ga et grønt signal (Cy-3) for mutanten prøven og et rødt signal (Cy-5) for villtype prøven, for å bli samtidig hybridisert på matrisen (to-farge array). De to grønne flekker på første rad avslørt stoppunkt plasseringen som er omtalt i Figur 2.
I tillegg ble fire separate matriser brukes til å hybridisere de enkelte PAMP produktene som er beskrevet ovenfor. En enkel plotting av signalintensitetsforholdet av mutante /WT PCR-produkter på flislegging matrisen avslørte den genomiske plasseringen av stoppunkt (figur 4). Denne analysen viser en meget enkel avlesnings-plasseringen av slettingen er avgrenset av to topper. Bare F
B-R
Y (matrise 27) og alle produkter pooling (matrise 29) gir samme resultat som vist i figur 3. I motsetning til de andre tre par ga bare svake bakgrunnssignaler på oppstillingene. Dette resultatet indikerer at PAMP produkt sammenslåing med en enkelt rekke analyse gir den samme brytningspunktet informasjonen som fire enkelt matriser. Dataene støtter de opprinnelige eksperimentelle spådommer, og tyder på at prosedyren bør være som gjelder generelt for sletting og trans skanning.
Fire grupper (F
A, F
B, R
Y og R
Z) av primere ble brukt til fire PAMP reaksjoner som hver ved sammenkobling av alle mulige forover og revers primer grupper ved hjelp av Detroit 562 (mutant) og HEK293 (kontroll) som maler. Prosedyren er blitt kort beskrevet i figur 3. Produktene ble merket og anvendt for hybridisering matrise: F
A-R
Y for matrisen 25; F
A-R
Z for matrise 26; F
BR
Y for matrise 27 og F
AR
Z for gruppen 28. Prøver av de enkelte PAMP prøvene ble også samlet sammen og merket for matrise hybridisering (matrise 29, sitt utvalg bilder vises i figur 3B). Resultatene er presentert med forholdet mellom signalintensitet (Y-aksen) av prøver fra Detroit 562 (mutant) og HEK293 (kontroll) mot sondens beliggenhet (X-aksen). De svake punktene kan identifiseres gjennom denne tomten ved å finne de to toppene som er analog til den lyse grønne flekker i 3B.
For å finne mer presist området sletting, nestet PCR med par spesifikke primere ble utformet i henhold til de tidligere PAMP resultater. PCR-produktet ble merket for matrisen hybridisering, hvilket ga et resultat meget lik den som er vist i figur 4, og er vist i figur 5A. Videre ble det enkelt hovedproduktet fra PCR-reaksjonene løst ved agarosegel-elektroforese, skåret ut, ekstrahert og sekvensert (figur 5B). Stoppunkt klonet er enige med to andre rapporter (figur 5B) [37], [38].
For å kartlegge nøyaktig stoppunkt, ble en nestet sett PCR primere designet for Uniplex PCR basert på forrige PAMP resultatene (figur 3 og 4). PCR-produktene ble anvendt for merking og hybridisert på matrisen og også for agarose gelelektroforese. Matrisen data er vist som det samme plottet i figur 4. Et enkelt hovedbånd på agarosegelen ble skåret ut og renset for sekvensering (B). Stoppunkt vises (fra # 21975226 til # 21960809 henhold til NCBI menneskelige genom sekvens bygge 36).
For å etterligne heterogen populasjon av kreft og vertsceller som vanligvis finnes i solide tumorer, ulike mengder av genomisk DNA avledet fra Detroit 562 (mutant) og HEK293 (villtype) ble blandet i PAMP og matrise hybridisering. For å teste sensitiviteten av vår tilnærming, utførte vi en titrering eksperiment. Den totalt genomisk DNA for hver analyse ble holdt konstant (100 ng). Dette tilsvarer ca 28 000 eksemplarer av haploide genom (basert på anslag på 2,8 × 10
5 molekyler /mikrogram av haploid genom).
CDKN2A
slettet cellelinje Detroit 562 ble seriefortynnet med
CDKN2A
villtype-HEK293 som vist i tabell 1. Analysen var i stand til å registrere om lag en brytningspunkt-sekvens i nærvær av et ca. 2000 ganger overskudd av vill-type genomet med følsomheten til slike molekyler 5-16 (tabell 1). Således tilveiebringer PAMP tilnærmingen en fremgangsmåte for detektering av genomiske DNA-delesjoner i nærvær av mer enn 99,9% villtype-DNA.
PAMP knekkpunkt kloningsstrategi ble bekreftet i en annen cellelinje. Fordi vår rekke dekker bare 25 kb av genomet, vi skannet vår forrige kartlegging informasjon om 100 cellelinjer for å finne en som kan ha stoppunkter innenfor denne regionen [3], [33]. Den Hs578T brystkreft cellelinje har en delesjon i p16
INK4A eksoner 1-3. Med primere innenfor og telomeric (F
A og R
X-gruppene, Tabell 2) til genomisk fragment, utførte vi PAMP og rekke hybridisering, og identifisert en enkelt flekk på tabellen (vist som en enkel topp i figur 6A). Sekvensen til denne proben er plassert 69971-71219 i RP11-149I2 BAC-sekvensen (GenBank tiltredelse AL449423). Derfor bør den centromeric ende av stoppunkt befinne seg i nærheten av dette området. Uniplex PCR med primere fra de to grupper for PAMP ble utført for sekvensering. Et PCR-produkt på 2 kb ble dannet med et par av primere og ble utsatt for direkte sekvensering (figur 6B). Den centromeric ende av stoppunkt identifisert av PAMP er i samsvar med en tidligere rapport [37]. Den telomeric slutten av stoppunkt ble utledes fra primere som brukes for PAMP og også bekreftet ved direkte sekvensering, selv om det var ingen genomisk sonde nær stoppunkt som ble inkludert på tabellen
To grupper av primere:. F
A (F
A1-F
A4) og R
X (R
X1-R
X5) ble brukt for PAMP basert på vår forrige kartlegging. Produktet ble merket for matrisen hybridisering (A). Bare enkelt topp er tydelig fra plottet. Det indikerer plasseringen av de andre stoppunkt er ikke omfattet av denne minigenomic array. To primere (R
X3 og R
X4) som befinner seg nær den genomiske plasseringen av sonden (humane kromosom 9, 21969229 til 21970477, NCBI bygge 36) som ble hybridisert og to primere (F
A1 og F
A2) som befinner seg utenfor matrisen deknings ble valgt for Uniplex PCR. F
A2-R
X3 pair forventes å ha den korteste avstand når en sletting skjer. Et bånd på omtrent 2 kb for agarosegel ble skåret ut fra gelen, renset og sekvensert (B). Stoppunkt og plassering er indikert (fra # 21955827 til # 21968338 henhold til NCBI menneskelige genom sekvens bygge 36).
Diskusjoner
Vi har utviklet en generell strategi som kan brukes for å påpeke de genomiske stoppunkter i urensede primære kreft. Forsterkning og flislegging protokollen beskrevet her gir mulighet for enkel og presis
CDKN2A
stoppunkt kloning, forurenset DNA som en mal. I motsetning til nåværende tilgjengelige teknikker for kartlegging delesjon (inkludert Southern blotting, fluorescerende
in situ hybridisering
, sanntid PCR, og matrisen CGH) som er avhengige av fravær av et påvisbart signal villtype, PAMP direkte måler slettet DNA. Derfor er denne tilnærmingen mye mindre utsatt for problemer i forbindelse med normal celle-forurensning. Den eksperimentelle prosedyren er robust nok til å oppdage delesjoner i nærvær av minst 99,9% villtypesekvensen forurensning, noe som ikke kan oppnås ved andre fremgangsmåter [3], [5], [26], [27], [28], [33], [35], [39].
Primer tilnærming PCR-screening har vært et nyttig verktøy for å isolere delesjonsmutanter i
C. elegans product: [36]. Fremgangsmåten baserer seg på å identifisere et enkelt bånd som er et produkt av en vellykket PCR-reaksjon når et par av spesifikke primere er brakt sammen ved delesjon, på en agarosegel. Fremgangsmåten kan bare identifisere slettinger som skjer i en meget liten genomisk fragment (3 kb) i en forholdsvis liten produksjon måte. Den lider også av relativt høye falske positive fordi identiteten av båndene på agarosegel er vanskelig å vite. Imidlertid, ved å anvende multipleks PCR sammen med en genomisk flislegging matrise, kan man samtidig screene et bredere spekter av genomiske regioner [40]. I tillegg fortrinnsrett forsterkning av sekvensene nær stoppunkter genererer en relativt grei avlesning på flislegging array. Signal til støyforhold på hybridiserte flekker er innlysende sammenlignet med avlesning fra matrisen CGH (se figur 4). Krysset lett kan identifiseres så lenge den ene ende av den nærliggende genomisk plasseringen av de svake punktene er dekket av flislegging matrise, som vist i tilfellet med Hs578T brystkreftceller (figur 6). Siden høy tetthet genomiske flislegging arrays er kommersielt tilgjengelig, kan denne tilnærmingen være lett vedtatt. I tillegg kan high-throughput genom sekvenseringsteknologi også finne den nøyaktige sekvensen stoppunkt etter PAMP, omgå behovet for matrisen hybridisering [41], [42], [43].
Vi brukte multipleks PCR for å redusere arbeidsmengde og kostnad for PAMP. Vi var i stand til å multiplekse 28 primere enkelt i en enkelt PCR-reaksjon. Teoretisk kan man dekke mer enn 90% av 0,5 Mb genomisk fragment rundt
CDKN2A
locus med totalt 500 primere i en enkelt PCR-reaksjon via beregnings simulering, som vil bli beskrevet andre steder (manuskript submitted). En fersk papir rapporterte en vellykket multipleks PCR med mer enn 1000 primerpar gjennom ved hjelp av beregnings utforming [44]. Den PAMP tilnærming rettet mot sletting størrelser mellom 10 kb og 1 Mb. De mindre eller større slettinger kan oppdages ved henholdsvis resequencing og FISH.
Som andre PCR-teknologi, kan PAMP lett bli adoptert til et robotsystem for klinisk og forskningsformål. Et eksempel på en potensiell klinisk anvendelse er å benytte den unike stoppunkt sekvens som en personlig cancer-spesifikk biomarkør for sykdomsovervåkning etter behandling, da den nøyaktige bruddpunkt er blitt kartlagt. For eksempel, i motsetning til mange nåværende tumormarkører, slik som CA19-9, CA 125 og PSA, som ikke er virkelig cancer-spesifikke,
CDKN2A
svake punktene er spesifikke og unik for hver kreft med dette locus slettet. En meget følsom analyse, slik som sanntids-PCR, kan være konstruert for å overvåke statusen for kreft progresjon i blod eller andre kroppsvæsker. Analysen, skal være meget spesifikk fordi forsterkning er forventet å skje kun fra delesjon-inneholdende DNA på grunn av svært lang avstand mellom primerne i villtype-genomet (se figur 2). Dette er analogt til deteksjon av et fremmed virus-sekvens, som er blitt påført som et nyttig biomarkør for Epstein-Barr-virus forbundet nasofaryngeal karsinom [45], [46].
Vår fremgangsmåte kan også lette benyttet tradisjonelle arbeids intensive eksperimenter som tar sikte på å forstå hvordan genomisk stoppunkter genereres under kreftutvikling, spesielt i primære svulster. Selv om illegitim V (D) J rekombinasjon kan være ansvarlig for å lage
CDKN2A
slettinger i akutt lymfatisk leukemi, flere stoppunkt sekvensdata vil være behov for andre typer kreft å avgrense de molekylære mekanismene [37], [38] , [47], [48]. Videre kan den teknikk som er beskrevet i dette dokumentet kan brukes ikke bare for kartlegging sletting, men det kan også anvendes til å kartlegge andre typer av genomisk omleiring, slik som translokasjoner og inversjoner. I likhet med tilfellet av genomisk sletting (se figur 2), bare «rundet» primere kan generere amplikonene når disse primere er i nærheten av genomiske fragmenter som blir omplasserte i trans og inversjoner.
Ved hjelp av stoppunkt sekvenser som kreftspesifikk biomarkører for å overvåke minimale gjenværende sykdommer er blitt undersøkt [49], [50], [51], [52], [53]. Sykdomsovervåkning på grunnlag av personlig genomisk DNA stoppunkt er ansett for å være svært attraktiv metode av flere grunner [49]. For det første er mange genomiske DNA-rearrangementer direkte relatert til onkogene prosess, derfor, er virkelig cancer-spesifikk og stabil over tid. Dette er i motsetning til mer praktisk lg /TCR-omleiring basert assay. Ja, vi fant akkurat det samme
CDKN2A
stoppunkter i de to cellelinjer brukt i denne studien som rapportert av andre. For det andre er den DNA-mer stabil enn RNA, selv om det er lettere å kartlegge fusjons transkripsjon hvis den eksisterer, for eksempel
BCR-ABL
. Tredje, genomiske stoppunkter er svært sannsynlig å være forskjellig fra hver pasient og bli personlig biomarkører, og dermed redusere risikoen for falske positive resultater på grunn av smitteoverføring. Men dette er også det største hinderet for å overvinne. For eksempel, mange anstrengelser for å forbedre PCR forsterkning området for å oppdage
C-MYC Twitter /immunglobulin trans har hatt begrenset suksess fordi de svake punktene er spredt over et mer enn 300 kb region [54], [55], [ ,,,0],56]. Vår strategi kan være nyttig for en slik søknad.
Vår tilnærming tar sikte på å identifisere svake punktene i en 1 Mb genomisk fragment som fisk eller andre cytogenetiske teknikker er tilgjengelig for større genomiske rearrangements og kostnadene og arbeidskraft øke når målområdet utvides. Vi er i stand til å billig produsere en flislegging utvalg som dekker et genomisk fragment på 0,5 Mb rundt
CDKN2A
med en kb oppløsning. Vi jobber for tiden med metoder for å øke multipleksing og redusere volumet av hver PAMP reaksjon for bredere anvendelse.
Materialer og metoder
Cell kultur og prøveopparbeidelse
cellelinjer beskrevet i artikkelen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket som anbefalt. Den genomisk DNA ble ekstrahert med DNAzol (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) følge instruksjonene fra produsenten.
Minigenomic flislegging rekke
Vi har opprettet en
INK4A
minigenomic flislegging utvalg som dekker et 25 kb fragment i
CDKN2A
locus for å bevise konseptet med vår tilnærming. DNA-prober ble generert ved PCR med BAC klone RP11-149I2 (hentet fra BacPac Resources Center ved Children Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA) som mal og unngå repetitive genomiske sekvenser som ble spådd av RepeatMasker. PCR-produktene ble renset med DNA Opprydding og konsentrator-5 (Zymo Research, Orange, CA), suspendert i 3 x SSC og skrives ut på poly-L-lysin lysbilder på 0,1 mg /ml sammen med menneskelig Cot-1 DNA ( Invitrogen, Carlsbad, CA), som er anriket for repeterende sekvenser, og sildesperm-DNA (Promega, Madison, WI), som ble anvendt som ikke-spesifikk kontroll. Utskriftsprosedyren har blitt beskrevet og i hovedsak fulgt bruksanvisningen til DeRisi arrayer med silisium mikro utskrift pins (parallell syntese Technologies, Inc. Santa Clara, California) [57], [58]. Matriser ble etter behandlet med ravsyreanhydrid-basert fremgangsmåte for å blokkere før hybridisering som tidligere beskrevet [57]. Dens protokoller rekke trykking og hybridisering i dette papiret vanligvis kan finnes i microarrays.org (https://derisilab.ucsf.edu/microarray/protocols.html).
Primer-Tilnærming Multiplex PCR (PAMP ) og rekke hybridisering
En forenklet PAMP ordningen er vist i figur 2. En rekke primere (tabell 2) mot
INK4A
eksoner 1-2 langs
CDKN2A
locus ble syntetisert ved Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Grupper av forover og revers primere (250 nM hver i den endelige reaksjons) ble anvendt for å danne amplikonene fra 0,1 ug av genomiske DNA-templater i totalt 10 pl oppløsning blandes med 10 ul Taq 2 x Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA). Reaksjonen ble samlet ved 4 ° C i en PCR-arbeidsstasjon og overført til en termosykler med blokken forvarmet til 94 ° C. Syklusbetingelsene var en 3-minutters denatureringstrinn ved 94 ° C etterfulgt av 35 sykluser ved 92 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sekunder og 68 ° C i 2,5 minutter med en avsluttende forlengelsestrinn ved 68 ° C i fem minutter. En ul av urenset produkt ble deretter anvendt som templater for en ny runde av amplifisering å merke amplikoner med den samme PCR-protokoll, bortsett fra at dTTP ble erstattet med en 04:01 blanding av aminoallyl dUTP (Ambion, Austin, TX) og dTTP for sonde merking . De merkede amplikonene ble renset med DNA Opprydding og konsentrator-5 kolonner, eluert i 9 mL av natrium bikarbonat (pH 9,0) og kombinert med 1 mL av DMSO oppløst Cy3 eller Cy5 NHS estere (GE Healthcare, Piscataway, NJ) for 30 60 minutter. Den Cy3 Cy5 og merket amplikonene ble renset med DNA Clean-up og konsentrator-5 kolonner og eluert med 10 ul av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Sammenkoblet Cy3 Cy5 og merket amplikonene ble kombinert med 3,6 ul 20 x SSC, 0,5 ul Hepes (pH 7,0) og til slutt 0,5 ul 10% SDS. Den blandede oppløsning ble oppvarmet i 2 minutter ved 95 ° C, avkjølt til romtemperatur og hybridisert til de minigenomic flislegging arrays ved 63 ° C over natten i det vesentlige som tidligere beskrevet [57], [58]. De hybridiserte arrays ble vasket og skannet med GenePix 4000B scanner (Molecular Device, Sunnyvale, CA) og analysert ved GenePix Pro 6.0-programvare.
Flislegging tabellens dataanalyse
Den menneskelige Cot-1 DNA og sildesperm-DNA ble laget for å være positive og negative kontroller henholdsvis og flekket flere ganger på matrisen (se figur 3). Å normalisere for dag-til-dag og prøve å sample variasjon, var median intensitet av alle funksjoner som representerer silde sperm DNA (
I
50% -HS
) brukes til å dele intensitet (
i
G
) for hver funksjon representerer genomiske sonder. Hver (
I
G
): (
I
50% -HS
) forhold, den normaliserte genomiske proben signal ble plottet på Y-aksen mot den tilsvarende sondens genomisk plassering på X-aksen for å lette tolking (se figur 4).
CDKN2A
stoppunkt kloning
for å bekrefte
CDKN2A
stoppunkt kartlegging av PAMP tilnærming, genomiske fragmenter flankerer de svake punktene ble klonet ved tradisjonell PCR tilnærminger veiledet av resultatene fra PAMP. To eksempler er gitt i denne artikkelen
Detroit 562 cellelinje
. Den nestede tilnærming ble brukt til å klone
CDKN2A
stoppunkt i Detroit 562 mennesker epithelial carcinoma celler. Primerne ble utformet med spor fra PAMP forsøket (se figur 3 og 4). Eksterne primere (AGGTTTGGTTAAGAGTCGTTC og AAGATCTATATGGTGGCCTTTAG) ble anvendt for 35 sykluser med PCR (92 ° C, 30 sekunder; 55 ° C, 30 sekunder; 68 ° C, 2 minutter).
