Abstract
Nyere bevis har antydet at AMPK aktivatorer kan bli anvendt som terapeutiske legemidler i undertrykke kreftcellevekst. Imidlertid er den molekylære mekanisme av sin undertrykkende funksjon i kreftceller fremdeles uklar. Her viser vi at AMPK aktiva svekke livmorhalskreft cellevekst gjennom reduksjon av DVL3, en positiv regulator i Wnt /β-catenin signalisering og en onkogen spiller i livmorhalskreft tumorigenesis. Ved western blot og immunhistokjemiske analyser, viste vi at DVL3 ofte ble oppregulert og signifikant assosiert med forhøyet β-catenin (
P
= 0,009) og CyclinD1 (
P
= 0,009) uttrykk i livmorhalskreft . Tvangs uttrykk for DVL3 forhøyet β-catenin og utvidet livmorhalskreft cellevekst, verifisere at DVL3-mediert Wnt /β-catenin aktivering er involvert i livmorhalskreft onkogenese. På den andre siden, vi bemerket at livmorhalskreft cellevekst ble bemerkelsesverdig undertrykt av AMPK aktivatorer og slikt celleveksthemming var i samtidig med reduksjon av DVL3 protein nivå i dose- og tidsavhengige oppførsel. Dessuten svekket mTOR signal aktivitet også redusert DVL3 uttrykk. I motsetning til dette kan samtidig behandling med Forbindelse C (AMPK-inhibitor) i betydelig grad oppheve metformin indusert DVL3 reduksjon. Dessuten kan ko-behandling med AM114 eller MG132 (proteosomal inhibitorer) delvis gjenopprette DVL3 ekspresjon under behandling av metformin. Videre
in vivo
ubiquitinering analysen avdekket at metformin kan redusere DVL3 av ubiquitin /proteasomal degradering. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som viser den sannsynlige molekylære mekanismer for at AMPK aktivatorer undertrykke livmorhalskreft cellevekst ved å svekke DVL3 proteinsyntese via AMPK /mTOR signalering og /eller delvis fremme proteasomal nedbrytning av DVL3.
Citation: Kwan HT, Chan DW, Cai PCH, Mak CSL, Yung MMH, Leung THY, et al. (2013) AMPK aktivatorer Dempe livmorhalskreft cellevekst gjennom Hemming av DVL3 mediert Wnt /β-catenin signale aktivitet. PLoS ONE 8 (1): e53597. doi: 10,1371 /journal.pone.0053597
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 22 august 2012; Godkjent: 30 november 2012; Publisert: 02.01.2013
Copyright: © 2013 Kwan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Wong Sjekk Hun Charitable Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste gynekologiske kreftformer over hele verden. Til dags dato, den mest kjente årsaken til livmorhalskreft er humant papillomavirus (HPV) infeksjon. Vedvarende HPV infeksjon fremmer utvikling av forstadier til kreft i livmorkreft [1]. Imidlertid er HPV-infeksjon alene ikke er tilstrekkelig til å transformere vertsceller epiteliale kreftceller. Således, kan andre faktorer, slik som opp-regulering av onkogener og avvikende aktivering av tilhørende signalveier, være involvert i livmorhals karsinogenese [2]. Nyere bevis har vist at avvikende aktivering av Wnt /β-catenin signalisering er av avgjørende involvert i kreftutvikling [3], [4], [5]. Oppbyggingen av β-catenin er kjennetegnet i å forårsake avvikende aktivering av Wnt /β-catenin signalering som er nært knyttet til carcinogenesis av cervixuteri [6], [7], [8], [9], og spesielt i invasiv cervical karsinomer [10]. Således, rettet mot denne bane kan være en lovende tilnærming i molekyl behandling av denne sykdommen.
AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) er en hovedregulator av cellulær energi system [11]. Aktivert AMPK aktivitet svekker mekanistisk target of rapamycin (mTOR) signal- og dens tilhørende p70S6 kinase og 4E-BP1 aktivitet [12], og hemmer proteinsyntesen [13], [14] og cellevekst. Derfor er det ikke overraskende at lav AMPK aktivitet favoriserer kreftutvikling [15], [16]. For dette formål er tallrike farmasøytiske AMPK aktivatorer slik som A23187, A769662, 5-aminoimidazol-4-carboxamideribonucleoside (AICAR) og metformin har nylig blitt vist å utøve anti-tumoreffekter i mange humane cancere [17], [18], [19 ], [20], [21], [22], [23]. Spesielt er metformin blitt brukt i flere pågående kliniske studier [24], [25], [26], [27]. Men de molekylære mekanismer for anti-tumor effekter av disse AMPK aktivatorer ennå ikke er klart belyst.
I denne studien, viste vi at DVL3 var signifikant oppregulert og ble korrelert med Wnt /β-catenin aktivitet i livmorhalskreft. Enda viktigere, er vi de første til å dokumentere at AMPK aktiva hemme livmorhalskreft cellevekst gjennom å svekke DVL3-mediert Wnt /β-catenin signalisering i livmorhalskreftceller. Vi viste at inhiberingen av AMPK /mTOR-mediert proteinsyntese og forbedring av proteasomal degradering ble de molekylære mekanismer i reduksjon av DVL3 utstilt av AMPK aktivatorer. Våre funn implisere betydningen av DVL3 i livmorhalskreft onkogenese og markere terapeutisk verdi for målretting DVL3 av AMPK aktivatorer i livmorhalskreft behandling.
Materialer og metoder
Cell kultur
Fem livmorhalskreft cellelinjer (HeLa, Siha, C33A, CaSki og C41) (American Type Culture Collection, Rockville, MD) (cellelinjer autentisering ble gjort av in-house STR DNA profilering analyse) og to udødeliglivmorhals epiteliale cellelinjer ( NC104 og NC105) [6] (gave fra professor George. Tsao, Anatomisk institutt, Universitetet i Hong Kong) ble brukt i denne studien. Alle cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO2 i minimum essensielt medium eller Dulbeccos modifiserte Eagle medium (Gibco-BRL, Gaithersburg) med 10% føtalt bovint serum (Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco).
Plasmider og celle transfeksjon
GFP-merket-DVL3 uttrykker konstruksjonen ble brukt for GFP /DVL3 protein uttrykk [28], mens pEGFP-C1 plasmid ble brukt som negativ kontroll. Den pCMV2-Flag /DVL3 ble brukt for TOP /FOP luciferase reporter analysen, mens både pSuper8XTOPFlash og pSuper8XFOPFlash konstruksjoner ble vennlig levert av Dr. R. Moon (University of Washington, Washington, USA). LipofectAMINE
TM 200 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) ble benyttet for celle transfeksjon i henhold til produsentens protokoller. For etablering av GFP-DVL3 stabilt uttrykker celler ble transfektert celler valgt med G418 i 2 uker og verifisert av western blot analyse.
RNA ekstraksjon og kvantitativ revers transkriptase-PCR
Total RNA var hentet av TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. Komplementær DNA ble syntetisert ved hjelp av revers transkripsjon reagenssett (Applied Biosystems, Foster City). Uttrykket av
DVL3
ble evaluert av kvantitative reverstranskriptasehemmere-PCR (q-PCR) i en ABI PRISM ™ 7500 system (Applied Biosystems) ved hjelp Taqman® genuttrykk Analyser; menneskelig
DVL3 plakater (Analyse ID: Hs00610263_m1). Den menneskelige
18S rRNA plakater (Analyse ID: Hs99999901_m1) ble brukt som en intern kontroll
Protein Extraction, Western blotting og Immunhistokjemisk (IHC) analyserer
Protein lysat ble hentet. ved lysering av cellene pelletere med 1x lyseringsbuffer (10X lyseringsbuffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 1:100 PMSF, protease-inhibitor og destillert vann). For western blot-analyse ble prøvene inneholdende en fast mengde protein separert ved SDS-PAGE og elektroblottet til Hybond-P-membraner (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH, USA). Membranene ble deretter blottet med 5% skummet melk i 30 minutter og inkubert med primære antistoffer; anti-pp70S6kinase, anti-p70S6 kinase, anti-pAMPKα, anti-AMPKα, anti-CyclinD1 (Cellesignalering Technology), anti-DVL1, anti-DVL2, anti-DVL3, anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , USA) og anti-β-catenin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) over natten ved 4 ° C. Anti-mus eller anti-kanin-sekundært antistoff konjugert til pepperrot-peroksyd (Amersham Pharmacia Biotech, OH) ble anvendt, og visualisert ved forsterket kjemiluminescens (Amersham). For immunhistokjemisk analyse, ble livmorhalskreft vev utvalg (CXC1021) (5 tilfeller av normal livmorhals /cervicitt og 97 tilfeller livmorhalskreft) (Pantomics Inc, CA, USA) som brukes for immunhistokjemisk farging for DVL3, β-catenin og CyclinD1. Seksjonene ble immunostained med primær anti-DVL3 (1:200 fortynning) (NB110-59941, Novus Biologicals, Littleton, CA USA), anti-β-catenin (BD Biosciences) (1:200 fortynning) og anti-CyclinD1 (1 :100 fortynning) (H-295, Santa Cruz Biotehcnology). Inkubering med Tris-bufret saltløsning ble anvendt som negative kontroller. Deres ekspresjonsnivåer ble bedømt manuelt ved å multiplisere prosentandelen av andelen av immunopositive farging området (0-100%), og intensiteten av farging (1, svak, 2 = moderat 3, intens, og 4, meget intense ). Folden endring av hvert gen ble beregnet ved å dividere dens ekspresjon nivået for hver prøve kreft ved middelverdien av dets ekspresjon nivå på normal cervix /cervicitt. Cut-off punktet (antall folder) av hvert gen ble deretter bestemt ved dens ekspresjonsnivåer og statistisk signifikans. Alle vev delen ble undersøkt og scoret uavhengig av to etterforskere.
luciferaserapportørplasmid analysen
HEK293 celler ble transient transfektert med 0, 50, 100, og 200 ng av pCMV2-Flag /DVL3 samt enten som en pSuper8XTOPFlash eller pSuper8XFOPFlash luciferase reporter konstruere. Alle transfeksjoner ble normalisert med pcDNA3.1 (+) vektoren. Luciferaseaktiviteten ble bestemt ved hjelp av dobbelt-luciferase reporter Assay System (Promega). Transfeksjonseffektiviteter var normalisert med
Renilla
luciferase aktivitet. Alle forsøk ble utført in triplo og i 3 uavhengige eksperimenter.
In vivo
ubiquitinering Assay
Fremgangsmåten ble beskrevet som tidligere [29]. Kort sagt ble C33A eller HeLa-celler sådd ut på 100 mm kulturskåler. Den pcDNA-HA (Ub)
8 ble forbigående transfektert inn i de ovennevnte celletyper henholdsvis ved hjelp av Lipofeactamin 2000 transfeksjon sett (Invitrogen). Cellelysatet ble høstet ved hjelp av NET lyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl og 5 mM EDTA) med 1% NP40, pH 8,0, 0,1 mM PMSF og 1 mM Fullstendig TM protease inhibitor cocktail (Roche)) på cellepelleten. Ett mg av cellelysat ble inkubert med 1 pg av mus anti-IgG og anti-DVL3 (Santa Cruz) ved 4 ° C. Etter inkubering ble 40 ul protein A /G Plus-agarosekuler (Santa Cruz) tilsatt til hver prøve og blandet ved å rotere over natten ved 4 ° C. Etter sentrifugering, ble kulene vasket fire ganger med NET lyseringsbuffer, fulgt av tilsetning av prøvebuffer inneholdende DTT og kokt i 10 minutter før elektroforese. Proteasomer inhibitorer, MG132 og AM114, ble oppnådd fra Calbiochem (La Jolla, CA).
Celleviabilitet assay
Celleproliferasjon kit (XTT) (Roche) ble anvendt for å måle cellenes levedyktighet etter 5 dager i henhold til produsentens protokoll. Tre uavhengige eksperimenter ble utført in triplo.
klonogene assay
Celler ble tillatt å vokse i 2 uker. Etter 2 uker, ble mediet fjernet, etterfulgt av inkubasjon med metanol i 30 minutter og deretter farget med krystallfiolett i 1 time. Etter farging ble cellene vasket med PBS. Triplication av hver prøve og tre uavhengige eksperimenter ble utført og antallet celler ble tellet ved den Gel-Doc system.
Dataanalyse
Student «s t-test (for parametriske data) og mann- Whitney test (for ikke-parametriske data) ble anvendt for analyse. Den clinicopathological analyse mellom uttrykket av DVL3, β-catenin, CyclinD1 og kliniske parametre ble analysert ved Krysstabeller og Pearson Chi-Square test ved hjelp av SPSS 13.0 programvare (SPSS, Chicago, IL). Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. En
P
-verdi på mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
DVL3 ofte oppregulert i livmorhalskreftceller
Emerging bevis har vist at DVLs er i stand til å opp-regulere β-catenin og fremme cellevekst i tykk- og endetarmskreft [30], ondartet pleural mesothelioma [31] og ikke-småcellet lungekreft [32] etc. Vi dermed undersøkte uttrykk mønster av DVLs ( DVL1, DVL2 og DVL3) i livmorhalskreft cellelinjer av western blot analyse. Våre data viser at DVL3 men verken DVL1 heller DVL2 var signifikant oppregulert i et panel av livmorhalskreft cellelinjer (Hela, Siha, CaSki, C33A og C41) sammenlignet med immortaliserte livmorhalsen cellelinjer (NC104 og NC 105) (figur 1A ), noe som tyder på at DVL3 er dominant oppregulert i livmorhalskreftceller. Vi neste undersøkte mRNA nivået av
DVL3
i disse cellelinjene ved sanntid kvantitativ revers transkripsjon PCR (q-PCR). Tilsvarende
DVL3
mRNA nivåene var signifikant høyere i livmorhalskreft cellelinjer sammenlignet med de vanlige immortaliserte livmorhalsen cellelinjer (Figur 1b). Kollektivt, disse funnene tyder på at DVL3 er den viktigste isoformen av DVLs ofte oppregulert i cervical cancer celler.
(A) Western blot analyse viste at bare nivået av DVL3 men ikke DVL1 og DVL2 var betydelig opp- reguleres i livmorhalskreft cellelinjer sammenlignet med de normale cervix cellelinjer. (B) Real time Q-PCR avslørte mRNA av
DVL3
var åpenbart høyere blant livmorhalskreft cellelinjer sammenlignet med vanlig cervix cellelinjer. Verdien av NC105 ble anvendt for å normalisere andre cellelinjer. (C) Immunohistokjemisk analyse viste at både DVL3 og β-catenin ble oppregulert på livmorhalskreft vev sammenlignet med vanlige livmorhalsen prøver. DVL3 ble fordelt i den cytoplasmatiske region, mens β-catenin ble lokalisert i både den cytoplasmiske og kjerneregioner. (Forstørrelse: 20x) (D) Luciferase reporter analysen viste at forbigående transfeksjon av DVL3-uttrykke plasmid kan øke β-catenin transkripsjonen aktivitet i HEK293 celler
Overuttrykte DVL3 og β-catenin i livmorhalskreft.
for å studere betydningen av DVL3 og β-catenin i livmorhalskreft, undersøkte vi de uttrykk for DVL3 og β-catenin på livmorhalskreft vev array (CX1021) ved hjelp av immunhistokjemisk (IHC) analyse. Immunreaktiviteten av DVL3 ble bare observert i cytoplasma, mens β-catenin lokalisert i både kjerner og cytoplasmatiske regioner av både normale og livmorhalskreft celler (figur 1C). IHC analyse viste at bemerkelsesverdig økt uttrykk for DVL3 og β-catenin ble observert i cervikale tumorseksjoner sammenlignet med de normale cervix seksjonene (tabell 1 og 2). Statistisk analyse viste at høyt uttrykk for DVL3 (rang 5 folder) var signifikant korrelert med høy grad av β-catenin (rank 7 folder; P = 0,009) (tab 1). Det var imidlertid ingen signifikant sammenheng mellom DVL3 uttrykk og andre kliniske parametre, slik som kreftstadier (
P
= 0,369), gradering (
P
= 0,658), metastase (
P
= 0,243), β-catenin (
P
= 0,009) og CyclinD1 (
P
= 0,009). På den annen side, oppregulering av β-catenin (rank 7 folder) var signifikant forbundet med høy grad av svulster (
P
= 0,049) og over-uttrykk for CyclinD1 (
P
= 0,009), men det var ingen signifikant sammenheng med kreft stadier (
P
= 0,189) og metastasering (
P
= 0.345 kile) (tabell 2). Samlet utgjør disse funnene tyder på at økt uttrykk av DVL3 er korrelert med β-catenin som er involvert i livmorhalskreftutvikling.
DVL3 øker spredning av livmorhalskreftceller
DVLs er viktige signaltransduksjon molekyler som medierer Wnt /β-catenin signal aktivitet for å kontrollere cellevekst. For å møte enten DVL3 kunne fremme Wnt /β-catenin signalaktivitet, ble den doble luciferase reporter analysen utført. Transfeksjon av DVL3-uttrykkende plasmid inn i HEK293-celler økte β-catenin transkripsjonen aktivitet på en doseavhengig måte (figur 1D), hvilket antyder at DVL3 er en positiv regulator av Wnt /β-catenin signalkaskade. Neste, for å undersøke om DVL3 fremmer celle spredning via aktivering av Wnt /β-catenin banen i livmorhalskreft, to livmorhalskreft cellelinjer (C33A og Siha) med stabilt uttrykk for DVL3 ble etablert ved hjelp av humane GFP-merket DVL3 uttrykker plasmid. Western blot analyse viste at β-catenin ble signifikant forhøyet i GFP-DVL3 stabile kloner i C33A (C-G25 og G28-C) og Siha (S-G18 og G20-S) (figur 2A). Funksjonelt, XTT celleproliferasjonsanalyse avdekket at ektopisk uttrykk for DVL3 betydelig forbedret celleproliferasjon i GFP-DVL3 stabile kloner av Siha (
P
0,05) og C33A (
P
0,001) -celler (figur 2B). I tillegg klonogene analysen viste at det var 2-3 ganger økning i antall kolonier i Siha celler som stabilt uttrykker GFP-DVL3 (S-G18 og G20-S) (
P
0,05) og C33A celler (C-G25 og C-G28) (
P
0,05) henholdsvis sammenlignet med sine vektor kontroller (Figur 2C). Sammen er disse funnene tyder på at DVL3 forbedrer Wnt /β-catenin signalaktivitet og fremmer spredning av livmorhalskreftceller.
(A) Western blot viste at stabilt over-uttrykker GFP-DVL3 forhøyet uttrykk av β-catenin i C33A (C-G25 og G28-C) og Siha (S-G18 og G20-S). (B) XTT analysen viste en signifikant økning av celleproliferasjon i livmorhalskreftceller med stabil uttrykk for GFP-DVL3 (C-G24 og C-G28;
P
0,05) (S-G18 og S- G20;
P
0,05). (C) klonogene analysen viste at to ganger og tre ganger antall kolonier ble funnet i GFP-DVL3 ectopically uttrykker C33A celler (C-G25 og C-G28) (
P
0,05) og Siha celler (S -G18 og S-G20) (
P
0,05) sammenlignet med sine vektor kontroller
AMPK aktiva redusere DVL3 i livmorhalskreftceller
Mange. studier har vist at AMPK-aktivatorer kan hemme cellevekst i kreftformer, særlig i livmorhalskreft
in vitro product: [21], [33], [34]. Derfor undersøkte vi effekten av AMPK aktivatorer på uttrykk for DVL3 og tilhørende Wnt /β-catenin signalaktivitet i livmorhalskreftceller. AICAR behandling resulterte i betydelig reduksjon av DVL3 nivåer i tre livmorhalskreft cellelinjer (figur 3A). En annen AMPK-aktivator, A23187, aktiverer AMPK gjennom sin oppstrøms kinase (CaMKK) ved å øke cytosolisk kalsiumnivå [20], også redusert DVL3 ekspresjon i C33A og Siha-celler på en doseavhengig måte (figur 3C). For å vurdere effekten av A23187 på DVL3 uttrykk videre, ble C33A og CaSki behandlet med 1,25 mikrometer A23187 og høstet på ulike tidspunkter. Minke DVL3 ble observert etter 10 og 12 timer i C33A og CaSki henholdsvis og ingen DVL3 ble observert etter 12 og 24 timer for begge cellelinjer (figur 3D). For å vurdere hvorvidt ytterligere reduksjon av DVL3 mediert av AMPK aktivatorer er en universell prosess, to kjente AMPK aktivatorer, A769662 og metformin, ble anvendt. A769662 er en thienopyridone som aktiverer AMPK gjennom samspill med α- og β-subenheten av AMPK. Ved A769662 behandling, ble DVL3 ekspresjon avskaffet i en doseavhengig måte i Siha og C33A (figur 3B). I tillegg, er metformin et meget vanlig AMPK-aktivator, så vel som et potensielt anti-kreft legemiddel [22]. Ved behandling av metformin, flere livmorhalskreft cellelinjer vises differensial svar på metformin og viste uttømming av DVL3 på en doseavhengig måte (figur 3E), sammen med ingen endring i mRNA nivå av
DVL3
i C33A og HeLa (figur 4A), noe som antyder at reduksjonen av DVL3 regulert av AMPK aktivatorer ble forbundet med post-transkripsjonelle arrangementer. Samlet utgjør disse dataene antyder at AMPK aktivatorer kan redusere DVL3 og slik effekt er en universell prosess.
(A) Ved behandling av AICAR, ble observert ca 80% reduksjon av DVL3 nivået blant C33A, C41 og CaSki. (B) Ved behandling av A769662 ved forskjellige doser (0, 50 og 100 uM), en 20-30% og 80% -100% reduksjon av DVL3 i Siha og C33A kunne observeres respektivt. (C) Etter behandling med A23187 ved forskjellige doser (0, 1,25 og 2,5 um) i tyve timer, C33A og Siha celler viste 80-90% reduksjon av DVL3 ekspresjon i en doseavhengig måte. (D) Ved behandling av 1,25 pM A23187, kan reduksjonen av DVL3 observeres etter 10 og 12 timer henholdsvis C33A og CaSki, mens en ytterligere 100% reduksjon av DVL3 ble observert ved 12 og 24 timer for begge cellelinjer. (E) Ved behandling av metformin, ble observert 60-80% reduksjon av DVL3 i Hela, Siha, CaSki, C41 og C33A på en doseavhengig måte.
(A) Sanntids q- PCR-analyse viste at metformin hadde ingen effekt på ekspresjonen av
DVL3
mRNA-ekspresjon i C33A og HeLa-celler. (B) Western blot analyse viste at forbindelsen C kunne forringe minke DVL3 mediert av metformin. (C) XTT celleproliferasjonsanalyse viste en signifikant reduksjon i celleformering i C33A (
P
0,001), Siha (
P
0,001) og HeLa-celler (
P
0,001) behandlet med metformin på en doseavhengig måte. (D) klonogene analyse viste en bemerkelsesverdig reduksjon av antall kolonier dannet i HeLa og C33A behandlet med metformin på en doseavhengig måte.
AMPK aktivering er avgjørende for reduksjon av DVL3 mediert av AMPK aktivatorer
Selv om den store rollen som AMPK aktivatorer er å aktivere AMPK aktivitet, mange rapporter har dokumentert at noen AMPK aktivatorer kan utøve off-target effekter [35], [36]. Derfor er det av interesse å undersøke om AMPK aktiva mediert reduksjon av DVL3 er utelukkende avhengig av AMPK signalaktivitet. Vi brukte en potent inhibitor AMPK, forbindelse C, for å motvirke effekten av metformin på AMPK aktivering. Konsekvent, reduksjon av DVL3 ble observert etter behandling av metformin i C33A og Siha (figur 4B), men likevel å minke DVL3 ble opphevet ved tilsetning av forbindelse C (figur 4B). Disse dataene antyder at reduksjonen av DVL3 mediert av metformin er hovedsakelig gjennom AMPK signalaktivitet.
AMPK aktiva svekke livmorhalskreftcelle spredning gjennom reduksjon av DVL3 og Wnt /β-signale aktivitet
Vi har viste at ektopisk uttrykk for DVL3 kunne forbedre celleproliferasjon i livmorhalskreftceller. Derfor, for å få ytterligere innsikt i funksjon av utarmet DVL3 i å minimere Wnt /β-catenin signalisering og cellevekst mediert av AMPK aktivatorer, ble C33A, Siha og HeLa celler behandlet med metformin og deres spredningsrater ble undersøkt av XTT analysen. Våre resultater viser at metformin signifikant trykt celleproliferasjon i C33A (
P
0,001), Siha (
P
0,001) og HeLa celler (
P
0,001) (Figur 4C). Videre klonogene analysen avslørte også at antallet kolonier ble redusert med 20 og 50% i C33A og HeLa-celler henholdsvis (figur 4D). Disse funnene manifest at hemming av livmorhalskreft cellevekst av AMPK aktivatorer er knyttet til reduksjon av DVL3.
AMPK /mTOR aktivitet er viktig for nedbryting av DVL3
AMPK aktivatorer er i stand til å aktivere AMPK og modulerer dens nedstrøms kaskade, slik som det translasjonelle kontroll av proteinsyntese gjennom hemming av mTOR pathway [12], [13], [14]. Derfor tenkte vi at blokkering av AMPK /mTOR aktiviteten kan etterligne effekten av AMPK aktivatorer på å minke DVL3. En mTOR-hemmer (Rapamycin) ble ansatt for å hemme mTOR-aktivitet. Rapamycin undertrykker kinase aktiviteter mTOR å inaktivere p70S6k, og dermed avskaffe viss protein oversettelse [37]. Ved behandling av Rapamycin ble DVL3 redusert i cervical cancer-cellelinjer (C33A, C41, CaSki, HeLa og Siha) på en doseavhengig måte. Videre ble inaktivering av p70S6k ved samtidig med reduksjon av DVL3 observert i HeLa og Siha celler behandlet med 1 nM Rapamycin (figur 5A). Til sammen kan reduksjon av proteinsyntesen redusere DVL3 uttrykk i livmorhalskreft cellelinjer og at minke DVL3 mediert av AMPK aktivatorer er hovedsakelig gjennom AMPK /mTOR signalkaskade.
(A) Rapamycin inaktivert p70S6 kinase aktivitet og avbrutt proteinsyntese av DVL3 i alle cervical cancer-cellelinjer (C33A, C41, CaSki, HeLa og Siha) på en doseavhengig måte. (B) Proteasomal inhibitor, AM114, restaurert den reduserte DVL3 formidlet av metformin i C33A. (C) Proteasomal inhibitor, AM114, kunne ikke gjenopprette redusert DVL3 formidlet av metformin i Siha og HeLa. (D)
In vivo
ubiquitinering analysen viste at DVL3 ble degradert som poly-ubiquitinmolekyler DVL3 protein ((Ub) n-DVL3) i C33A celle modell. C33A-celler ble transfektert med pcDNA-HA (Ub)
8-plasmid. Både MG132 eller AM114 og metformin ble brukt til å øke mengden av polyubiquitinated DVL3 protein produkter ((UB) n-DVL3). Cellelysatene ble inkubert med anti-DVL3, og immunopresipitatene ble probet med anti-HA. Det samme membran ble re-undersøkt med anti-DVL3 å påvise uttrykk for DVL3.
AMPK aktivatorer også fremme proteasomal nedbrytning av DVL3
Flere linjer av bevis har vist at DVLs er strengt regulert av proteasomal nedbrytningsmekanismer i hvilken tap av faktorer som er involvert i de ubiquitinering veier fører til opphopning DVLs [28], [38]. Derfor vi tenkte at proteasomal degradering kan fungere som et alternativ mekanisme tilskrives AMPK aktiva medierte DVL3 reduksjon. Vi brukte AM114, en proteasomal inhibitor, å undertrykke ubiquitin /proteasomal degradering. Ved samtidig behandling med AM114 og metformin, ble restaurert DVL3 uttrykk observert i C33A men ikke i Siha og HeLa celler (Figur 5B og 5C).
in vivo
ubiquitinering analysen videre vist at DVL3 i C33A cellene kan bli redusert gjennom ubiquitin /proteasome sti fordi dannelsen av DVL3-ubiquitinmolekyler produkter ble observert ved behandling av metformin og slike DVL3-ubiquitinmolekyler produkter ble ytterligere forsterket da samtidig behandling med enten AM114 eller MG132 (figur 5D). Disse dataene indikerer at proteasomal degradering spiller også en rolle i reduksjon av DVL3 mediert av AMPK aktivatorer.
Diskusjoner
I denne studien har vi vist at DVL3 var abnormt over-uttrykk og betydelig korrelert med økt β-catenin i livmorhalskreft. Våre data viste også at DVL3 kunne fremme livmorhalskreft vekst gjennom aktivering Wnt /β-catenin signalveien. Enda viktigere er adressert vi den potensielle bruken av AMPK aktivatorer for å redusere DVL3 og følgelig inhibering av livmorhalskreft cellevekst. Dessuten er dette den første rapporten som viser de mulige molekylære mekanismer for hvordan AMPK aktivatorer svekke livmorhalskreft cellevekst gjennom crosstalk mellom AMPK og Wnt /β-catenin signalering.
Aberrant aktivering av Wnt /β-catenin signal veien har blitt dokumentert i ulike menneskelige kreft inkludert livmorhalskreft [39]. Faktisk har monterings bevis vist at DVLs som er positive regulatorer av Wnt /β-catenin signalveien er ofte oppregulert i en rekke humane cancere [32], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46]. De overuttrykte DVLs er nært forbundet med økt Wnt /β-catenin aktivitet i humane kreftformer [31], [32], [47]. Men svært lite er kjent om de funksjonelle rollene til DVLs i livmorhalskreft. Heri vi observert at DVL3, men verken DVL1 eller DVL2, var signifikant oppregulert og forbundet med utvidet Wnt /β-catenin signalaktivitet og livmorhalskreft cellevekst.
Tallrike studier har rapportert at de oppstrøms kinaser av AMPK, som LKB1, ofte mutert og slettet i lunge, bryst og spesielt livmorhalskreft [21], [48], [49], og dermed redusere AMPK aktiviteter for kreftcellevekst. Faktisk er lav AMPK aktivitet en vanlig hendelse favoriserer veksten av kreft celler [15], [16]. Således er AMPK et viktig mål i kreftterapi. Vi og andre grupper har tidligere vist at flere AMPK-aktivatorer kan undertrykke veksten av kreft celler [21], [22], [50]. Men de molekylære mekanismer av undertrykkelse forblir stort sett uutforsket. Tidligere Kohno gruppe viste at metformin redusert proteinnivået av β-catenin gjennom regulere dens fosforylering-avhengig nedbrytning [51]. Dette ga oss en anelse om at metformin kan regulere oppstrøms regulatorer av Wnt /β-catenin signalkaskade. Heri, viste vi at bemerkelsesverdig reduksjon av DVL3 kan være forårsaket av flere AMPK aktivatorer, noe som tyder på at AMPK aktiva universelt redusere DVL3. I samsvar med tidligere rapporter om den anti-tumor effekt av metformin gjennom nedregulering av CyclinD1 nivået i prostata kreft og brystkreft [52], [53], reduksjon av DVL3 uttrykket er også ved samtidig med reduserte nivåer av β- catenin og dens nedstrøms mål, CyclinD1, som er ansvarlig for cellesykluskontroll. Overraskende, metformin bare påvirker proteinnivået DVL3 men ikke dens mRNA, noe som indikerer at reguleringen av DVL3 mediert av AMPK aktivatorer er avhengig av post-transcriptional modifisering.
Som flere AMPK aktivatorer kan redusere DVL3, vi spekulert i at AMPK aktivitet er viktig i en slik regulering. For å teste hvorvidt AMPK-aktivatorer utøve deres virkninger på DVL3 gjennom aktivering av AMPK, en AMPK-inhibitor, forbindelse C, ble ko-behandlet med metformin i cervikale kreftceller for å motvirke effekten av AMPK aktivering. Som forventet, forbindelse C avtok funksjon av metformin i dempende DVL3 uttrykk. Disse funnene manifest at AMPK aktivatorer kan redusere DVL3 gjennom moduler AMPK aktivitet, og slik effekt er ikke på grunn av AMPK aktivatorer «off-målrettet funksjoner. Faktisk
in vitro
celle proliferasjonsanalyser avslørte også at bruk av AMPK aktivatorer (for eksempel metformin) kan redusere celleproliferasjon. Vi tilbyr solid bevis på at AMPK aktivatorer, spesielt metformin, utøve en nedregule effekt på DVL3 og dermed redusere uttrykket nivåer av β-catenin og CyclinD1, og til slutt dempe celleproliferasjon. Enda viktigere, er vi de første til å vise at AMPK aktiva utøve sin anti-proliferativ effekt gjennom å redusere DVL3 og Wnt /β-catenin signalaktivitet. AMPK aktivering spiller en nødvendig rolle i å undertrykke svulst utvikling i livmorhalskreft.
