Abstract
Bakgrunn
Tidligere rapporter har antydet en mulig involvering av Single-minded homolog 2 (SIM2) i humane solide kreft, inkludert prostatakreft. Imidlertid er den nøyaktige rollen til SIM2 i kreft generelt, og i prostata kreft spesielt, forblir stort sett ukjent. Denne studien er designet for å belyse den rolle SIM2 i prostatakreft ved hjelp av en shRNA basert tilnærming i PC3 prostatakreft cellelinje.
Metoder
Lentiviral shRNAs ble brukt til å hemme SIM2 gen og protein nivåer i PC3 celler. Kvantitativ RT-PCR og forgrenede DNA ble utført for å evaluere transkripsjon uttrykk. SIM2 proteinekspresjon nivået ble målt ved hjelp av western blot. Profilering av genuttrykk som spenner over hele genomet, samt polare metabolomics av flere store metabolske veier ble utført for å identifisere viktige spredningsveier dysreguleringer.
Resultater
SIM2 gen- og proteinprodukter ble signifikant nedregulert av Lenti -shRNA i PC3 cellelinje. Denne lave uttrykk for SIM2 påvirket genekspresjon profil, avslører vesentlige endringer i viktige signalveier, nettverk og funksjoner. I tillegg ble store metabolske veier berørt.
Konklusjon
Til sammen tyder våre resultater en involvering av SIM2 i sentrale trekk ved prostatatumorcellebiologi og kan ligge til grunn for et bidrag på denne transkripsjonsfaktor til prostatakreft utbruddet og progresjon
Citation. Lu B, Asara JM, Sanda MG, Arredouani MS (2011) Rollen til transkripsjonsfaktor SIM2 i prostatakreft. PLoS ONE 6 (12): e28837. doi: 10,1371 /journal.pone.0028837
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 26 august 2011; Godkjent: 16 november 2011; Publisert: 09.12.2011
Copyright: © 2011 Lu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av NIH-NCI Early Detection Research Network gi UO1-CA11391 (M. Sanda), Department of Defense Prostate Cancer Training Award W81XWH-09-1-0626 (B. Lu), og Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award (MS Arredouani ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Single-minded homolog 2 (SIM2) genet ligger på den menneskelige kromosom 21q22.2 og er medlem av de grunnleggende helix-loop-helix PAS [per-Arnt-Sim] (bHLH-PAS) familie av transkripsjonsfaktorer [1], [2]. SIM2 var opprinnelig tenkt å bidra til Down syndrom (DS) [3]. Som en transkripsjonsfaktor (TF), murine SIM2 (mSIM2) formidler genuttrykk gjennom CNS linjen forsterker (CME) element med sin dimerization partner ARNT via ARNT karboksyterminal [4]. Transkripsjonsfaktoren c-myb regulerer SIM2 transkripsjon i glioblastom celler, og et kjernefysiske lokalisering signal (NLS) formidler kjernefysiske lokalisering av SIM2 [5].
En tidligere
i silico
bioinformatikk tilnærming ved hjelp av Cancer Genome Anatomy Project (CGAP) database av National Cancer Institute (NCI) identifisert SIM2 som i forbindelse med kolon, bukspyttkjertel og prostata karsinom, mens fraværende i de tilsvarende normale vev [6]. To forskjellige skjøtes isoformer av SIM2 avskrift, SIM2 lang (SIM2-l) og SIM2-kort (SIM2-er), har blitt rapportert mens deres differensial funksjon hos mennesker er ikke kjent ennå [1]. SIM2-s ble spesielt uttrykt i tidlige stadier av kreft i tykktarmen. Antisens inhibisjon av SIM2-s ekspresjon av antisens oligonukleotider forårsaket veksthemming og apoptose i tykktarmskreft cellelinje RKO og tumorvekst i nakne mus og også i bukspyttkjertelkreft cellelinje CAPAN-en [7], [8]. Apoptose ble indusert ved SIM2-s hemning i RKO tykktarmskreft cellelinje [9]. SIM2-er ble også funnet å ha tumorundertrykkende aktivitet i brystkreft [10]. Invasjonen potensialet av glioblastom ble redusert betydelig ved SIM2s inhibering, i samsvar med en reduksjon i ekspresjonen av matriks-metalloproteinase 2 ved både mRNA og proteinnivåene [11].
Vi har tidligere rapportert SIM2 som en potensiell biomarkør og immunterapi målet for human prostatacancer [12]. Selv om SIM2-s ekspresjon (som målt ved immunohistokjemi av prostatektomi prøver) har blitt forbundet med aggressiv histopatologi i prostata cancer, og overekspresjon av ektopiske SIM2s forbedret overlevelse under visse forhold i PC3AR + celler [13], [14], den funksjonelle rollen til SIM2 gen i prostata kreft celle er i stor grad ukjent.
i denne studien har vi søkt å belyse den funksjonelle rollen SIM2 ved PCA bruker en genet Slå tilnærming og karakterisering av molekylære og funksjonelle endringer gjort av både genekspresjon profilering og metabolomic profilering.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
den menneskelige PC3, LNCaP, Vcap og DU145 cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia) og kultivert som per ATCC protokoll. Godartede Prec celler, som beskrevet i Berger R et al, 2004, ble vennlig levert av Dr. W. Hahn Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA.
Transduksjon Partikler
pLKO 0,1-puro kontroll lentiviral transduksjon partikler, MISSION luciferasepreparater shRNA kontroll lentiviral transduksjon partikler og MISSION SIM2 shRNA lentiviral transduksjon partiklene ble brukt til å infisere PC3 cellelinje (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Prøve utvalg, RNA rensing og revers transkripsjon
ti godartede og fjorten tumor radikal prostatektomi vevsprøver ble oppnådd og total RNA ble behandlet slik det er beskrevet i vårt tidligere arbeid [12]. Cellelinje total-RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Renset RNA ble kvantifisert ved Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop, Wilmington, DE). 500 ng av hver celle total RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av oligo dT og hevet III revers transkriptase (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) under produsentens instruksjoner.
genuttrykk mikromatriser og analyse
250 ng total RNA ble forsterket ved hjelp av Ambion sin MessageAmp II mRNA Amplification kit. Biotin-UTP ble inkorporert i løpet av natten in vitro transkripsjon trinn i henhold til produsentens protokoll. Genekspresjon ble vurdert ved hjelp av Affymetrix-tallet (Santa Clara, California) Genechip U133 array (Plus 2.0 chip) matriser som representerer hele den menneskelige genom transkripsjoner. 15 ug cRNA ble fragmentert og hybridisert til Arrays «ifølge produsentens protokoller som tidligere beskrevet [15]. Kvaliteten på skannede arrays bilder ble bestemt på basis av bakgrunnsverdier, prosent tilstedeværende samtaler, skaleringsfaktorer, og 3′-5 forholdet mellom β-aktin «og GAPDH ved hjelp av BioConductor R pakker. Den signalverdi for hver avskrift ble oppsummert ved hjelp av PM-bare basert signal modellering algoritme beskrevet i dchip. De PM bare basert modellering basert algoritme gir mindre antall falske positiver i forhold til PM-MM modell. På denne måte tilsvarer signalverdien til det absolutte nivået av ekspresjon av et transkript [16]. Disse normaliserte og modellerte signalverdier for hvert transkript ble anvendt for ytterligere høyt nivå bioinformatikk analyse. Under beregning av modellbaserte uttrykk signalverdier, utvalg og probe utliggere er avhørt og bilder spike behandles som signal uteliggere. Uteliggeren påvisning ble utført ved hjelp av dchip avvikende algoritme. En brikke anses som en avvikende om sonden overskrider én eller matrise utligger prosent en standardgrense på 5%. Ved sammenligning av to grupper av prøver for å identifisere gener som er anriket i en gitt fenotype, hvis 90% lavere konfidensgrense (LCB) av folden endring (FC) mellom de to gruppene var over 1,2, ble det tilsvarende genet som anses for å være uttrykt forskjellig. LCB er en streng estimat av FC og har vist seg å være bedre rangering statistikken [17] Det har blitt foreslått at et kriterium for valg av gener som har en LCB over 1,2 mest sannsynlig svarer til gener med en «virkelig» fold forandring av i det minst to i genuttrykk [18]. Data ble hentet fra CEL filer og normalisert ved hjelp RMAexpress (https://rmaexpress.bmbolstad.com/). Data ble analysert ved hjelp av MeV programvare (https://www.tm4.org/mev/)
Cell signalveien analyse
oppfinnsomhet Pathways Analysis (Oppfinnsomhet Systems®, http:. //www.ingenuity.com) søknader ble brukt til å generere nettverk og vurdere statistisk relevante biofunctions, kanoniske trasé og nettverk knyttet til de forskjellig uttrykt genet profiler hentet fra transkriptom data.
forgrenet DNA og kvantitativ real-Time PCR ( QRT-PCR)
forgrenet DNA ble utført for å evaluere SIM2s og SIM2L genuttrykk i menneskelige prostata totale RNA prøver og normalisert etter 2 kontrollgener ALSA1 og HPRT (QuantiGene 2,0 -reagenssystem, Affymetrix Inc, Fremont, CA ). For kvantitativ RT-PCR, ble 1 pl cDNA anvendt for hver brønn RT-PCR-reaksjoner. Prøvene ble utført i tre paralleller. Taqman universell PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble anvendt for to-trinnssanntids RT-PCR-analyse på Applied Biosystems Prism 7900HT instrument. TaqMan real time PCR primere for GAPDH (4310884E) og SIM2L (hs00231925_m1) ble kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, California). TaqMan real time PCR primere for SIM2s ble designet av vår gruppe og kjøpt fra Biosearch Technologies (Novato, CA). SIM2s forover primer: 5′-gtgccaagct acgaaggtg-3 «; SIM2s revers primer: 5»-acttagaagcagaaagagggcaag-3 «; probe: TCAGGTCTGCTCGTGGGGAAGGTG. Expression verdien av SIM2s eller SIM2L i en gitt prøve ble normalisert til tilsvarende uttrykk for GAPDH. De 2
-ΔΔCt metoden ble brukt til å beregne relative uttrykk for SIM2 genet som beskrevet tidligere [19], [20].
Lentiviral transduksjon og stabil cellelinje utvalg
1,6 X 10
4 PC3-celler ble platet i 96-brønners plate og inkubert i 20 timer. Mediet ble fjernet, og 110 ul friskt medium inneholdende hexadimethrine bromid til en endelig konsentrasjon på 8 ug /ml ble tilsatt. Lentiviral partikler ble tilsatt til passende brønner på 5 MOI (multiplisitet av infeksjon) og inkubert over natten. Friskt medium ble deretter tilsatt, og celler dyrket i 2 dager, etterfulgt av en 10-12 dagers kultur med puromycin (2 ng /ml) tilsatt etter 3 dager.
Transient transduksjon ble oppnådd i løpet av en 3-dagers inkubasjon.
Western blot
Cellene ble vasket to ganger med PBS to ganger før de ble høstet ved skraping. Cellelysater ble fremstilt i cellelyseringsbuffer (50 mmol /L Tris-HCl pH 8,0, 20 mM EDTA, 1% SDS, og 100 mM NaCl) inneholdende et enzym inhibitor blanding tablett (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) og PMSF ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å bruke BCA-proteinanalysesett (Thermo Scientific, Rockford, IL). En total på 20-50 ug proteinekstrakt ble fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE og overført til en polyvinylidendifluorid-membran (Immobilon-P, Millipore). Membranen ble blokkert med TBS-T (0,1% Tween 20 i PBS) inneholdende 3% tørrmelk og inkubert med SIM2s primært antistoff (Santa Cruz, sc-8715, isoform NM_009586) over natten ved 4 ° C. Etter tre vaskinger med TBS-T, ble membranen inkubert med HRP-konjugert sekundært Ab i 1 time og deretter vasket med 0,05% Tween 20 i PBS. De immunkomplekser ble oppdaget av ECL-metoder (Thermo Scientific, Rockford, IL).
metabolittprofilering ved hjelp av målrettede Væske-kromatografi Tandem massespektrometri (LC /MS /MS)
10
6-celler eksponensielt voksende på basalmedier med dialysert serum ble høstet i 3 ml 80% volum /volum HPLC grad metanol ved tørristemperatur. Friskt medium ble tilsatt 24 timer og 2 timer før ekstraksjonen. Uoppløselig materiale i lysatene ble sentrifugert ved 4000 RPM i 15 minutter og den resulterende supernatant (metabolitt innhold) ble inndampet ved bruk av en avkjølt speedvac til en pellet. Prøvene ble resuspendert ved bruk av 20 pl HPLC-kvalitet vann for massespektrometri-analyse. 10 ul ble injisert og analysert ved bruk av en 5500 QTRAP trippel kvadrupol massespektrometer (AB /Sciex) koblet til en Fjellet UFLC HPLC-system (Shimadzu) via valgte reaksjons overvåking (SRM) av i alt 255 endogene vannoppløselige metabolitter for steady-state-analyser av prøver. Noen metabolitter var målrettet i både positiv og negativ ion modus for totalt 298 SRM overganger. ESI spenningen var + 4900V i positiv ion modus og -4500V i negativ ion modus. Oppholdstiden var 5 ms per SRM overgang og den totale syklus tid var 2,09 sekunder. Ca 8-10 datapunkter ble kjøpt per oppdaget metabolitten. Prøvene ble levert til MS via normal fase kromatografi ved anvendelse av en 2,0 mm i.d. x 15 cm Luna NH2 HILIC kolonne (Phenomenex) ved 285 pl /min. Gradienter ble kjørt fra 85% buffer B (HPLC grade acetonitril) til 42% B fra 0-5 minutter; 42% B til 0% B fra 5-16 minutter; 0% B ble holdt fra 16-24 minutter; 0% B til 85% B fra 24-25 minutter; 85% B ble holdt i 7 minutter for å re-ekvilibrere kolonnen. Buffer A bestod av 20 mM ammonium-hydroksyd /20 mM ammoniumacetat (pH = 9,0) i 95: 5 vann: acetonitril. Peak områder fra total ion strøm for hver metabolitt SRM overgangen ble integrert ved hjelp MultiQuant v1.1 programvare (AB /Sciex).
Målingene ble utført i tre paralleller og data ble normalisert per celle nummer. Bare metabolitter som ble bestemt i alle 6 prøvene ble beholdt og analysert ved hjelp av MetaboAnalyst [21], [22].
Statistisk analyse
genekspresjon array-data ble analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Basert på vår tidligere arbeid [12], vi testet for SIM2 oppregulering i tumorer versus kontroller med en ensidig t-test og sammenlignet mot en p-verdi terskel på 0,05.
Kvantitativ Real-Time PCR (QRT -PCR).
Validering av forskjellig uttrykt gener ble utført ved QRT-PCR. 200 ng av høy kvalitet RNA prøver ble revers transkribert til førstetråds-cDNA og 1 pl cDNA ble anvendt for hver brønn RT-PCR-reaksjonen. Prøvene ble utført i tre paralleller. SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble brukt for to-trinns real-time RT-PCR-analyse på Applied Biosystems 7900HT Prism instrument. PCR-primere «sekvenser for målrettet gener er vist i Tabell S3. Sekvensene for GAPDH: GAPDH-F (5»-TGCACCACCAACTGCTTAGC -3 «) og GAPDH-R (5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG -3»). Ekspresjon verdi av den målrettede-genet i en gitt prøve ble normalisert til den tilsvarende ekspresjon av GAPDH. De 2
-ΔΔCt metoden ble brukt til å beregne relative uttrykk for målrettede gener.
Resultater
SIM2 genet er uttrykt forskjellig i prostata normal og kreft prostatektomi og cellelinjer
Vi har evaluert SIM2 genuttrykk i totalt 24 normale og kreft prostatektomi prøvene er vist i tabell 1. Fordi SIM2 genet finnes i to isoformer, SIM2 kort (SIM2s) og SIM2 lang (SIM2L), bekreftet vi uttrykket av begge isoformer i RNA ekstrahert fra prostatektomi ved hjelp forgrenet DNA-teknikk (fig 1A 0.000003 og p 0,00005, respektivt. Men forholdet mellom SIM2s til SIM2L ekspresjon var ingen forskjell mellom godartet og tumor (tabell 1, T-test med p = 0,85). Den SIM2s og SIM2L uttrykk var 7.03 og 6.95 ganger høyere henholdsvis i svulstene sammenlikne gjennomsnitt for de to gruppene etter en logg justering for å sikre normalitet og konstant varians innenfor hver gruppe. Uttrykk for SIM2s og SIM2L ble også evaluert i fire menneskelige prostata kreft cellelinjer, PC3, LNCaP, DU145 og Vcap, og i normal prostata epitel cellelinje prec. Begge SIM2s og SIM2L isoformer ble sterkt uttrykt i Vcap celler, mens det var en moderat uttrykk nivå i PC3 celler og svært lav uttrykk i DU145, LNCaP og prec celler (Fig. 1C). Fordi det er bare noen få ledige antistoffer mot SIM2, har vi bare kunnet identifisere den korte isoform av SIM2 (SIM2s) i cellulære proteinekstrakter av western blot. Denne mangelen på antistoffer komplisert vår oppgave å studere funksjonen av SIM2 lang isoform. Den SIM2s protein uttrykk nivå var i samsvar med sin genuttrykk i prostata normale og kreftcellelinjer. (Fig. 1D).
Kvantitativ Ekspresjon av SIM2 kort isoform (A) og SIM2 lang isoform (B) ble evaluert ved å forgrenet DNA-teknikk i 10 normale og 14 humane kreft prostatektomi prøver. Data ble kvantifisert ved hjelp ALSA1 og HPRT som normalizers. (C) Kvantifisering av SIM2 korte og lange isoformer «uttrykk i menneskelig prostata normal og kreft cellelinjer ved real time RT-PCR. Data ble kvantifisert ved ΔΔC
T-metoden og normalisert til GAPDH. Kolonne i hvitt representerer SIM2 kort isoform og kolonne i grått representerer SIM2 lang isoform. (D) Western blot ble utført i prostata normale og kreftcellelinjer for SIM2s.
Dempe SIM2 uttrykk i PC3 cellene
For å oppnå høyest nedregulering av SIM2 uttrykk ved hjelp lentiviral shRNA, har vi valgt PC3 cellelinje som modell. PC3 celler ble transduced med fem forskjellige SIM2 shRNA ekspresjonsvektorer, hvorav fire (shRNA48, shRNA49, shRNA50 og shRNA51) viste signifikant hemmende effekt i forhold til å kontrollere shRNAs. Over 80% stanse av genekspresjon ble oppnådd ved hjelp shRNA51 (Fig 2A . B). To kontrollcellelinjer ble generert ved anvendelse av enten en vektor som stabilt uttrykker shRNA målretting luciferase eller tom vektor. Et lignende hemmende mønster ble observert for SIM2L genekspresjon i disse stabilt infiserte PC3 cellelinjer. Tilsvarende ble effektiv forbigående stanse av SIM2S og SIM2L oppnådd i PC3 (figur S1).
Sanntid RT-PCR ble utført i tre paralleller (A) og protein ekspresjon ble undersøkt ved western blot (B). Kontroll 1: Luciferase shRNA vektor, Kontroll 2: PLKO vektor. sh48, sh49, sh50, sh50, sh51 og sh52: vektorer som uttrykker shRNAs målretting SIM2 gen på forskjellige steder. Kolonne med «*» representerer betydelig nedregulering av SIM2 genuttrykk ved shRNA sammenligne både av kontroll 1 og styring 2 (P 0,05).
Impact of SIM2 lyddemping på genekspresjon profil i PC3 celler
til tross for sin mistanke rolle i kreft, svært lite er kjent om bidraget av transkripsjonsfaktor SIM2 til regulering av genekspresjon [23]. Vi undersøkte derfor effekten av nedregulering av SIM2 i prostatakreftceller. For dette formål, shRNA som ga den høyeste stanse frekvensen av SIM2, dvs. shRNA51, ble valgt. PC3 celler behandlet med shRNA51 ble sammenlignet med en kontrollgruppe shRNA (shRNAc).
genuttrykk profiler av PC3 SIM2
lav og kontroll PC3 cellelinjene ble evaluert med Affymetrix Genechip U133 array (Plus 2.0 chip) bestående av 52.000 transkripsjoner fra hele menneskets genom transkripsjoner. Figur 1 er et kart som viser varme genet feilregulering etter banket ned ekspresjonen av SIM2 i PC3-celler. Ekspresjon av et stort antall transkripter viste en endring på minst to ganger (figur 3A og tabell S4). Pathway analyse viste at mange høyt differensielt uttrykte transkripter representerer gener som tilhører kjente signalveier, for eksempel PTEN og PI3K /AKT signalveier (figur 3B), hvis engasjement i tumorgenese er godt dokumentert [24], [25]. Spesifikke gener som er involvert i hver signalveien er vist i tabell S1. Blant disse genene, CCL5, MAPK1, P38, DDR1 og ERK spilt en sentral rolle i veien nettverk (figur 4). Genene i dette nettverket har vært involvert i celledød, metabolisme, cellulær utvikling, og tumor antigen presentasjon. Andre gener som er involvert i de høyeste poengsum nettverk er vist i Tabell S2. Videre analyser viste at en rekke viktige biologiske funksjoner er dysregulerte følgende SIM2 lyddemping (figur 3C). Interessant, flere celle funksjoner relatert til metabolisme, som for eksempel narkotika metabolisme og metabolsk sykdom, er blant de beste rangerte funksjoner.
A. Kontroll A: PC3 luciferase shRNA; Kontroll B: PC3 PLKO vektor; SIM2 C: SIM2 sh48; SIM2 D: SIM2 sh51. Genekspresjon var enten opp eller ned mer enn to ganger i SIM2
lav ble oppført. B. Top dysregulerte signalveier i SIM2
lave PC3 celler. C. Top dysregulerte cellefunksjoner i SIM2
lave PC3 celler.
Dette nettverket inneholdt 16 fokus gener med en score på 29. Ulike former av noden representerer ulike grupper av fokus gener. Intensiteten av noden farge angir graden av opp (rød) og ned (grønn) genekspresjon nivå. De beste funksjonene til dette nettverket er cellulær bevegelse, immuncelletrafikken, organismeskader og misdannelser.
Validering av RT-PCR av en gruppe forskjellig uttrykte gener (tabell S3) delvis bekreftet vår i silico analyse av stabile og forbigående transfektant PC3 celler (figur 5 6)
QRT-PCR validering av mRNA uttrykk nivåer av enkelte gener ble utført av to-trinns real-time RT-PCR-analyse på Applied Biosystems 7900HT Prism. instrument. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Målingene ble utført i tre paralleller og data presentert som gjennomsnitt ± SD.
QRT-PCR validering av mRNA uttrykk nivåer av enkelte gener ble utført av to-trinns real-time RT-PCR-analyse på Applied Biosystems 7900HT Prism instrument. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Målingene ble utført i tre paralleller og data presentert som gjennomsnitt ± SD.
PC3 SIM2
lave celler viste store endringer i deres metabolske profil
Vi har søkt å avgjøre om genuttrykk endringer føre til betydelige endringer i metabolske veier i PC3 SIM2
lave celler. Dette ble løst ved å måle 255 polare metabolitter ved hjelp av målrettet massespektrometri (LC /MS /MS). Sammenligning av den metabolske profilen av kontrollceller for å shRNA-SIM2-behandlede celler viste signifikante endringer i flere metabolske baner, og produksjonen av 39-metabolitter (tabell 2 & amp, 3). Den purinmetabolismen veien var toppen en feilregulert sti med 11 metabolitter betydelig opp- eller nedregulert nivåer av totalt 92 metabolitter i denne veien i SIM2 stanse PC3 celler. Pyrimidin metabolisme pathway oppført som den andre feilregulert vei med 6 ut av totalt 60 metabolitter med vesentlig endrede nivåer (Tabell 2, fig. 7). De betydelige endringer til nukleinsyre metabolismen kan tyde på sin viktige rolle i prostata kreftutvikling.
metabolitter ble hentet fra SIM2
lave og normale PC3 celler ved hjelp metanol og overflod av 239 metabolitter ble målt ved hjelp av målrettet LC /MS /MS. Data ble analysert ved anvendelse av MetaboAnalyst programvare. De metabolske pathways ordnet etter resultatet fra berikelse analyse (y-aksen) og fra topologi analyse (x-aksen). Tredoble målinger ble utført.
Diskusjoner
I våre tidligere biomarkør identifiseringsarbeidet, har vi identifisert SIM2 som en potensiell biomarkør for PCa. Takket være sin overekspresjon i prostatakreft og dens svært begrenset uttrykk hos mennesker, foreslo vi å bruke SIM2 som en immunterapi mål og var i stand til å identifisere fem HLA-A2.1, SIM2-avledet immunogene epitoper [12]. I denne studien forsøkte vi å karakterisere rollen SIM2 i prostatakreft ved hjelp av et kort hårnål RNA-induced genet Slå tilnærming i PC3 celler som modell. Vi fokuserte på å profilere både transkriptom og metabolomet i SIM2
lave og normale PC3 celler, og evaluert effekten av SIM2 lyddemping på cellesignalisering og funksjon.
SIM2s isoform har blitt rapportert å være uttrykt i tykktarm , bukspyttkjertel, og prostatatumorer mens fraværende i de tilsvarende godartet vev [8]. Vi fant at SIM2 gener kan påvises i alle disse prostatakreftceller av Real Time PCR. Men uttrykket nivåer i DU145 og LNCaP er relativt lavere enn andre prostatakreftceller mens PC3 celler uttrykker moderat SIM2 gener som er i samsvar med annen rapport [14].
Hele spekteret av regulering av genekspresjon etter transkripsjonsfaktor SIM2 er fremdeles dårlig definert. Nivået på reguleringen kunne bli reflektert av differensial uttrykk for ca 200 gener som avdekket gjennom genuttrykk profilering av PC3 SIM2
lave celler. Andre grupper har rapportert spesifikke gener som er regulert av SIM2. De bHLH /PAS transkripsjonsfaktorer enkle tenkende 2s ble rapportert å fremme melkekjertlene lactogenic differensiering av regulering av Csn2 uttrykk [26]. SIM2 regulerer ekspresjonen av MMP-2 og TIMP-2, som drive dens rolle i glioblastom-celler [11]. SIM2s undertrykker BNIP3, en pro-apoptotiske genet, gjennom sitt hypoksisk respons element i PC3 celler [14]. Vår genuttrykk profil i PC3 SIM2
lave celler viste signifikant endring i PTEN, PI3K /AKT og Toll-like receptor (TLR) signalveier som er involvert i stor grad i tumorprogresjon. PTEN styrer negativt PI3K signalveien for cellevekst og overlevelse av dephosphorylating 3-stillingen av phosphoinositides [24], [25]. TLR regulerer cellevekst og overlevelse og sentral signalmolekyler mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) og PI3K spille viktige roller [27]. Våre data viser at hemming av Sim2 genet i PC3 cellene påvirker uttrykket av flere gener som koder for proteiner som er organisert i et nettverk rundt p38MAPK. Disse proteinene, som inkluderer CCL5, MAPK, ERK og DDR1 (figur 4), har blitt rapportert å være involvert i tumorutvikling. Kjemokinet CCL5 er blitt rapportert å bli uttrykt av prostataceller og påvirker deres vekst og overlevelse. Etter aktivering av MAPK p38 og ERK1 /2 i LNCaP-celler, ekspresjonen av CCL5 øker, noe som resulterer i økt celleformering [28], [29]. PC3 celleproliferasjon og invasjon ble også betydelig undertrykt etter DDR1 knockdown av siRNA [30], [31].
Våre RT-PCR data avdekket avvik mellom forbigående og stabil stanse all SIM2 i PC3 cellene. Dette kan være et resultat av 1) nærværet av to isoformer av SIM2 som er kvittert i forskjellig grad i begge oppsett, eller 2) SIM2 kan regulere genekspresjon av andre gener, enten direkte eller indirekte.
Funksjonsanalyse også avslørte at tre funksjoner relatert til celle metabolisme hadde blitt dysregulerte i PC3 SIM2
lave celler. Dette antydet at SIM2 kan ha metabolske konsekvenser. Vi har evaluert produksjonen av PC3 celler av 255 metabolitter som omfatter et stort antall mennesker stoffskifte. Av disse ble data innhentet for 239 metabolitter. Vår analyse viste signifikante endringer i metabolitter som utgjør hovedveiene, slik som purin- og pyrimidin-trasé.
Undertrykkelse av SIM2 kort isoform (SIM2s) av antisensoligonukleotider redusert tumorvekst i kolon kreftceller og indusert CAPAN-1 bukspyttkjertelen celledød ved apoptose [7], [8], [9]. SIM2s ble også rapportert å være en aggressiv prostatakreft biomarkør siden SIM2s protein var assosiert med økt preoperativ serum prostata spesifikt antigen (PSA), høy histologisk grad, invasive tumorvekst og økt tumor celleproliferasjon [13]. En fersk studie viste at SIIM2s kan dempe celledødsprosesser gjennom BNIP3 undertrykkelse i PC3AR + celler. Imidlertid knockdown av SIM2s i brystkreft MCF-7-celler økte tumorgenese, og viste således tumor suppressor aktivitet [32], [33]. De fleste av de tidligere studiene fokusert på SIM2s ved enten inntrengende eller knockdown av SIM2s, vi mangler av dataene som klargjør funksjonelle rollen til SIM2 protein, inkludert både av dets isoformer. Vår studie rapporterte en kombinert rolle begge isoformer av SIM2 innblandet i prostata kreftcelle. Skille rollene til SIM2s og SIM2L kan ha mer dyptgripende betydning for å forstå den funksjonelle rollen SIM2 i prostata kreft progresjon, som er vårt neste skritt å avdekke mer betydningen av dette genet.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1 .
Transient stanse av SIM2s og SIM2L uttrykk i PC3 celler. PC3-celler ble transdusert med enten en kontroll (Ctrl) eller shRNA51 (sh51) og dyrket i nærvær av puromycin i 3 dager. Real time RT-PCR ble utført i tre paralleller for å evaluere genekspresjon av SIM2 s (øvre panel) og SIM2L (nedre panel)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028837.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
Den øverste feilregulert signalveier i SIM2
lave celler. Top feilregulert kanoniske trasé ble identifisert gjennom analyse av forskjellig uttrykt gen data, ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis pakken
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028837.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
Molekyler i den høyeste poengsummen Networks i SIM2
lave celler. Data som representerer forskjellig uttrykt gener ble sendt til Oppfinnsomhet Pathway Analysis pakken og høy poengsum nettverk ble identifisert
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028837.s003 plakater (DOC)
tabell S3.
Liste av primere anvendt for RT-PCR kvantifisering av ekspresjon av utvalgte gener. Primerne ble utformet ved hjelp Pimer3 program. https://frodo.wi.mit.edu/primer3/
doi: 10,1371 /journal.pone.0028837.s004 plakater (DOC)
Tabell S4.
genekspresjon som var enten opp- eller nedregulert større enn to ganger i SIM2
lav
doi:. 10,1371 /journal.pone.0028837.s005 plakater (XLSX)
