Abstract
metastatisk progresjon er en flertrinnsprosess som involverer tumorvekst og overlevelse, motilitet og invasjon og påfølgende spredning i en upassende miljø. Src protein tyrosin kinase har vært innblandet i mange av de biokjemiske mekanismer som driver disse atferd. Selv Src i seg selv er bare sjelden mutert i humane tumorer, har sin avvikende aktivitet er registrert i ulike kreftformer og foreslo å tjene som et barometer for metastatisk potensial. Med disse funksjonene i tankene, undersøkte vi Src kinase regulering på det strukturelle, enzymatisk og uttrykk nivåer som en funksjon av progressivt invasive prostata kreft cellelinjer. Overraskende, både totalt Src innhold og kinase aktivitet reduseres med økende cellelinje aggressivitet, en observasjon som ser ut til å være uforenlig med veldokumentert rolle Src i signalveier som driver vekst og invasjon. Men vi ser en direkte sammenheng mellom Src kinase
spesifikk aktivitet plakater (total Src kinase aktivitet /total Src innhold) og metastatisk aggressivitet, muligens tyder på at det i svært aggressive cellelinjer er viktige signal enzymer globalt rekruttert til å kjøre kreft fenotype. I tillegg, selv om forventet økt fosforylering av Src ved Tyr-416 (aktivering stedet) er til stede i de mest aggressive prostatakreft cellelinjer, blir uventet høye fosforylering nivåer ved Tyr-527 hemmende stedet observerte også. Sistnevnte, snarere enn representant for hemmet enzym, er mer en indikasjon på primet Src lydhør overfor lokale fosforylerte bindingspartnere
Citation. Xu W, Allbritton N, Lawrence DS (2012) Src Kinase forordning i Progressivt invasiv kreft. PLoS ONE 7 (11): e48867. doi: 10,1371 /journal.pone.0048867
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 20 juni 2012; Godkjent: 01.10.2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gi 5R01CA140173 til DSL. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Src protein kinase er grunnleggerne av Src kinase familien av nonreceptor protein tyrosin kinaser. Den katalytiske aktivitet av disse enzymene er regulert, delvis via fosforylering [1]. Nærmere bestemt er full aktivering av Src-avhengig fosforylering ved Tyr-416. I motsetning til dette inhiberer Tyr-527 fosforylering katalytiske aktivitet, ved å fremme en intramolekylær interaksjon med enzymets SH2 (og SH3) domener. Faktisk, nivået av fosforylert Tyr-527, som vist ved Western blot-analyse eller farging, blir ofte tatt som et mål på inaktivt enzym. For eksempel ble Src kinase aktivitet rapporteres å være oppregulert i hormon-ildfast prostatakreft som vurderes av fosforylert Tyr-416 innhold [2]. Men denne tolkningen nervøs med fare. Selv om lave
in vitro
katalytiske aktiviteten til pTyr-527 Src er udiskutabel, er den tilsvarende aktivitet av det samme enzym i et biologisk miljø mindre sikker. Ved samspillet mellom SH2-SH3 eller domener av Src enzym med andre proteiner, blir den inhiberende pTyr-527 rest frigjøres, noe som genererer fullstendig aktiv pTyr-527 Src [3] – [5]. Faktisk er denne prosessen rekapitulert av korte Ptyr-inneholdende peptider som, ved binding til Src s SH2 domene, forstyrrer den intramolekylære hemmende pTyr-527 interaksjon og derved aktiverer kinase-aktivitet [6] – [8]. Følgelig er pTyr-527 status ikke nødvendigvis en indikasjon på et inhibert enzym
per se
, men snarere av et enzym som er potensielt primet og klar til å bli «slått på» ved samvirke med en passende tilbehør protein. Kort sagt, kan høye pTyr-527 Src nivåer representerer hemmet enzym, aktiveres enzymet, eller noen variant i mellom. Denne usikkerheten understreker behovet for å prøve Src kinase
direkte
via sin evne til å fosforylere et mål substrat. I tillegg til fosforylering, er Src kinase regulert på proteinnivået via ubiquitinering og således nedbrytning ved proteasom-mediert reaksjonsvei [9]. Følgelig, mye på samme måte som fosforylering status er en tvilsom budbringer av kinase aktivitet, mRNA nivåene er ikke nødvendigvis en indikasjon på Src kinase innhold eller aktivitet.
Src er sterkt innblandet i de banene som styrer mange av de karakteristiske celle atferd som er ansvarlige for tumorinvasjon og progresjon. For eksempel medierer Src adhesjon og cytoskjelett dynamikk og derved kontrollerer cellevandring [10], [11]. Invasiv migrasjon er utvidet med en Src-avhengig epitelial-mesenkymale overgang [12] og aktivering av matriks-nedbrytende proteaser [13] – [16]. Src fosforylering av kaspase 8 er antiapoptotic [17], mens Src-mediert STAT-aktivering fremmer cellevekst og overlevelse [9]. Kort sagt, er Src innblandet i en mengde stier som er oppregulert i mange av de mest aggressive og invasive kreftformer. Men siden Src er bare sjelden mutert i humane tumorer, er avvikende Src oppførsel oftest en konsekvens av dens unormal regulering. Vi har undersøkt Src kinase regulering på de strukturelle, katalytiske og uttrykk nivåer på tvers av en plattform av prostata kreft cellelinjer som varierer i oppførsel fra ikke-invasiv til meget inngripende og fra androgen-avhengige til androgen-uavhengig. Overraskende, fant vi at Src katalytisk aktivitet og proteinnivå er betydelig redusert i de mest aggressive cellelinjer. I motsetning til disse aggressive cellelinjer vil vise høy Src spesifikk aktivitet og forbedrede nivåer av fosforylering ved Tyr-527 (den såkalte hemmende stedet) i forhold til deres mindre aggressive motstykker. Disse resultatene er diskutert i forbindelse med mekanismen for Src-aktivitet i sterkt formerende miljøer.
Resultatene
design og syntese av Src-kinase-sensor
basert, delvis, på en Src substrat sekvens identifisert fra en orientert peptid-bibliotek [18], konstruerte vi det fluorofor-merkede sekvens: 5-FAM-Orn (Ac) -Glu-Glu-Glu-Ile-Tyr-Gly-Glu-Phe-Orn ( ac) amid (1), hvor Tyr er stedet for fosforylering. I tillegg ble ornitin (Orn) rester plassert på hver terminale ende av peptidet sekvensen, i det tilfelle at peptidet viste seg å vise dårlig selektivitet for Src-versus andre proteinkinaser. Vi har tidligere vist at sidekjede modifisering av aktive seterettet peptider med unaturlige substituenter kan dramatisk forbedre selektiviteten for målet protein kinase (
vide infra
) [19] – [25]. Både de ikke-fosforylert, og de fosforylerte formene [5-FAM-Orn (Ac) -Glu-Glu-Glu-Ile-pTyr-Gly-Glu-Phe-Orn (Ac) -amid (2)] av peptidet ble fremstilt via fastfase peptidsyntese. 5-FAM (5-karboksyfluorescein) ble valgt som fluoroforen for substrat og produkt påvisning av LIF.
separering av den ikke-fosforylert substrat og det fosforylerte produktet ved CE-LIF er vist i fig. 1A. En 01:01 blanding av peptidene ble lastet inn i kapillaren. Under separasjons betingelser som er beskrevet i Materialer og Metoder, substratpeptid en kommer ut ved 240 sek, mens det fosforylerte produktet 2 vises ved 290 sek. Vekst av den sistnevnte ble overvåket som en funksjon av tid, ved inkubering av substratet (1) med aktivt Src-kinase. Den 290 sek Toppen ble bekreftet å være den fosforylerte produktet ved å tilsette med syntetisk fosfo-peptid 2. Kinetikken for fosforylering ble oppnådd ved å evaluere innsamlede tidspunkt prøvene via CE-LIF og kvantifisere graden av fosforylering ved å integrere de enkelte topper. Peptide en fosforylering er i det vesentlige fullstendig i løpet av 3 minutter under de analysebetingelser som anvendes ren Src enzym (Fig. 1B). I motsetning følgende eksperimenter i cellelysatene (
vide infra
) fortsette på et mer bedagelig tempo. I det sistnevnte tilfelle innledende sats kinetikk ( 10% peptid-fosforylering) ble kjøpt i løpet av 10 min av cellelysat inkubering
(a) CE-LIF separasjon og visualisering av Src-peptid-substratet 1 og dens kjemisk. syntetisert, fosforylert motstykke 2. (b) Src kinase-katalyserte fosforylering av peptid 1, som en funksjon av tiden vurdert ved CE-LIF.
Stabilitet av Src-kinase-peptidsubstratet en i prostata cellelysater
peptider ofte lide protease-katalyserte nedbrytning i celler så vel som i cellelysatene. Følgelig, før undersøke Src kinase-katalyserte fosforylering av peptid 1 med lysater, overvåket vi stabiliteten av peptidet som en funksjon av tid. Celler ble lysert ved hjelp av Pierce M-PER pattedyr lyseringsbuffer og, i fravær av ATP og Mg
2+ (dvs. ingen observerbar kinaseaktivitet), lysatet ble tilsatt til peptid 1. Kun omtrent 10% av peptidet blir degradert etter 1 time (tabell S1). Siden fosforyleringen er målt innen 10 min av inkubasjon (Fig. S1), er peptid tilstrekkelig stabil for våre behov.
Vurdering av Src Aktiviteten i prostata cellelinje Lysates
Våre innledende studier fokusert på de ikke-invasive immortaliserte normal prostata epiteliale cellelinjer PZ-HPV-7 og RWPE1 og de svært invasive Cap cellelinjer DU145 og PC3. Vi undersøkte også Src-aktivitet i den ikke-metastatisk CWR22Rv1 cellelinje som oppviser androgen-uavhengig vekst, en karakteristisk oppførsel av avansert stadium hetten [26] korrelert med Src kinase [2]. Vi vurderte de innledende rente kinetikk (dvs. 10% av produktdannelse) av peptid fosforylering (Fig. S1) og ble overrasket over å finne at Src kinase aktivitet (som funksjon av total protein ekstrakt beløp) er betydelig lavere i aggressiv prostatakreft cellelinjer (CWR22Rv1, DU145 og PC3) enn de ikke-kreft prostata cellelinjer (PZ-HPV-7 og RWPE1) (figur 2. grå søyler; P 0,001). Denne generelle trenden er i strid med den generelle oppfatningen at høy Src aktivitet korrelerer med prostata cellelinje aggressivitet (dvs. invasive atferd og androgen-uavhengig vekst). Tidligere rapporter har konstatert at høye nivåer av pTyr-416 er til stede i de mest aggressive caps og det har vært antatt, gjennom litteraturen, som pTyr-416 og Src aktivitet direkte korrelerer med hverandre. En mulig konklusjon avledet fra våre data er at allment aksepterte oppfatningen at pTyr-416 nivåer tjene som et barometer for Src aktivitet er defekt. Men undersøkte vi om det kan være alternative forklaringer på det uventede forholdet mellom Src aktivitet og cellelinje aggressivitet. En mulighet er at den Src substratet 1 blir fosforylert av andre protein tyrosin-kinaser og derved gjøre den tilsynelatende omvendt forhold mellom Src-aktivitet og celle aggressivitet misvisende.
Grey stolpene er fosforylering forekomst av peptid 1 av helcellelysater (normalisert etter totalt protein ekstrakt beløp). Hvite barer er fosforylering priser ved cellelysatene på grunn av Src kinase alene etter trekke non-Src bakgrunn fosforylering av 1. Sammenligning mellom ikke-kreft (PZ-HPV-7, RPWE1) og aggressive kreftcellelinjer (CWR22Rv1, DU145, PC3) viste betydelig reduserte nivåer av Src-kinase-aktivitet forbundet med den senere (p 0,001). Alle forsøkene ble utført i det minste i tre eksemplarer. Feil barer er SEM.
Vurdering av selektivitet Peptide en for Src i Prostata cellelinjer
Vi undersøkte Src-selektivitet av en bruker cap cellelysater utarmet av Src (Fig . S2). Selv om Src-frie cellelysater er i stand til å fosforylere peptid 1, gjør de det til en mye mindre grad ( 30%) enn med hele cellelysater inneholdende Src (figur 2, hvite striper.). De kontaminerende tyrosinkinaser som kan være ansvarlig for den lave nivå av peptid 1 fosforylering i fravær av Src kan være en eller flere av de åtte andre medlemmer av Src-familie kinaser (SFK). Faktisk er flere SFK familiemedlemmer, for eksempel Fyn, Brk, Lyn Lek og Ja kjent for å presentere i prostata cellelinjer [27]. Ikke desto mindre, gitt den relativt beskjedent nivå av peptid 1 fosforylering av Src-fri lysater, bestemte vi oss at peptid 1 er, for vårt nåværende behov, tilstrekkelig Src selektiv.
Vi vurderte også muligheten av Src-peptid 1 /CE-LIF-metoden for å påvise Src-aktivitet ved anvendelse av en kombinasjon av to kjente Src-inhibitorer. Imatinib (markedsført som Glivec), som brukes til behandling av kronisk myelogen leukemi og andre kreftformer, er en Abl-selektiv inhibitor med viste svak anti-Src-aktivitet. Imatinib blokker kinase aktivitet ved å fungere som en kompetitiv hemmer av ATP. Som imatinib, saracatinib (AZD0530) er en kompetitiv hemmer av ATP, men viser en høy selektivitet og robust styrke for Src. For eksempel
IC
50 verdier av imatinib og saracatinib med isolert Src enzym er 24,4 mikrometer [28] og henholdsvis 2,7 nM [29],. Bruke DU145 cellelysatene, fant vi at de potente Src inhibitor saracatinib blokker peptid 1 fosforylering med en submicromolar
IC
50 (0,35 ± 0,08 mm), mens det tilsvarende dårlig Src hemmer imatinib viser en
IC
50 som er i overkant av 100 uM (fig. S3). Disse resultatene er i samsvar med oppfatningen, eksemplifisert ved Src utarming eksperimenter som Src peptid 1 /CE-LIF metoden fungerer som en effektiv og selektiv Src aktivitetsregistrering modalitet. Src kinase aktivitet ble også vurdert i levende enkeltceller, både i fravær og nærvær av imatinib og saracatinib (Fig. S3).
Src uttrykk nivåer og Fosforylering Status i Prostata cellelinjer
src aktivitet er høyere i ikke-aggressive cellelinjer og lavere i aggressive cellelinjer (fig. 2), som er uforenlig med den generelle oppfatningen at Src spiller en sentral rolle i kreftutvikling, metastaser, og overgangen til androgen-uavhengig stat. Imidlertid slo det oss at total Src innhold kan variere fra en cellelinje til den neste, som kan den tilsynelatende (men misvisende) invers sammenheng mellom Src aktivitet og Cap aggressivitet.
Src innhold ble kvantifisert ved western blot analyse (fig. 3A) og normalisert i forhold til a-tubulin. Vi fant at invasive cellelinjer, så vel som den androgen-uavhengig cellelinje, viser mindre Src enn den tilsvarende ikke-invasiv, androgen-avhengige cellelinjer (figur 3B, s . 0,001). Med disse dataene i hånden, vi plottet senere Src-spesifikk aktivitet (det vil si total Src-aktivitet /totalt Src-innhold) versus cellelinje aggressivitet. Sistnevnte viser Src-spesifikk aktivitet er vesentlig høyere i aggressive cellelinjer (CWR22Rv1, DU145, PC3) enn i ikke-aggressive /normal cellelinjer (PZ-HPV-7, RWPE1) (Fig. 4, p = 0,0015).
(a) prostata cellelysater ble analysert for total Src, pY416 Src og pY527 Src, hvor α-tubulin ble benyttet som kontroll lasting. (B) intensiteter av hvert bånd fra Western blots ble målt og normalisert til den tilsvarende α-tubulin kontroll, og deretter sammenlignet med cellelinje RWPE1 (RWPE1 som 1). Sammenligning mellom ikke-kreft (PZ-HPV-7, RPWE1) og aggressive kreftcellelinjer (CWR22Rv1, DU145, PC3) viste betydelige reduserte nivåer av Src uttrykk i den sistnevnte (p 0,001). Dataene er representative for minst tre uavhengige forsøk og er gjennomsnitt med SEM.
Src-kinase-spesifikk aktivitet ble beregnet ved å dividere Src-aktivitet (Fig. 2) ved total Src-protein-innhold (fig. 3). Src-spesifikk aktivitet er vesentlig høyere i aggressive enn i ikke-cancercellelinjer (P 0,0001). Feil barer er SEM.
Vi undersøkte også hva forholdet, om noen, eksisterer mellom nivåene av pTyr-416 og pTyr-527 Src og Src spesifikk aktivitet. Fosforylering ved 416 er nødvendig for full aktivering av Src-aktivitet, mens fosforylering ved Tyr-527 er hemmende på grunn av dannelsen av en intramolekylær interaksjon som blokkerer Src-kinase-aktivitet [1]. Ptyr-416 fraksjonelle nivåer (pTyr-416 /total Src-innhold) (fig. 5A) er sterkt korrelert med spesifikk Src-aktivitet (Fig. 4) (r = 0,89), noe som tyder på at pTyr-416 innhold er en god barometer for Src-aktivitet og aggressivitet cellelinje (fig. 5A). Men, som nevnt nedenfor, denne sammenhengen omfatter ikke alle cellelinjer. I motsetning til dette er pTyr-527-innhold, en antatt indikator på inhiberte Src, mer uttalt i aggressive cellelinjer (Fig. 5B). Denne observasjonen er i strid med den generelle oppfatningen at aktivert Src korrelerer med cellelinje aggressivitet. Kort sagt, fosforyleringen status av Tyr-416 og Tyr-527, tatt sammen, ikke får det samme bilde av Src-aktivitet over en rekke Cap cellelinjer.
(a) pY416 nivåer ble avledet fra bandet intensiteter i de vestlige blotter (fig. 3a), normalisert til den tilsvarende α-tubulin kontroll, og deretter sammenlignet med cellelinje RWPE1 (RWPE1 som en). (B) pY527 nivåer ble utledet fra de båndintensitetene i Western blot (Fig. 3A), normalisert til den tilsvarende α-tubulin kontroll, og deretter sammenlignet med cellelinje RWPE1 (RWPE1 som 1). Dataene er representative for minst tre uavhengige forsøk og er presentert som gjennomsnitt med SEM. p-verdiene er angitt.
Src aktivitet, uttrykk nivåer, og Fosforylering Status i RWPE1-Avledet prostata cellelinjer
I tillegg til standard prostata cellelinjer evaluert i fig. 2, 3, 4, og 5, evaluerte vi en serie med cellelinjer som ble oppnådd ved eksponering av RWPE1 til N-metyl-N-nitrosourea. Cellelinjer med økende invasivitet har blitt identifisert via en rekke
in vitro Hotell og
in vivo
utvalgs eksperimenter: RWPE1, WPE1-NA22, WPE1-NB14, WPE1-NB11 og WPE1-NB26 [ ,,,0],30]. Denne serien viser Src-kinase-aktivitet og aggressivitet korrelasjoner analoge med de som er beskrevet ovenfor for de vanlige prostata cellelinjer. Først, viser total Src-aktivitet en vesentlig avtagende tendens (p = 0,018) som en funksjon av økende aggressivitet cellelinje (Fig. 6A). For det andre, med unntak av WPE1-NB26, total Src innhold også lineært minsker (p = 0.01) som en funksjon av cellelinje aggressivitet (fig. 6B og S5 fig.). For det tredje, igjen med unntak av WPE1-NB26, spesifikk Src-kinase-aktivitet (Src-kinase-aktivitet /totalt Src innhold) viser en signifikant lineær økende tendens (p 0,001) som en funksjon av økende cellelinje aggressivitet (figur 6C.). Til slutt, i skarp kontrast til resultatene som vises i fig. 5A, er svak korrelasjon mellom pTyr-416 brøk nivåer (Ptyr-416 /totalt Src innhold) og Src spesifikk aktivitet (r = 0,58), noe som tyder på at det er farlig å utelukkende stole på pTyr-416 innhold som et barometer for Src aktivitet (fig. 6D). Interessant nok har vi observere en meget sterk sammenheng med hensyn til fraksjons pTyr527 innhold og spesifikk Src-aktivitet i RWPE1 rekke cellelinjer (Fig. S6, r = 0,99), tilsvarende som i fig. 5B (r = 0,88).
Økende invasive egenskaper er plottet langs x-aksen. (A) Grey barer er fosforylering priser av peptid 1 av helcellelysater (normalisert etter totale proteininnhold). Hvite striper er fosforylering frekvenser etter cellelysatene på grunn av Src-kinase alene etter å subtrahere ikke-Src bakgrunn fosforylering av 1. (b) Sum Src-innhold som bestemt ved western blot-analyse (Fig. S5) (c) Src-kinase-spesifikk aktivitet som bestemt ved målte Src-aktivitet (fig. 6A) delt total Src-protein-innhold (fig. 6B). (D) pY416 nivåer ble avledet fra bandet intensiteter i de vestlige blotter (Fig. S4), normalisert til tilsvarende α-tubulin kontroll, og deretter sammenlignet med cellelinje RWPE1 (RWPE1 som en). Dataene er representative for minst tre uavhengige forsøk og er vist som gjennomsnitt med SEM.
Diskusjoner
Generic ELISA- [31] og γ-
32P-ATP-baserte [32] metoder er to av de mest vanlige strategier som brukes for å vurdere aktivitet med ren enzym under
in vitro
forhold. I tillegg fluoroforen-merkede peptider [33] – [37], så vel som GFP-baserte proteiner [38], [39], er blitt beskrevet som oppviser en fluoriserende respons på fosforylering, for derved å tillate Src kinase-aktivitet til å være kontinuerlig samplet i levende celler via fluorescerende mikroskopi. Selv om disse teknologiene skaffe et vindu i det biokjemiske grunnlag av celle oppførsel, er de mindre lett omregnes til en rutine, kryssplattform metodikk (rent enzym, cellelysater, og intakte celler) som også kan anvendes på et begrenset antall av primære celler tilgjengelig i pasientprøver. I denne forbindelse er CE en ultra metode ved hvilken små mengder analytter separert og kvantifisert, via anvendelse av et elektrisk felt og påfølgende påvisning av analytter [40]. Siden Src kinase katalyserer overføringen av γ-fosforyl gruppe fra ATP til en tyrosinrest til substratet, ladningsforskjellen mellom substrat og produkt bør aktivere disse artene som skal separeres, visualisert og kvantifisert via et skift i elektroforetisk mobilitet [41 ] – [43]. Faktisk er det fluorescein-substituerte Src substrat 1 og dens fosforylerte motstykke lett differensieres ved å utsettes for både i ren Src kinase (fig. 1) og prostata cellelysatene (fig. 2). I det sistnevnte tilfelle, i nesten alle cellelinjer, de aller fleste av observerte fosfotransferase-aktivitet (mer enn 70%) er på grunn av Src-kinase (Fig. 2.). CE-analysen ble ytterligere bekreftet ved å undersøke Src hemmende styrken av saracatinib og imatinib, hvor sistnevnte er fire størrelsesordener svakere (
IC
50 = 24,4 mm) enn tidligere (
IC
50 = 2,7 nM) mot rent enzym [28], [29]. I samsvar med disse resultatene, ble det observert en forskjell i inhibitorisk potens mellom saracatinib (
IC
50 = 0,35 ± 0,08 uM) og imatinib ( 100 uM) for Src i DU145 cellelysater som er analoge til de rapporterte forskjellen i henhold enkle bufferbetingelsene. Til slutt, undersøkte vi hvorvidt CE strategi kan anvendes for å observere Src-aktivitet og inhibering i enkeltceller (Fig. S4). DU145-celler ble mikroinjisert med Src substrat 1, cellene deretter inkubert i 2 minutter, hver for lysert ved anvendelse av en fokusert Nd: YAG laser, og deretter lysat fra hver celle elektroforese separat. Dannelsen av phosphopeptide produktet ble observert fra celler som ikke var blitt preinkubert med inhibitor (14 ± 2% av det totale peptidinnhold) eller i celler preinkubert med 1 uM av svak hemmer imatinib (
IC
50 100 uM, 15 ± 3% av det totale peptidinnhold). Derimot ble det ikke peptid fosforylering observert i celler som hadde blitt preinkubert med 1fiM av potent inhibitor saracatinib (
IC
50 = 0,35 ± 0,08 mm).
Med muligheten å sample Src-aktivitet ved anvendelse av renset enzym, i cellelysater og i enkeltceller, undersøkte vi Src-aktivitet fra ikke-invasiv, invasiv, og androgen-uavhengig prostatacellelinjer (fig. 2). Uventet, fant vi at Src fosfotransferaseaktivitet er høyest i de ikke-invasiv cellelinjer, som synes å være i strid med den generelle oppfatningen at Src spiller en viktig rolle i potenmetastatisk potensial og overgangen til og vedlikehold av androgen-uavhengig vekst i prostatakreft. Imidlertid slo det oss at Src kinase nivåer kan variere over cellelinjer. Igjen, uventet, har vi funnet at invasive og androgen-uavhengig cellelinjer som oppviser betydelig mindre Src enn deres ikke-invasiv androgen-avhengige motstykker (fig. 3). På den annen side, forholdet mellom Src-aktivitet til Src innhold (spesifikk aktivitet) viste at aggressiv og androgen-uavhengig cellelinjer vil vise en høyere spesifikk aktivitet enn Src ikke-aggressive androgen-avhengige cellelinjer (Fig. 4). I tillegg innehar denne trenden for rekken av N-metyl-N-nitrosourinstoff-cellelinjer avledet fra RWPE1 (fra den perifere sonen i en normal human prostata). Nærmere bestemt, observerte vi nedsatt total Src-aktivitet og Src innhold, og øket Src spesifikk aktivitet som en funksjon av økende cellelinje invasivitet (RWPE1 WPE1-NA22 WPE1-NB14 WPE1-B11) (figur 6A-B.). Vi gjør oppmerksom på ett unntak fra denne sammenhengen, nemlig den mest aggressive RWPE1-avledet cellelinje, WPE1-NB26. Den sistnevnte har fått betydelig oppmerksomhet på grunn av dens sterkt invasive fenotype, [30], [44] – [53]. Ved hjelp av total Src innhold og spesifikk aktivitet som mål på aggressivitet, ville vi ha tildelt en ikke-invasiv fenotype til WPE1-NB26 (dvs. lik som den overordnede cellelinje RWPE1). Imidlertid, siden dette er åpenbart feil, aggressivitet forbundet med denne N-metyl-N-nitrosourea cellelinje kan skyldes, i det minste delvis, til mekanismer som er uavhengige av Src-signalering.
Hvorfor er den totale src innhold redusert i de mest aggressive cellelinjer? En mulig forklaring er den kjente følsomhet av aktivt Src, i forhold til sin ikke-aktivert motpart, til ubiquitin-formidlet nedbrytning [54], [55]. Derfor cellelinjer som er under intens aktivert Src press kan, ironisk nok, viser lavere Src innhold enn mindre aggressive celler. I tillegg er to nylige studier antyder en mikro-RNA (MIR) -avhengig mekanisme ved hvilken Src-nivåer er regulert. Bhatnagar
m.fl.
har vist at jo mer invasive prostata cellelinje jo høyere MIR-205 nivå [48]. MIR-205 er kjent for å nedregulere ekspresjon av Src [56]. Vår observasjon at Src nivåene er lavere i aggressive prostatacellelinjer er i tråd med både ubiquitin og miRNA mekanismer. Dessuten, jo høyere spesifikk aktivitet i de mest aggressive cellelinjer indikerer at, i disse celler, selv om det er mindre Src til stede, en større del av den befinner seg i aktiv form.
Src-fosforylering status er antatt å korrelere med aktivitet hvor pTyr-416 tas som aktive og pTyr-527 som inaktive former av enzymet. Med dette i tankene, vi målte nivåene av pTyr-416 via Western blot analyse og plottet pTyr-416 Src /total Src (brøk pTyr-416) mot cellelinje aggressivitet. Som det fremgår av fig. 5A og 6D, svært aggressive cellelinjene viser en høyere andel av pTyr-416 til totalt Src enn sine nonaggressive kolleger. Dette stemmer overens med en nylig rapport av Evans og medarbeidere viser at Src-inhibitoren saracatinib er mest effektive mot prostata cellelinjer som har det høyeste forholdet mellom aktiv-til-total Src [57]. I det sistnevnte studium, ble «aktivt Src» tatt for å være pTyr-416 Src. Disse forskerne rapporterte også at celler med de laveste (pTyr-416 Src /totalt SRC) forhold uttrykker den mest Src.
En høy pTyr-527 /total Src forholdet bør være i henhold til den konvensjonelle modell, som indikerer en samlet nedre fraksjon av aktivt enzym. Vi har imidlertid funnet ut at dette forholdet er høyere i aggressive linjer i tillegg (Fig. 5B og S5 fig.). En mulig forklaring på dette uventede resultat er den kjente evnen til pTyr-527 Src enzym for å bli aktivert av fosforylerte peptider og proteiner. Kort sagt, selv om pTyr-527 Src er inaktivt ved dets isolert, renset form, kan det motsatte være tilfelle når potensielle fosforylerte bindingspartnere er til stede. Derfor konkluderer vi med at pTyr-527 Src nivåer er ikke et nyttig barometer for inaktive Src og heller, kan faktisk være en mer passende prognosticator av Src aktivitet. Som en side, ser vi at de vestlige blotter ansatt i denne studien for å oppdage Src fosforylering status brukt store cellepopulasjoner. Men nyere fremskritt, drevet av CE-teknologi, gjør at fosforylering status av proteiner som skal løses og oppdaget fra så få som 25 celler [58]. Faktisk har CE som en mikro Western blotting system fikk betydelig oppmerksomhet [59]. Følgelig kan det til slutt være mulig å samtidig prøve nivåer av spesifikke enzym fosfo-isoformer samt enzymaktivitet i noen få celler ved hjelp av CE-teknologi.
Det har vært og fortsetter å være en Herculean innsats for å identifisere Cap markører som korrelerer med arvbarhet samt ervervet somatiske mutasjoner. For eksempel, har mer enn 40 resistens loci blitt tildelt ca 25% av arvelig risiko. [60] I tillegg er både kodende region og hele genomet analyser er gjennomført for å identifisere genetiske avvik som korrelerer med somatisk kjøpt Cap. For eksempel ble en fersk hel genom studie utført ved hjelp av tumorprøver fra pasienter med aggressiv cap. Disse forskerne identifisert nærmere 4000 somatiske grunn mutasjoner og 90 kromosom rearrangements per svulst, samt korrelasjoner mellom en rekke omorganisering stoppunkter og ulike epigenetiske merker. [61] Forfatterne oppmerksom på at en «spektrum av mekanismene direkte prostatakreft Genesis og progresjon» [61] og dermed ingen enkelt endring i enzymaktivitet er ansvarlig for utbruddet, progresjon, og /eller aggressivitet av sykdommen. For eksempel er de komplekse genomiske rearrangementer utbredt i Cap tenkt å gå utover den sletting og forsterkning av en rekke gener som koder kjente kreftdempere og onkogener, henholdsvis. Likevel, ikke vår data tyder på at Src spesifikk aktivitet kan fungere som et barometer for Cap aggressivitet. Dette er sannsynligvis en konsekvens av det faktum at Src i seg selv er en viktig deltager i baner som formidler cellevekst og motilitet, som i sin tur kan gjenspeile de massive og komplekse genomiske strukturelle endringer utbredt i Cap. I tillegg, selv om vi har funnet ut at pTyr-416 Src /total Src er en pålitelig indikator for Src spesifikk aktivitet, resultatene med pTyr-527 er, ved første øyekast, uventet. Fosforylert Tyr-527 er generelt ansett for å være representative for inaktive enzym. Vi har imidlertid funnet at forholdet mellom pTyr-527 /total Src er en dårlig indikator på
i
aktiv Src i Cap cellelinjer. I stedet synes den sistnevnte forhold for å være et mye bedre prediktor for aktive Src. Fra et mekanistisk synspunkt, kan dette gjenspeiler tilstedeværelsen av fosforylerte proteiner som kan knytte til (via Src s SH2 domene) og derved hurtig aktivere den inhiberte enzymet. Derfor bør aktiviteten status for pTyr-527 Src bli sett på som «primet for aktivitet» i stedet for statisk inaktive.
I sammendraget, har vi utviklet en sensitiv og selektiv Src kinase aktivitet sensing system. Ved hjelp av en rekke nonaggressive, aggressive, og androgen-uavhengig prostatacellelinjer, har vi funnet ut at total Src aktiviteten avtar som funksjon av økende prostata cellelinje aggressivitet. Fmoc-Orn(Aloc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Tyr(PO(OBzl)OH)-Gly-Glu(OtBu)-Phe-Orn(Aloc)-amide-Resin
