Abstract
Bakgrunn
Microarray teknologien anvendt mikroRNA (miRNA) profilering er et lovende verktøy i mange forskningsfelt; Likevel er uavhengige studier som karakteriserer den samme patologi rapporteres ofte dårlig overlappende resultater. miRNA analysemetoder har bare nylig blitt systematisk sammenlignet, men bare i noen få tilfeller ved bruk av kliniske prøver.
Metodikk /hovedfunnene
Vi undersøkte den inter-plattformen reproduserbarhet av fire miRNA microarray plattformer (Agilent, Exiqon , Illumina, og Miltenyi), sammenligner ni sammenkoblede tumor /normal kolon vev. De mest samstemmige og utvalgte uharmoniske mirnas ble videre studert av kvantitativ RT-PCR. På verdensbasis ble en dårlig overlapping mellom forskjellig uttrykt mirnas identifisert av hver plattform funnet. Likevel, for åtte mirnas høy enighet i differensial uttrykk blant de fire plattformer og sammenlignbarhet til QRT-PCR ble observert. Videre er de fleste av miRNA sett identifisert av hver plattform er sammenhengende beriket i data fra andre plattformer og det store flertallet av tykktarmskreft assosiert miRNA sett hentet fra litteraturen ble validert i våre data, uavhengig av plattform. Computational integrering av miRNA og genuttrykk profiler antydet at anti-korrelert spådd målgener av forskjellig uttrykt mirnas blir ofte beriket i kreftrelaterte stier og i gener involvert i glykolyse og næringstransport.
Konklusjoner
Tekniske og analytiske utfordringer i å måle mirnas fortsatt og videre forskning er nødvendig for å øke konsistens mellom ulike microarray-baserte metoder. Men en bedre inter-plattform avtalen ble funnet ved å se på miRNA setter i stedet for enkelt miRNAs og gjennom en mirnas – genuttrykk integrasjon tilnærming
Citation. Callari M, Dugo M, Musella V, Marchesi E, CHIORINO G Grand MM, et al. (2012) Sammenligning av microarray plattformer for måling av differanse mikroRNA Expression i parvise Normal /Cancer Colon vev. PLoS ONE 7 (9): e45105. doi: 10,1371 /journal.pone.0045105
Redaktør: Yujin Hoshida, Mount Sinai School of Medicine, USA
mottatt: 31 mars 2012; Akseptert: 14. august 2012; Publisert: 13.09.2012
Copyright: © Callari et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Cariplo Foundation (2007.1215 /10,4890 til MAP), Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC IG-10 302 2010 til SC og AIRC 5 × 1000 n. 12162 til SC) og Helsedepartementet (ACC tilskudd til MGD), og ved å støtte fra Regione Lombardia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA-molekyler av 18-24 nukleotider i lengde som er mye konservert i alle eukaryote organismer og fungerer som regulatorer av genuttrykk. mirnas er involvert i alle store cellulære prosesser og er innblandet i et stort antall menneskelige sykdommer, inkludert kreft [1] – [3].
I løpet av det siste tiåret, DNA microarray teknologi har blitt en stadig mer kostnadseffektiv metode som er i stand til å raskt generere high-throughput data, banet vei for å genom-wide (GW) analyse av gen-uttrykk, genomisk kopinummervariasjoner, SNPs, og epigenetiske forandringer. Microarray-baserte teknikker har vært mye brukt i flere områder av forskning og molekylære analyser ved hjelp genekspresjonsmønster og forhåndsbestemte matematiske algoritmer, som Mammaprint®) [4], er under validering av potensielle multicentric kliniske studier ved brystkreft.
i det siste har microarray teknologien blitt brukt til miRNA profilering og blir en lovende teknikk i mange forskningsfelt, for eksempel translasjonell forskning innen onkologi, og kan gi nyttig informasjon om rollen til miRNAs i både tumorigenesis og progresjon av kreft [2]. Likevel, uavhengige studier som karakteriserer den samme patologi har ofte dårlig overlappende resultater. Dette kan være på grunn av lite utvalg størrelse, høy svulst variabilitet og heterogenitet, men også tekniske årsaker. En stor fordel med mikromatrisemetoden består i high-throughput screening samtidig på opp til flere tusen molekyler i en enkelt analyse, men dette krever hybridiseringsbetingelser for å være den samme for alle prober på matrisen. Dette er ikke trivielt for miRNA mikromatriser fordi GC innholdet av miRNAs er svært variabel og alternativene for sonde-designen er mer begrenset enn for mRNA grunn av sin korte lengde. For en fullstendig gjennomgang av generelle konsepter og spesielle utfordringer som er relevante for miRNA profilering refererer til Pritchard et al [5]. Et mangfold av plattformer for miRNA profilering er kommersielt tilgjengelig, og hver produsent har utviklet egne tekniske prosedyrer for å maksimere sensitivitet og spesifisitet i å måle miRNA uttrykket nivåer. Som et resultat, blir sondesignaler forventes å i stor grad varierer mellom plattformene, og en direkte sammenligning er ikke mulig. Til tross for dette, er de generelle mønstre av differensielt uttrykte (DE) mirnas skal være koherent detektert av alle plattformer. Bare nylig sammenligningen av intra- og inter-plattform reproduserbarhet av miRNA mikromatriser har vært analysert i mer enn tre forskjellige plattformer (se tabell S1 for detaljer) [6] – [11]. Samlet utgjør disse studiene gir holdepunkter for at miRNA microarray plattformer viser utmerket intra-plattformen reproduserbarhet, men begrenset inter-plattform samstemmighet. Faktisk, som sammenligner mirnas identifisert som DE innenfor hver plattform, en betydelig variasjon i antall, så vel som i den fold-forandring av mirnas har blitt bemerket. Tre av disse studiene [6]; [8]; [9] basert sine konklusjoner på sammenligning av vev eller bassenger av vev av helt annen opprinnelse. Sah et al. analysert ekspresjonen av syv syntetiske mirnas tilsatt i kjent konsentrasjon i en RNA fra placenta-vev og hybridisert på fem plattformer [11]. For å være nærmere en miRNA microarray program i kreftforskning, Git et al. analysert en pool av normale bryst vev og to brystkreft cellelinjer [7] og Dreher et al. sammenlignet untrasfected og HPV-transfekterte humane keratinocytter [10]. Selv om, de tidligere fire sammenligninger representerer et nyttig system for å løse tekniske problemer, og de senere to studiene er utvilsomt mer realistisk, spørsmålet om samsvar av ulike plattformer, når klinisk prøvene blir brukt, har ikke vært ennå adressert.
i denne studien sammenlignet vi miRNA uttrykket profiler av ni kolorektal kreft og normal tykktarmsslimhinnen prøver fra de samme pasientene som bruker fire forskjellige kommersielle plattformer (Agilent, Exiqon, Illumina og Miltenyi). Uttrykket av de mest samstemmige og utvalgte uharmoniske mirnas blant plattformene ble så vurdert med kvantitativ real time PCR (QRT-PCR). Til slutt, analyserer integrerende av miRNAs i sammenheng med genekspresjon og litteraturdata ble utført som et bevis på prinsippet om gyldigheten av microarray miRNA analyse i å få innblikk i den biologiske rollen disse miRNAs.
Resultater
Eksperimentell innstilling
for å markere påvirkning av prøven opprinnelse og studiedesign på oppnådde resultater, har vi gjort en beregnings sammenligning av uttrykk data fra fire microarray studier. Vi valgte data innhentet på en felles miRNA plattform, dvs. Agilent, fra de to miRNA plattform sammenligning studier (detaljer i tabell S1) som uttrykk data på humane prøver er offentlig tilgjengelig (GSE13860 [6] og E-mtab-96 [7] ) og fra to studier valgt som eksempler på eksperimentelle applikasjoner i en klinisk setting, dvs. profiler assosiert med tumorigenesis av prostata [12] og mage [13] kreft (GSE21036 og henholdsvis GSE28700,, detaljer i Fig.S1 legende). Som vist i fig S1, antallet DE mirnas og de tilhørende brette endringene er betydelig høyere i plattform analyse enn i profiler ser på tumorigenesis. Innføre en enhetlig og vilkårlig terskel (| log
2 ganger endring | 1), 88,5% (GSE13860) og 25,9% (E-mtab-96) av miRNAs stede i matriser ble uttrykt forskjellig i kryssplattform datasett; på den annen side, bare 6,9% (GSE21036) og 6,7% (GSE28700) av miRNAs ble identifisert som DE på samme terskel i de kliniske datasett.
Med disse lokalene, bestemte vi oss for å evaluere inter-plattformer reproduserbarhet i en klinisk setting ved å vurdere svulsten og de vanlige motstykke miRNA profiler i prøver fra ni pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon for tykktarmskreft (se tabell S2 for kliniske og patologiske egenskaper). RNA porsjoner fra disse prøvene ble hybridisert på fire microarray plattformer: Agilent SurePrint G3 menneskelige miRNA Microarray, Exiqon miRCURY LNA mikroRNA Array, Illumina Human_v2 mikroRNA uttrykk Beadchips, og Miltenyi miRXplore Microarray. Hovedtrekk i de fire plattformene er beskrevet i Tabell 1.
Det bør bemerkes at plattformen fra Illumina ble trukket tilbake siden mars 2010. Men vi bestemte oss for å ta det med i vår sammenligning på grunn av sin omfattende bruk i laboratorier over hele verden, inkludert de i vår Institute. Følgelig kan problemene løses i denne undersøkelsen være av interesse for brukerne av Illumina plattform for å bedre tolke sine resultater og for å muliggjøre en mer begrunnelsen bytte til en annen plattform.
Agilent, Exiqon, og Illumina arrays ble utført i en farge. Miltenyi ble hybridisert i to farger: vevsprøver ble merket med Hy5, og en syntetisk henvisning kjøpt av Miltenyi med Hy3. Siden den syntetiske referanse er designet på miRBase 9,2 og dekket bare en del av de mirnas tilstede på gruppene er utformet på miRBase 14,0, bare de Hy5 data ble vurdert og anvendt for å normalisere for å muliggjøre en mer direkte sammenligning med de andre tre plattformer.
Agilent, Exiqon, og Illumina plattform inneholdt prober utformet enten på virus miRNA sekvenser eller på antatte mirnas ennå ikke kommentert i miRBase, avledet fra litteratur og Next-Generation Sekvense studier. Siden disse sekvenser er tilstede bare i en plattform, de ble ekskludert fra analysene.
miRBase database er den primære lageret for alle miRNA sekvenser og kommentarer som brukes av alle produsenter for utforming av probene. Men hyppig oppdatering av miRBase resulterer i merknads problemer. For å unngå mulig bias, valgte vi arrays utformet på nære miRBase versjoner og probene av de fire testede plattformer ble utformet på hver v12.0 eller v14.0 miRBase. Vi bekreftet at navn og sekvenser av mirnas stede i v12.0 ikke endret i nyere miRBase versjon, mens et sett med nye miRNAs ble lagt. Forskjellen i antall miRBase kommentert miRNAs i de fire plattformene var relativt liten (6%).
Evaluering av Data Distribution og oppklaringsprosenten
Ikke-normalisert signal intensiteter viste en plattform avhengig fordeling som gjenspeiler den unike metoder utviklet av produsenter for merking, hybridisering stringens og datafangst (fig. 1a). For alle plattformer, signalene dekket det meste av det dynamiske området tilgjengelig for 16-bit skannere; Agilent, Exiqon, og Miltenyi signal distribusjoner tendens til å ha positiv skjevhet (en høyre side lang hale) og skilte seg fra Illumina fordelinger hvor mange flere sonder viste middels til høy uttrykk nivåer.
(A) global ikke-normalisert intensitet distribusjon. (B) Grafisk fremstilling av miRNA gjenkjenning; blå = oppdaget, gul = uoppdaget, grå = ikke til stede. (C) Box-plot av prosentandelen av GC-innhold i moden miRNA sekvenser; blå = oppdaget, gul = usett.
P
-verdier ble beregnet ved Students t-test.
For de Agilent og Illumina plattform, vi fulgte påvisning samtale kriterier anbefalt av produsentene. Illumina programvare gir en deteksjons
P
-verdi som estimerer i hvilken grad et signal er større enn støy representert ved negative kontroller; Tilsvarende gir Agilent programvare et flagg (gIsPosAndSignif) som estimerer hvis funksjonen signalet er positivt og viktig i forhold til bakgrunnen. I motsetning til de Exiqon og Miltenyi plattformer en deteksjonssamtalekriterier ble ikke definert; for disse plattformene, etablerte vi en terskel prosentandel av piksler for hvert sted i rekken hvis intensiteten var lavere enn bakgrunnen. Å ta hensyn til disse filtreringsprosedyrene, 675 (78% av miRBase annotert mirnas tilstede på matrisen), 775 (87%), 808 (94%) og 376 (41%) unike mirnas var detekterbare i det minste en av prøvene i Agilent, Exiqon, Illumina, og Miltenyi plattformer, henholdsvis (fig. 1B). Det var 233 mirnas som ble delt av alle plattformer, blir sterkt begrenset av den lave oppklaringsprosenten i Miltenyi plattformen.
For å anslå i hvilken grad GC innhold påvirket påvisning kall hver plattform, vi beregnet GC andel av mirnas analysert og sammenlignet, for hver plattform, GC-innhold mellom detekterte og uoppdaget mirnas. Til tross for hver produsent har justert probe design og hybridisering prosedyrer for å overvinne avvik i termodynamisk stabilitet av probe /target anerkjennelse, GC innholdet var signifikant høyere i oppdages enn i uoppdaget mirnas i alle plattformer, og denne forskjellen var spesielt tydelig for Miltenyi plattform (fig. 1C).
Normalisering og klasse Sammenligning Resultater
Flere normalisering og databehandling prosedyrer er tilgjengelige, mest oversatt av gen-uttrykk studier og med lite konsensus blant laboratorier. Tatt i betraktning de unike egenskapene til hver plattform, er det lite sannsynlig at det samme normalisering prosedyren kan utføre likt i alle plattformer å korrigere systematiske forskjeller.
For å velge den beste normalisering for hver plattform, vurderte vi muligheten av fire forskjellige metoder (løss, kvantilregresjoner, rang invariant, og Robust spline normalisering) for å redusere intra-klasse variasjon i normale og tumorprøver gjennom bruk av Relativ Logg Expression (RLE) (se fig. S2). Videre forventet vi at den beste normaliseringsfremgangsmåten bør øke fold endringer og antall differensielt uttrykte mirnas mellom tumor og normalt vev. Ifølge disse kriteriene, valgte vi RSN for Illumina og Agilent, løss for Exiqon og quantile for Miltenyi.
/normal klasse sammenligninger i de 4 plattformer, uttrykt I figur S3 svulsten som histogrammer av log
P
-verdi og FDR, er rapportert. Sammenligningen identifisert, ved en terskel
P
0,005, 29 mirnas som ble modulert på Agilent, 4 på Exiqon, 42 på Illumina, og tre på Miltenyi plattformen, tilsvarende 4,3%, 0,5%, 5,2 %, og 0,8% av miRNAs oppdaget, henholdsvis.
Inter-plattform-avtalen av klasse sammenligningsresultater
for å vurdere inter-plattform konkordans, undersøkte vi de mirnas som var dE på
P
0,005 i minst én plattform; ved å kombinere disse mirnas, ble en enighet liste over 68 miRNAs generert. Å markere samsvar mellom de fire plattformene,
P
-verdier og fold-endringer av konsensus liste mirnas er vist i en kolo skala i figur 2A og B henholdsvis. Pålegge en
P
0,005 på alle fire plattformer, ingen mirnas var vanlig DE. På
P
0,05, HSA-MIR-378, HSA-MIR-375, HSA-miR21 *, HSA-MIR-145 ble påvist som DE av alle plattformer og ytterligere 4 mirnas (HSA-MIR -96, HSA-miR21, HSA-miR147b, og HSA-MIR-143) var DE på alle bortsett fra én plattform; faktisk, på Miltenyi plattformen, HSA-MIR-96 og HSA-MIR-147b ble ikke oppdaget, mens HSA-MIR-21 og HSA-MIR-143 ikke nådde en betydelig terskel. Tolv, 2 og 25 mirnas ble funnet å være utelukkende DE på Agilent, Exiqon, og Illumina plattform, henholdsvis. De resterende 29 mirnas var DE i minst to plattformer. De fold endringene er konkordant tvers av plattformer med det eneste unntaket av to mirnas (HSA-MIR-218 og HSA-MIR-302A) som var DE på
P
0,05 i Illumina og Exiqon, men med uharmoniske fold forandrer punktets (fig 2B.)
(A)
P
-verdier på svulsten /normal klasse sammenligning visualisert i en blå-hvit varmekartet.; se skalaen på figuren. (B) Logg
2 fold endringer i tumor /normal klasse sammenligning visualisert i en rød-grønn varme kartet; rød = oppregulert; grønn = nedregulert i tumorer.
For å verifisere at det begrensede antall vanlige DE mirnas var ikke et resultat av normaliseringsmetoder, vi beregnet antall forskjellig uttrykt miRNAs i hver plattform og for hver av de fire normaliseringsfremgangsmåter. For 256 (= 4
4) mulige kombinasjoner, vi identifisert en liste over felles DE miRNAs. Unionen av alle disse listene samlet fire mirnas (HSA-MIR-378, HSA-MIR-375, HSA-MIR-145, HSA-MIR-21 *), noe som tyder på at ulike normaliserings metoder kan være verre enn eller, i beste fall, lik vårt valg (fig. S4A). Verdt å merke seg, blant de 4 vanligste mirnas HSA-MIR-378 ble identifisert i alle mulige kombinasjoner (fig. S4B).
Den samlede plattform sammenlignbarhet med hensyn til nøyaktighet og evne til å identifisere DE mirnas ble evaluert med fokus på henholdsvis på fold endringer og t-verdier oppnådd i svulsten /normal sammenligning for de 233 mirnas vanligvis oppdages av de 4 plattformer. Etter clustering analyse, ble det observert den beste korrelasjonen mellom log
2 fold endringer mellom Agilent og Exiqon (Pearsons korrelasjon = 0,63), mens Illumina viste mest forskjellig mønster og bredere fold endringer (Fig. 3A og s5a fig.). På samme måte, bare en delvis likhet i t-verdier (Pearsons korrelasjon, område = 0,28 til 0,48; gjennomsnitt = 0,40) er til stede mellom de 4-plattformer, men denne gangen Miltenyi viste den mest divergente atferd (figur 3B og fig.. S5b)
hierarkisk clustering (avstand = Pearson korrelasjon;. linkage = gjennomsnitt) av log2 kaste endringer (A) og t-verdier (B) som oppnås for hver plattform ved å sammenligne tumor og normale prøver i undergruppen av vanlig oppdaget miRNAs. t-verdier ble beregnet ved hjelp av en t-test med tilfeldig variasjon modell.
Inter-plattform avtalen ved hjelp av miRNA Stiller
Tidligere studier som sammenligner resultatene av genuttrykk microarray plattformer antydet at, til tross for en relativt lav overlapping mellom lister over DE gener ble oppnådd med forskjellige plattformer, var en god avtale finnes når man ser på biologisk knyttet gensettene i stedet for enkeltgener [14]. For å teste om lignende konklusjoner kan trekkes for miRNA microarray plattformer, utførte vi en miRNA satt berikelse analyse på våre data testing to serier av miRNA sett: 1) DE mirnas identifisert av hver plattform i vår studie for å evaluere deres berikelse blant opp eller nedregulert mirnas på de andre plattformene; 2) mirnas identifisert som opp- eller ned- regulert mellom tykktarmskreft og normal slimhinne i andre mikromatrisebaserte studier fra litteraturen (Tabell S3). De fleste av de miRNA settene identifisert av hver plattform er koherent anriket med data fra andre plattformer, med den Miltenyi miRNA sett som viser de nedre anrikninger (Fig. 4A). Videre er det store flertall av tykktarmskreft forbundet miRNA sett utledet fra litteraturen ble også bekreftet i våre data og, i det minste delvis uavhengig av den testede plattformen (fig. 4B).
Oppsummering av miRNA sett anrikning analysen utføres ved hjelp GSEA. Med uttrykket data oppnådd med de 4 forskjellige plattformer, testet vi berikelse av mirnas DE (når man sammenligner colorectal cancer og normal slimhinne) i vårt studium (A) eller rapportert i litteraturen (B). mirnas opp- eller nedregulert ble testet separat. For litteratur-avledet miRNA sett, granene forfatter og plattformen som brukes ble angitt (se også tabell S3). Falske funnrate mindre enn 5% eller 10% ble ansett som signifikant eller marginalt signifikant hhv.
Sammenligning med QRT-PCR data
Microarray data blir regelmessig validert av QRT-PCR. Ulike systemer er kommersielt tilgjengelig, og som pekte ut for microarray plattformer, QRT-PCR produsenter må slite med kontinuerlig oppdatering av miRBase merknader. Som en valideringsmetode, avhengig av tilgjengeligheten av utvalgte miRNA analyser på den tiden forsøkene ble utført, ble SYBR Grønn LNA essay fra Exiqon eller Applied Biosystems TAQMAN analyser brukt.
Vi har fokusert vår validering analyse på 18 mirnas som sammenfatte forskjellige situasjoner som finnes på plattformen sammenligning (tabell 2). Den 8 DE mirnas i minst 3 av 4 array-plattformene ble validert som betydelig DE ved QRT-PCR. For disse 8 mirnas, ble høye korrelasjoner mellom QRT-PCR og matrise uttrykk verdier og i parvise kontraster av Array data observert (Tabell 3 og Fil S1) med to unntak; i tilfelle av HSA-MIR-21 *, selv om QRT-PCR-data bekreftet den differensielle ekspresjonen finnes i alle matrise plattformer, ble dens korrelasjon med matrisedata begrenset (R koeffisient spekter 0,27 til 0,44); for HSA-MIR-21, hadde verdiene på Illumina ikke korrelerer med andre verdier oppnådd på arrays eller ved QRT-PCR. Dette siste avviket skyldes trolig Mir-21 expression verdier på Illumina som er nær metning i alle prøvene, og på grunn av dette, konsentrert i et begrenset område.
For å bedre forstå grunnlaget for dårlig overlapping av klasse sammenligning resultater i de fire plattformene, målte vi uttrykket av 10 ytterligere mirnas (Tabell 3 og Fil S1).
Seks av dem (HSA-MIR-136, HSA-MIR -139-5p, HSA-MIR-182, HSA-MIR-30a, HSA-MIR-497, og HSA-MIR-93) ble valgt blant 14 dE mirnas (
P
0,05) i henhold både Agilent og Illumina. Vi validert tabell data ved QRT-PCR for fem av disse 6 miRNAs, med relevant unntak av HSA-MIR-93. Korrelasjonskoeffisienter mellom QRT-PCR og enten Agilent eller Illumina data varierte 0,65 til 0,87 for HSA-MIR-136, HSA-MIR-139-5p, HSA-MIR-30a, og HSA-MIR-497; for HSA-MIR-182, som probe intensiteter på Illumina var på middels nivå og DE på
P
0,005 og på Agilent var nær til bakgrunnen og DE på
P
0,05 var 0,86 og 0,48 kroner.
To andre mirnas, HSA-MIR-886-5p og HSA-MIR-886-3p, valgt for QRT-PCR validering var konkordant i to av de fire plattformene. Differensial uttrykk for HSA-MIR-886-5p, DE på Illumina og Miltenyi plattformer, ble bekreftet av RT-qPCR, mens, at av HSA-MIR-886-3p, DE på Miltenyi og Agilent plattformer, ikke synes å være DE ved QRT-PCR.
til slutt valgte vi to mirnas (HSA-MIR-218 og HSA-MIR-302A) som var DE på Exiqon og Illumina plattform, men med motsatt fold endringer. HSA-MIR-218 redusert ekspresjon i tumorer på Illumina ble bekreftet ved QRT-PCR mens det av HSA-MIR-302a ble ikke validert ved hjelp QRT-PCR.
i sanntid PCR-data er vanligvis brukt for å bestemme følsomheten og spesifisitet av data innhentet med mikromatriser. Til dette formål, sammenlignet vi våre resultater til de som ble oppnådd i en uavhengig publisert QRT-PCR studie, der 70 av 665 unike mirnas testet ble funnet forskjellig uttrykt i 40 sammenkoblede normal-tykktarmskreft prøver [15]. For hver plattform valgte vi mirnas stede i qPCR datasett (527 for Agilent, 596 for Illumina, 545 for Exiqon og 278 for Miltenyi) og beregnet ROC kurver ved hjelp av ulike terskler for
P
-verdi. (Fig. 5). Verdiene av arealet under ROC kurven (AUC) viste at Agilent og Illumina er svært like og er de mest nøyaktige plattformene mens Miltenyi er mindre resultater.
Vurderer som gullstandarden de mirnas identifisert som forskjellig uttrykt i en qPCR studie på 40 parvise tumor normal prøver, evaluert vi resultatene for hver plattform beregne sensitivitet og spesifisitet på ulike terskler for
P
-verdi og plotte de resulterende verdiene i ROC plass.
biologisk Insight
Når 68 mirnas dE på
P
0,005 i minst ett av de fire plattformene ble sammenlignet med litteraturdata, fant vi at 25% av dem var concordantly beskrevet i litteraturen som deregulert i kolorektal cancer i forhold til den ikke-tumor motstykke (tabell S4). Videre fant vi at 12 mirnas tilhører kjente co-uttrykt familie klynger. De viktigste biologiske data knyttet til de fire miRNA klynger er rapportert i tabell 4. Ser på deres uttrykk vi observert at: for MIR 25-106b klynge, bare HSA-MIR-25 og HSA-MIR-93 er til stede i listen over 68 mirnas på tersklene vi har anvendt; Mir 182-96 klyngen er særlig tydelig i Illumina hvor HSA-MIR-182, -182 *, -183 og -96 er blant de mest up-regulerte mirnas i denne plattformen (fold endringer svulst vs normal spenner 4,42 til 2,65 ); miRNA klyngen 143-145 er sammenhengende deregulert i alle de fire plattformer av vår studie, som HSA-MIR-143 den mest nedregulert miRNA i tumorvev på Exiqon plattform (endring svulst vs normal svulst = 0,30; p = 0,036) og HSA-MIR-145 den mest nedregulert i Agilent og Miltenyi (endring svulst vs normal = 0,30 og 0,35; p = 0,0027 og 0,018 henholdsvis).
genuttrykk profiler av de samme prøvene analysert av miRNA uttrykk arrays var tilgjengelig. Derfor vurderte vi en integrasjon tilnærming for å vurdere om tilsvarende biologisk informasjon kan hentes fra de fire plattformer, uavhengig av overlapping i DE miRNAs. Til dette målet, ved hjelp av MAGIA verktøy, negativt korrelert antatte målgener av DE mirnas ble identifisert i hver plattform (File S2) og en berikelse analyse ble utført av IPA programvare. For å markere samsvar mellom de fire plattformene, berikelse
P
-verdier for alle kreftrelaterte veier betydelig anriket på minst én plattform er vist i en kolo skala i figur 6A. Pathways knyttet til cellesyklus regulering og PTEN signale ble concordantly identifisert. Når vi så på validerte mål ved TarBase programvare, antall miRNA-mRNA interaksjoner negativt korrelert på p 0,05 var svært begrenset (Agilent = 35, Exiqon = 2, Illumina = 45 og Miltenyi = 0) utelukker en sammenligning på tvers av de fire plattformene .
(A) Pathway berikelse analyse av anti-korrelert spådd målgener av forskjellig uttrykt mirnas henhold til hver microarray plattform. (B) Nettverk mellom de 8 beste forskjellig uttrykt mirnas og deres anti-korrelerte målgener. De 250 topp interaksjoner ble brukt til å generere nettverket med MAGIA verktøy.
Videre ved å vurdere QRT-PCR data av de 8 mest samstemmige mirnas og genuttrykk profiler samme integrasjon tilnærming identifisert en totalt 803 miRNA-negativt korrelert genet (spådd som miRNA mål) interaksjoner (File S2). Den grafiske fremstillingen av de beste 250 interaksjoner fremhevet at mange gener som ble oppregulert i tumorer er spådd mål på to eller flere nedregulert mirnas (Fig. 6B). I detalj, er det 70 gener co-rettet ved hjelp av minst to mirnas og 84% av dem er regulert av MIR 143-145 klyngen (tabell S5). Blant disse genene de som er relatert til glykolyse og næringstransportveier virket overrepresentert.
Diskusjoner
Til tross for sin relativt nylige oppdagelsen, det er en raskt voksende interesse for studiet av den rollen miRNAs i mange patologiske prosesser, inkludert kreft. Følgelig høy gjennomstrømning teknologi, opprinnelig utviklet for GW genekspresjon evaluering, ble raskt tilpasset GW måling av miRNAs. Men som uthevet i siste vurderinger [5]; [16]; [17], flere faktorer, blant annet kort miRNA lengde, høy grad av homologi i miRNA familier, den høye frekvensen av nye miRNA identifikasjon (det faktiske antall miRNAs i miRBase 18, utgitt i november 2011 nærmer seg to tusen) og den relativt høye prosent (ca. 10%) av gjenstands mirnas ikke er bekreftet ved eksperimenter resequencing, komplisere deres analyse. Virkningen av disse faktorene på de ulike metoder som brukes av produsenter av ulike tilgjengelige plattformer må vurderes i inter-plattform sammenligning studier.
Problemene med intra- og inter- microarray plattform reproduserbarhet har i hovedsak vært rettet ved hjelp av eksperimentelle innstillinger hvor vev eller cellelinjer av forskjellig opprinnelse er sammenlignet, med den forutsetning at, på grunn av det store området av forventede ekspresjon moduleringer av en slik sammenligning kan teknisk støy bli ubetydelig. Denne typen tilnærming speiles den fulgt i sin første fase studie av microarray Quality Control (MAQC) konsortium, med formål å vurdere inter-plattform og inter-laboratorium reproduserbarhet av gen-uttrykk microarray data ved hjelp av to ulike RNA (menneskelige hjerne og en universal human referanse) [18]. Denne tilnærmingen ble sterkt avhørt i 2007 for sin mangel på konsistens med ekte forskningsmiljøer [19]. Men i de fleste av miRNA inter-plattform sammenligning studier, sitert i Aldridge Hadfield [16] og rapportert i tabell S1, eksperimentell design er forspent mot bruk av prøver med sterk forskjell i opprinnelse. Bemerkelsesverdig, bare to studier [7]; [10] i forhold miRNA profil av biologiske meningsfulle prøver på, i det minste tre forskjellige plattformer, men selv i disse tilfellene prøvene er cellelinjer. Dermed representerer vår studie første forsøk på å sammenligne miRNA plattform ytelse i en klinisk setting, der den inter-sample variasjon innenfor samme klasse er forventet å være høyere enn i cellelinjer.
De fleste profilerings studier med kliniske prøver med sikte på å avsløre selv små forskjeller i ekspresjon, men som er forbundet til en spesifikk klinisk sammenheng. I disse innstillingene, tekniske replikater er ofte ikke mulig på grunn av RNA kvantitet og økonomiske hensyn. Derfor, i denne studien rettet vi spørsmålet om inter-plattformen sammenligning bruker samples som tilhører to klasser (paret tumor og normal kolon vev) som teoretisk kan føre til ny innsikt i tumorbiologi og kliniske applikasjoner. Våre data, generert ved å profilere de samme vev-avledede total RNA ved hjelp av fire forskjellige miRNA array-plattformer, viste liten overlapp mellom plattformer med unntak av et begrenset antall mirnas hvor det ble observert meget høy korrelasjon. [25]. RNA ble ekstrahert ved hjelp av miRNeasy Mini kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble 800 ng av total RNA ble revers transkribert, merket med biotin og forsterkes over natten (14 timer) ved anvendelse av Illumina RNA TotalPrep Amplification Kit (Ambion, Austin, Texas, USA) i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
