Abstract
Avanserte menneskelige skjoldbrusk kreft er tett infiltrert med tumor-assosiert makrofager (TAM), og dette korrelerer med en dårlig prognose. Vi brukte
BRAF
indusert papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC) musemodeller for å undersøke hvilken rolle TAMs i PTC progresjon. Etter betinget aktivering av
BRAF
V600E
i murine thyroids er det en økt uttrykk av TAM chemoattractants
Csf-1 Hotell og
Ccl-2
. Dette etterfølges av utviklingen av PTCs som er tett infiltrert med TAMs som uttrykker
Csf-1R Hotell og
CCR2
. Målrette CCR2-uttrykke celler i løpet av BRAF-induksjon redusert TAM tetthet og nedsatt PTC utvikling. Denne strategien også indusert mindre svulster, redusert spredning og restaurert en skjoldbruskkjertelen follikulær arkitektur i etablerte PTCs. I PTCs fra mus som manglet CSF-1 eller som fikk en c-FMS /CSF-1R kinase inhibitor, TAM rekruttering og PTC progresjon ble svekket, recapitulating effektene av målretting CCR2-uttrykke celler. Våre data viser at TAMs er pro-tumorigen i avanserte PTCs og at de kan være målrettet farmakologisk, som kan være potensielt nyttig for pasienter med utbredt skjoldbrusk kreft
Citation. Ryder M, Gild M, Hohl TM, Pamer E, Knauf J, Ghossein R, et al. (2013) Genetisk og Farmakologisk målretting av CSF-1 /CSF-1R Hemmer Tumor-Associated Makrofager og svekker BRAF-Induced skjoldbrusk kreft progresjon. PLoS ONE 8 (1): e54302. doi: 10,1371 /journal.pone.0054302
Redaktør: Marian Ludgate, Cardiff University, Storbritannia
mottatt: 26 september 2012; Godkjent: 10 desember 2012; Publisert: 23 januar 2013
Copyright: © 2013 Ryder et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet har blitt finansiert delvis av K08 CA133183 og amerikanske Thyroid Association THANC award (MR), K08 AI071998 (TMH), RO1 CA50706 og R01 CA72597 (JAF), den Lefkovsky Family Foundation og Byrne fondet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tumorassosierte makrofager (TAM), har kapasitet til å hindre (M1 type) eller fremme (M2 type) tumorigenesis [1]. Observasjonen at økt tetthet av TAMs korrelerer med dårlig klinisk utfall hos flertallet av kreft hos mennesker antyder TAMs er pro-tumorigent [2] – [5]. Videre gen signaturer fra stroma av menneskelig brystkreft avledet fra pasienter med dårlig resultat er uavhengige prognostiske markører og inneholder flere høyt uttrykte TAM-relaterte gener [6]. Direkte bevis på rollen til TAM i tumorgenese er observert i brystkreft musemodeller som kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1) -avhengig TAM rekruttering kreves for startfasen gjennom stimulering av tumor angiogenese [7]. Ved metastaser, CCR2
+ inflammatoriske makrofager (Mii) letter brystkreft celle bloduttredelse, seeding og vekst [8].
Multi-stage murine modeller av tumorigenesis er ideelt egnet til å undersøke den funksjonelle rollen stromal celler på startfasen og progresjon. Det beste kjennetegnet av disse er RIP1-Tag holmen cell carcinoma [9] og polyoma midtre T-antigen (PyMT) brystkreft modeller [10]. Disse har gitt verdifull informasjon, men kanskje de ikke er genetisk nøyaktige recapitulations av drivkreftene tumorigenesis i disse celletypene. Onkogene mutasjoner av
BRAF
er de vanligste genetiske hendelser i melanomer [11] og papillær skjoldbrusk kreft (PTC) [12], [13], og antas å være involvert i tidlige stadier av svulst utvikling, som de er til stede i godartet nevi [14] og micropapillary thyroid-kreft [15], respektivt.
BRAF
mutasjoner er også svært utbredt i avanserte former for skjoldbruskkjertelkreft [16], og er forbundet med økt dødelighet [17]. Interessant, en økt tetthet av TAMs korrelerer med lymfeknutemetastaser i PTCs [18] og invasiv sykdom og redusert overlevelse i dårlig differensierte skjoldbrusk kreft (PDTC) [4]. Faktisk TAMs omfatte minst 50% av tumorvolumet i de fleste anaplastiske thyroid kreft (ATC), en svært virulent form for sykdommen som er nesten alltid dødelig [4], [19], [20].
flere muse genetiske modeller av
BRAF
-indusert kreft har blitt utviklet, enten ved aktivering av latente endogene mutant alleler [21], [22], eller gjennom skjoldbruskspesifikke overekspresjon [23]. Alle viser høy penetrans av skjoldbruskkjertelen, og progresjon til dårlig differensierte svulster. Videre betinget aktivering av BRAF i murine thyroids induserer PTC som er helt snudd på de-induksjon av BRAF [24].
I denne studien, viser vi at aktivering av onkogen BRAF i murine thyroids resultater i økt uttrykk av chemoattractants CSF-1 og 2CCl og at dette er forbundet med en rask og robust rekruttering av TAMs som uttrykker de beslektede reseptorer
Csf-1R Hotell og
CCR2
hhv. Selektivt rettet mot CSF-en eller CCR2-uttrykke celler i løpet av BRAF aktivering betydelig redusert TAM tetthet og nedsatt PTC utvikling og progresjon. Uttømming av TAMs under tidlig PTC utvikling svekket stromal utvidelse av kreft-assosiert myofibroblasts (kafeer). I etablerte PTCs, svulster utvikle høy celle og dårlig differensiert brennpunkter, som er histologiske trekk som er karakteristiske for avanserte menneskelige skjoldbrusk kreft. Målrette CCR2-uttrykke celler i mus med avanserte PTCs resulterte i en redusert TAM tetthet samt mindre, mer differensiert skjoldbrusk kreft med færre foci av høye celler og dårlig differensierte områder. Farmakologisk målretting av BRAF-indusert PTCs med en selektiv c-FMS /CSF-1R kinase inhibitor rekapitulert effektene av målretting CCR2-uttrykke celler. Disse dataene antyder at terapeutiske strategier rettet mot TAMs kan være gunstig i denne sykdommen, og kanskje forbedre effekten av kinase hemmere rettet mot cellestyrte onkogene driverne av sykdommen.
Materialer og metoder
Mus modeller
følgende to modeller av
BRAF
indusert skjoldbruskkjertelkreft ble brukt i denne studien:
1) Tg-rtTA- /Teto-BRAF
V600E
mus uttrykke onkogene BRAF
V600E i skjoldbrusk celler i en DOX-avhengig måte, og ble opprettholdt i en FVB /N bakgrunn [24]. 2)
Tg-BRAF
transgene mus som uttrykker den humane oncoprotein under kontroll av bovint thyroglobulin-genpromoteren [23].
CCR2-DTR Hotell og
CCR2-GFP
mus uttrykke DTR eller grønt fluorescerende protein (GFP), henholdsvis under kontroll av monocytt /Mø spesifikke
CCR2
genpromoteren, og ble opprettholdt i et C57 /B6 bakgrunn [25].
Csf-en
– /-
mus (Jackson Lab, Bar Harbor, ME) er mangelfull i sirkulerende og vev monocytter /Mii [26], [27]. Alle husdyrhold og eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Memorial-Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og bruk komité.
Nedbryting av TAMs i BRAF-indusert tyreoideakreft musemodeller
Macrophage laget i benmarg (BM), blod, milt og bukhulen ble undersøkt i
CCR2-DTR
mus etter behandling med difteri toksin (DT) 20 ng /g (Liste Biologicals, Campbell, CA) intraperitonealt (ip) på alternerende dager i 7 dager. Tjuefire timer etter siste dose av DT, ble musene avlivet av CO
2 innånding og vevsprøver oppnås for flowcytometri og /eller immunhistokjemi (IHC) som beskrevet nedenfor.
For å vurdere virkningene av TAMs på PTC utvikling,
Tg-rtTA- /Teto-BRAF /CCR2-DTR
mus ble matet DOX-impregnert chow (2500 ppm, Harlan-Teklad) i 7 dager med eller uten DT ip på alternerende dager begynner på dag 0. På dag 7 (24 timer etter siste dose av DT), ble musene avlivet av CO
2 innånding og thyroids hentet for IHC. For å undersøke hvilken rolle TAMs i etablerte BRAF-induced skjoldbrusk kreft vi behandlet
Tg-BRAF /CCR2-DTR
mus på ca 6 og 12 ukers alder med eller uten DT på alternerende dager for 10 dager. Musene ble avlivet og thyroids hentet 24 timer etter siste dose med DT for flowcytometri og IHC.
FACS Analyse
Sammenslåtte thyroids ble høstet etter intrakardiell PBS perfusjon å utarme sirkulerende leukocytter. Thyroids ble hakket opp i små fragmenter, etterfulgt av enzymatisk nedbrytning til enkeltcellesuspensjoner med kollagenase type 2 (Worthington, Lakewood, NJ) og dispase (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 90 minutter i en rysteinkubator ved 37 ° C. Prøvene ble så vasket tre ganger med is-kald media supplert med 10% FBS, etterfulgt av oppløsning i FACS-buffer (PSB /1% BSA). Prøvene ble blokkert med musen Seroblock FcR (ABD Serotec, Raleigh, NC) i 10 minutter på is etterfulgt av en 30 minutters inkubasjon med følgende fluorescently konjugerte antistoffer: CD45: PerCP Cy5.5, CD11b: APC, Gr-1: FITC, Ly6C: FITC, Ly6G: FITC (BD Pharmingen, San Diego, California) F4 /80: FITC (ABD Serotec). Enkeltcellesuspensjoner av BM aspirates ble blodprøver som ble ryddet av røde blodceller og peritoneal LAVAGES blokkert og merket som ovenfor. Datainnsamlingen ble innhentet ved hjelp av FACS Caliber flowcytometer gjennom MKSCC Flow Core og dataanalyse ble utført ved hjelp FlowJo 7.2.5 programvare.
TAMs fra skjoldbrusk kreft
TPO-Cre /LSL-BRAF
mus som uttrykker endogene nivåer av BRAF
V600E [21], ble sortert med CD11b. APC fra skjoldbrusk enkelt cellepreparater som beskrevet ovenfor
immunfluorescens /Immunohistochemistry (IHC)
for immunfluorescens seriesnitt ble hentet fra Dypfryst, oktober-innvevde thyroids og /eller milt. Thyroid 5 mikrometer seksjoner fra minst 3-4 nivåer, hver ~150 mikrometer fra hverandre, ble oppnådd. Platene ble lufttørket, fiksert med iskald aceton i 30 minutter og tørket på nytt og deretter plassert i PBS. Seksjonene ble blokkert med DakoCytomation serumfritt protein blokken (Dako, Carpinteria, CA) i 30 minutter etterfulgt av PNB blokkerende reagens (Perkin Eimer, Waltham, Massachusetts) i 60 minutter. Følgende mus primære, konjugerte antistoffer ble brukt: CD11b, Cd68 og αSMA fulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer av enten Alexa-Fluor 488 eller Alexa-564. Snittene ble fotografert på en oppreist Zeiss Axio2Imaging mikroskop på MSKCC Molekylær Cytologi Kjerne Facility.
For IHC, ble thyroids fast over natten ved 4 ° C med frisk 4% paraformaldehyde bruker kontinuerlig rotasjon. Vevene ble vasket med 2 sykluser av 30 min PBS inkubasjoner og deretter plassert i 70% etanol. Vev ble behandlet i parafininnstøpte blokker fulgt av serie snitting. Etter deparaffinization, H E og immunostains ble utført enten manuelt (Laboratory of Comparative Pathology) eller automatisert (Molecular Cytologi Kjerne Facility) med en Discovery XT-prosessor (Ventana Medical Systems). Følgende antistoffer ble brukt: Ki67 (VP-K451, Vector Laboratories), perk (# 9101, Cell Signaling Technology), Mac-2 (# CL8942B, Cedarlane), alfa glatt muskulatur aktin (αSMA) (# M0851, Dako) og Iba-1 (katt # 019-19741, Wako). TUNEL assay ble utført som tidligere beskrevet [24]. Bilder ble digitalisert med Mirax Scan med Carl Zeiss (Tyskland). Kvantifisering av Ki67, TUNEL og Iba-en farging ble utført i Molekylær Cytologi Kjerne Facility bruker hele skjoldbruskkjertelen digitaliserte bilder og Metamorph programvare. Fargen terskel-verktøyet i Metamorph ble anvendt for å identifisere DAB signal og disse terskelverdiene ble påført i en automatisert-satsvis måte til alle prøver for hvert antistoff. En% positiv område ble beregnet ved hjelp av et Excel-regneark og plottet ved hjelp GraphPad Prism 5.0.
kvantitativ real-time PCR
RNA ble ekstrahert fra flash frosset thyroids og sortert TAMs bruker RNA PrepEase kit (USB Corporation, Cleveland, OH) og cDNA ble generert ved hjelp SuperScriptIII og tilfeldige heksamer (Invitrogen). Kvantitativ-PCR ble utført ved hjelp av primere som er oppført i Tilleggs Tabell 1.
Behandling av mus med GW2580, en c-FMS /CSF1-R kinase inhibitor
Tg-rtTA- /Teto -Braf
mus mellom 6-8 ukers alder ble behandlet med DOX i vannet på 5 mg ml -1 med 5% glukose i 7 dager samtidig med enten bil eller GW2580 (PLX6134) impregnert chow (gitt av Plexxikon, Inc ). Thyroids ble høstet på dag 7 for IHC som beskrevet ovenfor.
Statistiske analyser
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism versjon 5.00 for Windows, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad com. Statistiske analyser ble generert ved hjelp uparede to tailed t-tester av gjennomsnittet og standardavvik.
Resultater
Betinget aktivering av BRAF i thyroids av voksen mus induserer PTCs som er tett befolket med TAMs og kafeer
Vi brukte en musemodell for DOX-induserbar onkogene BRAF aktivering i skjoldbruskkjertelen follikulære celler,
Tg-rtTA- /Teto-BRAF
V600E product: [24], for å måle TAM rekruttering og karakter TAM fenotype i BRAF-indusert PTCs. I fravær av DOX, har tyroideavev en normal histologi, og det er få fastboende vev Mii, som bestemt ved FACS med F4 /80 (Fig. 1A). Syv dager etter induksjon med BRAF DOX, mus utvikler PTCs som er invasiv og har en høy mitotisk indeks [24]. Dette er ledsaget av en robust rekruttering av TAM. Som vist på fig. 1B, er omtrent 50% av cellepopulasjonen fra PTCs av DOX-induserte mus som består av CD45
+ leukocytter. De fleste av disse er F4 /80
+, CD11b
+ TAMs (Fig. 1C, D, E). De TAMs danner et tett nettverk som omgir reder av skjoldbruskkjertelen follikulære celler (fig. 1F, I), så vel som innenfor skjoldbruskkjertelen kapsel (ikke vist). Sprikende tett med TAMs innenfor tumor stroma er en tett bestand av kafeer (Fig. 1 G, H). Dette er forskjellig fra TAM, som vist i Figur 1I av dual label immunfluorescens med antistoffer mot CD11b og αSMA.
FACS analyse av skjoldbruskkjertelen vev fra T
g-rtTA- /Teto-BRAF
V600E
mus, i fravær (A) eller nærvær av DOX (B-E). A, villtype thyroids har en lav overflod av bosatt vev Mø målt ved anti-F4 /80. Syv dager etter DOX, ~ 50% av cellene er CD45
+ leukocytter (B), som befinner F4 /80 + og CD11b + (C-D). De fleste TAMs co-express F4 /80 og CD11b (E). FACS-analyser ble utført på sammenslått villtype (ikke DOX: n = 6) og DOX-indusert (n = 4) thyroids. F) IHC flekk av representative frosne delen av DOX-indusert tyroideavev med anti-Cd68
+ (rød flekk) og DAPI (blå) viser tett farging av TAMs rundt thyroid follikkelcelleadenom reir (asterix). G) IHC med anti-αSMA + (brun flekk) viser sterk farging (piler) mellom reder av kreftceller (Asterix). H) Immunofluorescent farging med vimentin (grønn) er lik som αSMA (G, I), i overensstemmelse med en tett CAF stromal rommet. I) Dual etikett immunofluorescens med anti-CD11b (rød) og anti-αSMA (grønn) viste ikke ko-lokalisering, i samsvar med tilstedeværelsen av to ulike celletyper (TAM og kafeer, henholdsvis). F, H) §§ ble co-farget med DAPI (F, H: 20 x forstørrelse, G: 10 × forstørrelse)
BRAF aktivering fører til en rask økning i uttrykket av pro-tumorigent. /M2 typen Mii chemoattractants
CSF-1 /CSF-1R og CCL2 (MCP-1) /CCR2 signalisering i murine bryst og bukspyttkjertelen nevroendokrine kreft induserer TAM rekruttering og en pro-tumorigen M2-lignende fenotype [28] , [29]. En uke etter DOX induksjon i
Tg-rtTA- /Teto-BRAF
V600E
mus, var det en 250 og 20.000 ganger økning i
Csf-1 Hotell og
c-fms /Csf-1R
mRNA, henholdsvis (fig. 2). Den enorme økningen i
Csf-1R
uttrykk gjenspeiler trolig rikelig TAM rekruttering, siden vi vise at BRAF-indusert murine PTC celler ikke uttrykker denne reseptoren (Fig. S1). Uttrykk for
2CCl Hotell og dens reseptor
CCR2
ble også økt, men i mindre grad (~4 ganger) (fig. 2). Den økte ekspresjon av de to kjemokiner ble øket i den ikke-TAM cellepopulasjon, består hovedsakelig av skjoldbruskkjertel follikulære celler (Fig. S1). Dette er i tråd med tidligere studier som viser at BRAF induserer uttrykk for Mo chemoattractants i PCCL3 celler, en rotte i skjoldbruskkjertelen follikulær cellelinje [30]. Disse dataene tyder på at etter BRAF aktivering, thyrocytes uttrykke CSF-1 og CCL2, som er forbundet med rekruttering av TAMs uttrykker deres respektive reseptorer.
Kvantitativ RT-PCR for de angitte kjemotiltrekkende midler og deres respektive reseptorer i skjoldbruskkjertelen vevsekstrakter fra T
g-rtTA- /Teto-BRAF
V600E
mus uten (ingen DOX) eller 7 dager etter DOX. Expression nivåer ble normalisert til
β-aktin
. Stolper representerer middelverdien + SD fra thyroids av ikke DOX (n = 4) og 7-dagers DOX-indusert (n = 7) mus. *** P. 0,001
Selektiv uttømming av TAMs i PTCs av Tg-rtTA- /Teto-BRAF
V600E mus svekker PTC initiering og forsinker stromal utvidelse av kafeer
for å undersøke den funksjonelle rollen TAMs på PTC utvikling, vi krysset
Tg-rtTA- /Teto-BRAF
V600E
med
CCR2-DTR
mus, som uttrykker difteri toxin reseptor (DTR) under kontroll av den
CCR2
genpromoteren [31]. Benmarg avledet monocytter (BMDM) forløpere krever CCR2 signalering for å avslutte marg [31]. Perifer Mø uttrykker ikke CCR2, unntatt under forskjellige betennelsestilstander [32], [33]. Som vist på fig. S2A-B, BM og blod
CCR2-DTR
mus behandlet med DT etter en uke hadde en reduksjon i Ly6C + monocytt-forløpere (fig. S2A) så vel som i CD11b
+ og F4 /80
+ sirkulerende monocytter (fig. S2B). Hørende peritoneal og milt Mii (fig. S2C, G) også viste en fullstendig og /eller partiell reduksjon i Mii tetthet (fig. S2E, H), respektivt. Dette ble fulgt av et skifte i Gr-1 + myelomonocytes forløpere fra BM (Fig. S2A) og sirkulasjon (Fig. S2B) i perifere områder (Fig. S2F).
neste behandlet
Tg -rtTA /Teto-BRAF
V600E /CCR2-DTR
mus med DOX i 7 dager og med DT ved IP-injeksjon på dag 0, 3 og 6. Som vist i figur 3A, dette resulterte i en nesten fullstendig tømming av TAMs i svulsten stroma. Histologisk dette ble fulgt ved reduksjon i tumormasse med i det minste en delvis gjenopprettelse av skjoldbruskkjertelen follikulær arkitekturen (Fig. 3B). Celleproliferasjon, målt ved Ki67-farging ble merkbart redusert, noe som var mest tydelig i den peri-tumorale og peri-follikulære stromal kamre (Fig. 3C). Siden kafeer og TAM er hovedcelletyper innen stroma, hypoteser vi at reduksjonen i spredning skyldes først og fremst en effekt på TAMs og /eller kafeer. Faktisk, som vist i figur 3D og E, i fravær av TAMs, vi har observert en dramatisk reduksjon i αSMA positiv farging i tumoren kapsel så vel som inne i skjoldbruskkjertelen mellom reirene til follikulære celler. Behandling med DT ikke påvirke BRAF-indusert MAPK-aktivering, som bestemt ved IHC med fosfo-ERK (fig. S3). Vi gjentok disse studiene ved hjelp av en annen modell av betinget TAM mangel (
CD11b-DTR
). Vi observerte en reduksjon i TAM og αSMA
+ kafeer etter behandling av
Tg-rtTA- /Teto-BRAF
V600E /CD11b-DTR
mus med DOX i 7 dager + DT, som beskrevet ovenfor ( data ikke vist). Derfor Mii utarming under BRAF-indusert startfasen resulterer i en dyp ombygging av svulsten stroma, preget av uttømming av kafeer.
Representative seksjoner fra T
g-rtTA- /Teto-BRAF
V600E /CCR2-DTR
mus behandlet med DOX i 7 dager med eller uten intraperitoneal DT hver annen dag: A) IHC med anti-Mac-2 viser tett brune flekker inne i stroma som omgir thyroid kreft follikulære celler i kontroll PTCs (
forlot
) som er betydelig svekket i DT-behandlede mus (
midt
). B) PTCs fra DT-behandlede mus er mindre og har en mer bevart follikulær arkitektur. C) IHC med Ki67 viser redusert celleproliferasjon, i hovedsak innenfor det stroma, av PTCs fra DT-behandlede mus. D, E) IHC med αSMA viste redusert positivitet i svulst kapsel og intertumoral stroma. E) Høyere forstørrelse (40 ×) viser markant fortynning av svulst kapsel og utarming av αSMA positive celler i inter-tumor områder av DT-behandlede mus. F) søylediagram som viser endringer i Mac-2, αSMA og Ki67 i kontroll (n = 5) vs DT-behandlet (n = 6) mus. *** P 0,001, * p. 0,01
PTCs av Tg-BRAF mus er sterkt infiltrert av betennelses, M2 polarisert TAMs
Vi snudde ved siden av en musemodell for etablert PTC, for å undersøke hvilken rolle TAMs i tumor vedlikehold og progresjon.
Tg Anmeldelser –
BRAF
musemodell tett rekapitulerer avanserte menneskelige BRAF mutant PTCs, ved at kreftcellene fremviser karakteristiske høye cellefunksjoner [23], og fremgangen til PDTC [23], [34 ]. Som vist på fig. S4, Cd68
+ (Fig. S4A), F4 /80
+ (Fig. S4B) og CD11b
+ (Fig. S4C) TAMs omringe og tungt infiltrere PTCs av 6-12 uker gammel
T
g-
BRAF
mus. For å avgjøre om CCR2
+ TAMs bidra til denne cellen befolkningen, genererte vi
Tg-BRAF /CCR2-GFP
mus. I vill type
CCR2-GFP
mus, er det få CCR2-GFP
+ bosatt Mii (Fig. S4D), mens i
Tg-BRAF /CCR2-GFP
dyr, ca. 20% av den totale cellepopulasjon er sammensatt av CCR2-GFP
+ TAMs at co-uttrykte CD45
+ (fig. S4 E, F).
neste fastsatte fenotypen til TAM erholdte fra etablerte murine PTCs (8 til 15 ukers alder) ved å sammenligne de mRNA nivåer av M1 vs M2-relaterte gener i forhold til murine BMDM (fig. S4G). Anriking av TAMs sortert fra PTC enkeltcellesuspensjoner ble bekreftet av høy uttrykk for
Csf-1R
, som var sammenlignbar med BMDMs. Uttrykk for de M2-relaterte gener
CCR2
,
arginase1
,
Ccl22 og IL-10
var høyere i TAMs forhold til BMDMs. I motsetning til M1-spesifikke markører
IL-12 Hotell og
ROS
ikke var signifikant forskjellig mellom disse cellepopulasjoner (Fig. S4G).
Selektivt reduserende TAMs under avanserte stadier av PTC induserer tumor regresjon: Våre data viser at murine PTCs er infiltrert av M2 polarisert TAMs
neste generert
Tg-BRAF /CCR2-DTR
mus for å undersøke hvorvidt TAMs er nødvendig for svulst vedlikehold . Behandling av mus med DT i 10 dager resulterte i en 4-8 gangers uttynning av TAMs (fig. 4A, B, C, D, E, F). Det var en liten samtidig økning av GR1
+, Ly6G
+ celler, i samsvar med tumor-infiltrerende nøytrofile (bokser) (fig. 4D, E, F). TAM uttømming var forbundet med en ~ 50% reduksjon i tumorvekt (18 +/- 3 33 +/- 7 vs. mg i DT vs kontroll, p = 0,0002, Fig. 5A, B). Dette var forbundet med en reduksjon av 30% Ki67-farging (0,54% /mm
2 vs. 0,77% /mm
2 i DT vs kontroll, p = 0,04) (figur 5C, F.), Og en 4- gangers økning i tunel + celler (fig. 5 D, F), primært innenfor områdene infiltrert av TAM. Selv om den totale blodåre tettheten var lavere i TAM-utarmet PTCs sammenlignet med kontroll PTCs (Fig. 5E), dette var ikke statistisk signifikant når korrigert for tumorområdet. Avanserte scene PTCs i kontrollmusene hadde fremtredende papillær strukturer med en rekke brennpunktene høye celler (Fig. S5a) og PDTC foci (Fig. S5b). Behandling av 6-12 uker gamle Tg-
BRAF Twitter /
CCR2-DTR
mus med DT i 10 dager resulterte i skjoldbruskkjertelen med en dominerende follicular arkitektur som består av kolloid holdig follikler, med færre tall celler og PDTC kreft reir (fig. S5C, D).
representant IHC med Iba-1 i PTCs av kontroll (A) og DT-behandlet (B) mus. C) Kvantifisering av Iba-1 positivt flekker celler fra skjoldbrusk deler av kontroll og DT-behandlede mus bruker Metamorph programvare. D, E) FACS-analyse med anti-CD11b og anti-Gr-1 på cellesuspensjoner isolert fra thyroids for kontroll (D) og DT-behandlede mus. I fravær av DT (D) er det rikelig CD11b + Gr1- TAMs (øverst til venstre kvadrant). Etter en uke med DT (E), er TAMs dypt utladet med en liten økning i CD11b + GR1 + nøytrofile. F) Representant analyse fra FACS data for de angitte markører for TAMs og nøytrofile før og etter DT behandling.
A) Vekt av thyroids av kontroll og DT-behandlet
Tg-BRAF /Ccr2- DTR
mus etter 10 dagers behandling med intraperitoneal DT på alternative dager. * P 0,01. B-C) Representative deler med de angitte flekker. F) Kvantifisering av Ki67 og TUNEL positiv farging ved hjelp av Metamorph dataanalyse. Ki67 p 0,04; TUNEL p. 0,01
CSF-1 /CSF-1R signalering er nødvendig for TAM rekruttering og kan farmakologisk målrettet for å svekke PTC initiering
Vi neste undersøkt om CSF-en er kreves for TAM rekruttering ved å generere
Tg-BRAF /Csf-1
– /-
mus.
Csf-en
– /-
mus har blitt beskrevet tidligere (36, 37), og har normal thyroid histologi. PTCs fra
Tg-BRAF /Csf-en
– /+
mus er tett infiltrert med TAM (fig 6B, venstre panel.). Fire av fem
Tg-BRAF /Csf-en
– /-
mus viste en betydelig reduksjon i TAMs i PTCs (høyre panel 6B fig.), Som ble assosiert med en reduksjon i tumorvekt (fig. 6A), og ble fulgt av generalisert bevaring av den follikulære arkitektur (fig. 6C, høyre panel). TAM densitet ble ikke utarmet i skjoldbruskkjertelen av en
Tg-BRAF /Csf-1
– /-
mus, som oppviste en tumorvekt (figur 6A.) Og histologisk fenotype sammenlignes med kontroll PTCs (data ikke vist). Disse dataene peker på en betydelig rolle CSF-en signalisering i TAM rekruttering i denne modellen, men i et mindretall av tilfellene alternative signaler kan omgå CSF-en forutsetning for TAM rekruttering.
A) Thyroid vekt
Tg-BRAF /Csf-en
+/- plakater (kontroll) og
Tg-BRAF /Csf-en
– /- plakater (
Csf-en
null) mus ved 6-12 ukers alder. B, C) Representative seksjoner farget med anti-Mac-2 (B) og H /E (C) viser TAM utarming og bevaring av follikulær arkitektur i PTCs av
Csf-1
null mus.
for å finne ut om rekruttering og /eller aktivering av TAMs kan bli blokkert farmakologisk, vi matet DOX-indusert
Tg-rtTA- /Teto-BRAF
mus med impregnert chow inneholder GW2580, en c-FMS /CSF-1R tyrosinkinaseinhibitor (38) i 7 dager. Dox-indusert GW2580-behandlede mus hadde PTCs med en ~62% reduksjon i TAMs (fig. 7B, F) som var forbundet med en betydelig reduksjon i skjoldbruskvekt (0,0163 +/- 0,0014 kjøretøyet sammenlignet med 0,0126 +/- 0,0026 GW2580, p = 0,029, fig. 7A) og en mer differensiert skjoldbruskkjertelen follikulær arkitektur (fig 7A).. Stromale kafeer, målt ved αSMA, ble redusert ~77% i GW2580-behandlede mus sammenlignet med kontroller (fig. 7C, F). Tumor spredning ble redusert med 31% i GW2580 behandlet PTCs og denne reduksjonen var mest tydelig i stromal rommet (Fig. 7B, F). Disse observasjonene rekapitulert effektene av genetisk tappe TAMs (Fig. 3), styrking av bevis for at TAMs rette skjoldbruskkjertelkreft progresjon og at TAMs er et gyldig mål for pasienter med avansert sykdom.
A-D) Representative skjoldbrusk seksjoner for de angitte flekker fra 7 dagers DOX-indusert
Tg-rtTA- /Teto-BRAF
mus behandlet med enten bilen (n = 4) eller GW2580-impregnert chow (n = 4): A) H /E; B) Iba-1; C) αSMA; D) Ki67. E) Thyroid vekter av DOX-indusert, kjøretøy kontra GW2580-behandlede mus (* p = 0,02). F) Kvantifisering for de angitte flekker; * P 0,001, ** p. 0,01
Diskusjoner
Makrofager er svært allsidig og har kapasitet til å differensiere i Kupffer celler, osteoklaster og /eller pneumocytes i bosatt vev eller inn inflammatoriske Mo subtyper i mikrobielle infeksjoner (M1 type) eller etter vevsskade (M2 type). TAMs formidle en rekke svar på tumorigent prosessen, og kan indusere anti-tumor immunitet (M1 typen TAM), eller, paradoksalt nok, forbedre tumorigenesis (M2 typen TAM), [35]. De fleste trene seg data fra kreft hos mennesker tyder på at TAMs er protumorigenic, blant annet i skjoldbruskkjertelkreft [2] – [5]. I PyMT indusert brystkreft, TAMs lette tumor angiogenese og lungemetastaser, men har ingen effekt på primærtumorvekst [28]. I RIP1-Tag indusert bukspyttkjertelen nevroendokrine svulster (PNET), CSF-1 avhengige TAMs lette overgangen fra hyperplastiske angiogene holmer til PNET, men har ingen effekt på den påfølgende svulst fenotype [29]. I mutante APC intestinal polypose modeller, CSF-1-avhengige TAMs fremme polypp vekst. Men deres rolle i ondartet transformasjon ble ikke undersøkt i denne modell av godartet sykdom [36]. Mens disse studiene implisere TAMs som tumorpromotere, den sterkt dysmorphic fenotype av
Csf-en
knock mus brukt i disse studiene, og det faktum at denne modellen ikke tillater TAMs å bli tømt i løpet av definerte stadier av tumorutvikling begrenser konklusjonene som kan utledes fra disse eksperimentene. Dessuten, fordi onkogener kan indusere forskjellige inflammatoriske signaler som differensielt påvirker fenotypen til TAM, cancermodeller indusert av oncoproteiner som er kjent for å være involvert i patogenesen sykdom kan mer trofast rekapitulere funksjonen av TAMs i human cancer.
onkogen
BRAF
indusert skjoldbrusk kreft er ideell for å studere biologi TAMs i kreft progresjon fordi 1) menneskelig skjoldbruskkjertelkreft progresjon til PDTCs og ATCs er ledsaget av en økt infiltrasjon av TAMs som utgjør nesten -50% av tumorvolumet i ATCs [4], [19]; 2)
BRAF
fremmer utviklingen av menneske WDPTCs til PDTCs og ATCs [16] og 3) aktivering av BRAF-MAPK pathway in vitro i skjoldbruskceller induserer uttrykk for TAM chemoattractants [30]. I denne studien brukte vi murine modeller av BRAF-indusert PTCs /PDTCs å undersøke hvilken rolle TAMs i skjoldbruskkjertelkreft progresjon. Betinget aktivering av BRAF i murine thyroids er forbundet med en betydelig økning i de store TAM chemoattractants,
Csf-1 Hotell og
2CCl
. Dette er ledsaget av en tett infiltrasjon av TAMs og utvikling av PTCs /PDTCs med en kort ventetid [24]. For å undersøke om det er en årsakssammenheng mellom TAM infiltrasjon og PTC utvikling, vi betinget utarmet CCR2 avhengig TAMs under BRAF induksjon ved hjelp av en
CCR2-DTR
tilnærming. Handel med monocytter fra margen til sirkulasjon og vev krever signaliserer gjennom CCL2 /CCR2 sti og monocytter mangler CCR2 uttrykk bli fanget i BM [31]. En gang i sirkulasjon og /eller vev, CCR2 uttrykk i monocytter /Mø er nedregulert i løpet hviler stater, men fortsatt oppregulert i løpet av inflammasjon [31].
