Abstract
Omdanning av androgenreseptoren (AR) signalering som en mekanisme for veksthemming av normale prostata epitelceller med den i vekststimulering i prostatakreftceller er ofte forbundet med AR mutasjon, forsterkning og over uttrykk. Således, nedregulering av AR-signalering er vanligvis terapeutisk for prostatakreft. Den E006AA cellelinjen ble etablert fra et hormon naiv, lokalisert prostatakreft. E006AA celler er genetisk aneuploid og vokse like godt når xenopodet til enten intakte eller kastrerte hann nog men ikke nakne mus. Disse celler oppviser: 1) X-kromosom duplisering og
AR
genamplifikasjon, men paradoksalt nok ikke kombinert med økt ekspresjon AR, og 2) somatisk, dominant-negative serin-599-glycin tap-av-funksjon mutasjon innenfor dimerization overflaten av DNA-bindende domene av
AR
genet. Ingen effekt på veksten av E006AA celler er observert ved anvendelse av målrettet knockdown av endogent mutante AR, ektopisk ekspresjon av villtype-AR, eller behandling med androgener eller anti-androgener. E006AA celler representerer en prototype for en nylig identifiserte undertype av prostata kreft celler som viser en dominant-negative AR tap-av-funksjon i et hormonelt naiv pasient. Et slikt tap-av-funksjon eliminerer AR-mediert veksthemming som normalt induseres av normale fysiologiske nivåer av androgener, og dermed produsere en selektiv vekst fordel for disse maligne celler i hormonelt naive pasienter. Disse dataene markere at tap av AR-mediert veksthemming er en uavhengig prosess, og at uten ytterligere endringer, ikke er tilstrekkelig for å skaffe onkogen avhengighet til AR signalering. Dermed vil pasienter med prostata kreft celler som bærer slike AR tap-av-funksjon mutasjoner ikke dra nytte av aggressiv hormon eller anti-AR behandling selv om de uttrykker AR protein
Citation. D’Antonio JM, Vander Griend DJ Antony L, Ndikuyeze G, Dalrymple SL, Koochekpour S, et al. (2010) Tap av androgen Receptor-avhengig vekst Suppression av prostata kreft celler kan skje uavhengig fra Anskaffelse onkogene Avhengighet til androgen Receptor signalering. PLoS ONE 5 (7): e11475. doi: 10,1371 /journal.pone.0011475
Redaktør: Janine Santos, medisinske og odontologiske av New Jersey, USA
mottatt: 23 april 2010; Godkjent: 14 juni 2010; Publisert: 08.07.2010
Copyright: © 2010 D’Antonio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. NIH Grant R01DK52645 og Maryland Stem Cell Research Fund MSCRF-II-0428 sjenerøst støttet denne forskningen. Donald Vander Griend ble støttet av en Urologi Training Grant (NIH T32DK07552), og av en DOD postdoktor Training Award (PC060843). Jason Dantonio er støttet av en Urologi Training Grant (NIH T32DK07552-21A1). Dr. Koochekpour ble støttet av en bevilgning fra NIH /NCRR-Center of Biomedical Research Excellence (Cobre, 1P20 RR021970) og gi R21CA149137. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
i løpet av det siste tiåret har det vært en fornyet interesse for androgen reseptor (AR) signal-, som det gjelder normal prostata funksjon, prostata kreftutvikling, og metastatisk progresjon. I normal prostata, AR funksjonene via en gjensidig parakrin interaksjon mellom de epiteliale og stromale celler [1]. Androgen-binding til AR i prostata stromale celler aktiverer en transkripsjonen kaskade som resulterer i produksjon og sekresjon av parakrine vekstfaktorer, kjent som andromedins, som diffunderer inn i det epiteliale rom, binde celleoverflate beslektede reseptorer, og aktiverer signalveier som stimulerer proliferasjon og overlevelse av epitelcellene [1]. I nærvær av fysiologiske nivåer av androgen, og dermed andromedins, ligand-bundet AR ligger i den sekretoriske luminal epitelcelle forhindrer overvekst av det epiteliale rom ved å undertrykke celledeling og fremme cellulær differensiering [1], [2], [3] , [4]. Betydningen av denne cellekontekstavhengig AR vekstundertrykkende egenskaper er dokumentert ved studier som viser at betingede tap av AR-ekspresjon i det epiteliale rom, men ikke i stromale celler, resulterer i øket luminal epitelcelleproliferasjon [5], [6]. Når et fysiologisk nivå av androgen ikke opprettholdes, slik som følgende androgen ablasjon, nivået av andromedins reduseres til et nivå hvor de kan hverken stimulere proliferasjon eller å hindre aktivering av apoptose i epitelcellene, og dermed prostata regresses [1].
i løpet av prostata kreftutvikling, både AR-uavhengige og AR-avhengige signalmekanismer bidra til malign transformasjon av epitelceller [7]. I AR-uavhengig reaksjonsvei, er AR-protein ikke uttrykkes, og derfor den AR-regulerte undertrykkelse av malign cellevekst er tapt. Viktigst er at når Ar er da ectopically uttrykt i slike AR-uavhengig prostatacancerceller, inhiberer androgen-aktivert AR signalecellevekst [8]. I AR-avhengige reaksjonsveien, er AR funksjon ofte er konvertert fra en vekst suppressor til et onkogen stimulerende prostatakreft celle overlevelse og proliferasjon [1], [9], [10]. Mens enten AR-uavhengige eller -avhengige trasé er mulig, de fleste av prostatakreft erverve onkogene AR signalering, og dermed gi begrunnelsen for hvorfor androgen ablasjon er standardbehandling ved metastatisk prostatakreft siden det hemmer spredning og aktiverer apoptose i disse metastatiske kreftceller [ ,,,0],11]. Dessuten gjenstår AR signale et sentralt mål selv for kastrat-motstandsdyktig metastatisk prostatakreft [7]. Dette er basert på resultatet av studier som viser at selv uvanlig i hormonelt naive pasienter, AR genmutasjon og forsterkning, noe som resulterer i forhøyede AR proteinekspresjon, blir detektert i de fleste metastatisk prostata kreft vev oppnådd fra pasienter med kastrering-resistente metastatisk sykdom [12], [13]. I samsvar med disse kliniske observasjoner, AR genmutasjon, forsterkning og protein over-ekspresjon er vanligvis observert i de fleste av prostatacancercellelinjer avledet fra kastrering bestandig verter [14], [15]. Disse kastrat-resistent prostatakreft cellelinjer ikke gjennomgår apoptose når androgener er oppbrukt eller androgener antagonister brukes; Men de stopper voksende og aktivere celledød hvis AR proteinnivået reduseres under et kritisk nivå både
in vitro product: [14], [16], [17] og
in vivo product: [ ,,,0],18]. Disse observasjonene stemmer overens med begrepet «onkogen avhengighet» [19] til AR protein uttrykk og funksjon, og dokumentere at slike kastrat-resistente prostata kreft celler forblir avhengige av AR system for deres ondartet vekst [1], [9].
tilstedeværelsen av AR uttrykk, somatiske AR mutasjoner eller forsterkning betyr ikke nødvendigvis, men at en prostata kreft celle er avhengige av AR signale. Denne uttalelsen er basert på denne studien, som dokumenterer en ekstra subtype av menneskelige prostata kreft celler. I denne undertype, har AR gjennomgått en dominant-negativ, tap-av-funksjon mutasjon AR, selv om det genetisk forsterket uten at pasienten noen gang å motta androgen ablasjon. En slik dominant-negativ tap av AR funksjon i ondartede celler frembringer en selektiv vekst fordel ved å eliminere den normale androgen-avhengige signalise AR-indusert veksthemming; Men mens det er nødvendig, er det ikke tilstrekkelig for disse ondartede celler anskaffe en onkogen avhengighet til AR-signalering.
Metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrestudier ble utført i henhold til dyr protokollen MO09M434 godkjent av Johns Hopkins Animal Care og bruk komité spesielt for denne studien.
Cells and Materials
E006AA [20], S006AA [20], LNCaP og PC-3 (hentet fra ATCC, Manassas, VA), og LNCaP C4-2B (hentet fra UroCor, Oklahoma City, OK) celler ble holdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, California), og LAPC-4 celler i IMDM (Invitrogen) pluss en nM R1881 , begge inneholdende 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 1 x Pen /Strep, og L-glutamin. CWR22 xenograft tumor vev var en slags gave fra Thomas Pretlow (Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio). Trekull /dekstran strippet FBS (csFBS) ble oppnådd fra Hyclone og brukes som supplement til fenolrødt-fritt RPMI (Invitrogen) for luciferase og kromatin immunoutfellingsstudier analyser. Den syntetiske androgen R1881 ble kjøpt fra Perkin-Elmer (Boston, MA). PSA-analyse ble utført av JHMI Clinical Chemistry Laboratory. Celleveksten ble målt ved hjelp av en 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (CellTiter Non-Radioactive Cell Proliferation Assay fra Promega Corp. (Madison, WI)). I korthet ble cellene sådd ut i en 96-brønners format og tillatt å følge natten over. Celler ble behandlet med bærer eller medikament. På bestemte dager, ble 15 ul av MTT-fargestoff-reagens tilsatt til hver brønn, platene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer, ble 100 ul stopp reagens tilsatt til hver brønn, og platene leses av en Molecular Devices Spectramax pluss plateavleser ved 570 og 650 nm. Avlesninger ble deretter plottet mot en standardkurve for å bestemme celle tall. Resultatene er presentert fra dag 4. klonogene overlevelse ble analysert som følger: 500 celler (foreldre E006AA, E006AA LV-ikke-stanse-shRNA, og E006AA LV-AR-shRNA) ble belagt per brønn i 6-brønners plater, lov til å følge og kolonisere i seks dager, deretter samtidig fiksert og farget i en 0,5% krystallfiolett /25% metanol løsning og kolonier ble talt manuelt.
karyotype analyser og fluorescens in situ hybridisering
Cytogenetisk analyse var utføres ved hjelp av standardmetoder. Kromosomavvik ble beskrevet i henhold til ISCN retningslinjer [21]. FISH ble utført på cellelinjer og på en normal mannlig kontroll ved hjelp av sonder som er kjøpt fra Vysis (Abbott Molecular), spesifikke for AR Gene (Xq12) og X cent. Den hybridisering ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. For hver cellelinje, ble 100 interfase kjerner mottok og forholdet av rødt (AR) til grønt (Xcen) signaler ble beregnet. Totalt 9-20 metafaser ble også analysert. Bilder ble ervervet ved hjelp av en standard epifluorescence mikroskop og FISH Vis programvare (Applied Spectral Imaging).
In vivo
Tumor Analyser
In vivo
vekst analyser ble utført som tidligere beskrevet [22], [23]. For subkutane injeksjoner, ble én million E006AA celler i 200 ul 80% Matrigel (BD Biosciences, fortynnet med kaldt HBSS) injisert i flankene av mannlige Nude eller Nog-SCID mus. For CWR22 xenograft vaksiner, ble 20 mg vev injisert per mus. Kirurgisk kastrering ble utført som tidligere beskrevet [22], [23]. Passasje av tumorvev ble utført ved hakking tumorvevet, passerer det gjennom et sterilt vev sil, vasking i PBS, og re-injeksjon av 50 mg av tumor i 200 ul 80% Matrigel.
Immunohistologisk Detection
farging for AR (N-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), PSA (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), ΔNp63 (LabVison /NeoMarkers, Freemont, CA), Nkx3.1 (UMBC) og CK5 (Babco, Richmond CA) ble gjort med xenograft seksjoner som tidligere beskrevet [24], med følgende modifikasjoner: Vevssnitt ble deparrafinized, rehydrert og kort ekvilibrert i vann. For AR og Nkx3.1 immunhistokjemi, ble antigen avmaskering utført ved koke lysbilder på 1 mmol /L EDTA (pH 8,0) i 15 min. For p63 farging ble slides dampet i 20 minutter i Antigen avmaskering Solution (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 20 minutter. Endogen peroksidaseaktivitet ble stanset ved inkubering med peroksidase blokk i 5 minutter ved romtemperatur. For AR og Nkx3.1 flekker, ikke-spesifikk binding ble blokkert ved inkubering i 1% bovint serumalbumin i Tris-HCl pH 7,5 i 20 minutter ved romtemperatur. Glassene ble inkubert med primære antistoffer, inkludert et kanin polyklonalt AR-antistoff (1:25 fortynning) i 45 minutter ved romtemperatur; mus monoklonalt PSA-antistoff (1:50 fortynning) 45 minutter ved romtemperatur; mus monoklonalt p63-antistoff (1:50 fortynning) i 45 minutter ved romtemperatur; kaninpolyklonalt antistoff Nkx3.1 (1:1000 fortynning) i 45 minutter ved romtemperatur; og kaninpolyklonalt antistoff CK5 (1:2500 fortynning) i 45 minutter ved romtemperatur. Etter primær antistoff søknad, ble lysbilder inkubert med poly-HRP konjugert sekundær (EnVision (AR, p63) eller Powervision (Ptil, Nkx3.1, CK5)) på 1:3000 fortynning i 30 minutter ved romtemperatur. Signal-påvisning ble utført ved anvendelse av 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) som chromagen i 20 min. Lysbilder ble kontra med hematoxylin, dehydrert, og montert.
Lentiviral Infeksjon
Stall villtypehumant AR cDNA uttrykk og FACS sortering for GFP-positive celler ble utført som tidligere beskrevet [8], [25]. Stabil mutant LV-AR S599G ble skapt først ved PCR amplifikasjon av E006AA cDNA inneholder S599G mutasjon. Begge PCR-fragmentet og villtype lenti-viral AR plasmid ble spaltet med restriksjons Eco81I og Tth111I. PCR-produktet fordøyd og LV-AR plasmid ble isolert, renset, ligert ved hjelp av T4-ligase hurtig kit (Fermentas), og sekvensert for å bekrefte S599G innsetting. Short-hårnål knockdown av AR ble utført ved bruk av MISSION
TM lentiviral shRNA transduksjon partikler rettet mot enten AR alene eller et ikke-tie shRNA kontroll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 1 × 10
4 E006AA eller LNCaP celler ble sådd per brønn og lov til å følge etter 4 eller 24 timer, henholdsvis. Celler ble omformet til en MOI av 2 (2 × 10
4 partikler /brønn) uten polybrene. Antibiotika utvalg [1,5 mikrogram /ml puromycin (Sigma)] ble igangsatt 48 timer senere.
AR Sekvense
RNA ble høstet ved hjelp av Qiagen miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) og forurensende DNA ble fjernet ved hjelp av Ambion DNA-settet (Ambion, Austin, TX). Superscript revers transkriptase III (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 1 ug total RNA ble anvendt for å danne cDNA med Oligo-dT primere. Genomisk DNA ble ekstrahert ved bruk av Qiagen DNA-mini kit og inkubert med RNase (Roche, Mannheim, Tyskland) ved 37 ° C i 30 min for å fjerne forurensende RNA. PCR-amplifisering av cDNA og genomisk DNA ble utført ved anvendelse av platina
pfx
DNA-polymerase (Invitrogen) i henhold til produsentens spesifikasjoner med de følgende overlappende primersettene: (1) 5′-AGAGAGGTAACTCCCTTTGGCT-3 «og 5»-ACGCTCTGGAACAGATTCTGG -3 «(740bp), (2) 5′-TCCCGCAAGTTTCCTTCTCT-3′ og 5»-GATACTGCTTCCTGCTGCTGTT-3 «(756bp) (3) 5′-TGAGGAACAGCAACCTTCACAG-3′ og 5»-ACAGGGTAGACGGCAGTTCAA-3 «(704bp) , (4) 5»-GCCGAATGCAAAGGTTCTCT-3 «og 5′-TTGACACAAGTGGGACTGGGA-3′ (700 bp), (5) 5»-CAGTTGTATGGACCGTGTGGT-3 «og 5′-CTACACCTGGCTCAATGGCT-3» (723bp), (6) 5 « -CGGAAGCTGAAGAAACTTGG-3 «og 5′-AGAAGCGTCTTGAGCAGGAT-3′ (685bp), (7) 5»-ATTCCAGTGGATGGGCTGAA-3 «og 5′-TAGCTCTCTAAACTTCCCGTGG-3′ (714bp), (8) 5»-CTTCCCATTGTGGCTCCTAT-3 «og 5»-ACCTTCTCGTCACTATTGGC-3 «(361bp); og for genomisk DNA amplifikasjon av exon 3 i AR-genet: (9) 5»-TGTTTGGTGCCATACTCTGTCCAC-3 «og 5′-GCATCCTCACTCACCTTCTGTTGG-3» (530bp). PCR produktene ble kolonnen renset ved hjelp av Qiagen QIAquick kit (Qiagen) og ble sekvensert ved Johns Hopkins University DNA analyse Facility bruker både forover og bakover primere.
Western Blot analyse
Hele cellelysater var fremstilt på en per celle basis i lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,8, 140 nM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,5% Nonidet P-40) supplert med PhosSTOP fosfatase-inhibitor tablett og protease inhibitor tablett (Roche ), og 1 mM ditiotreitol. Helcellelysater ble underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert i 5% melk (TBS + 0,1% Tween-20) i 1 time. Den kaninpolyklonalt AR-antistoff (SC-816), og mus-monoklonalt CK8 (SC-53266) og mus-monoklonalt CK18 (SC-32722) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), og det musemonoklonale ß-Actin antistoff ble kjøpt fra Sigma (A5441) og ble brukt i forbindelse med et anti-kanin-HRP-antistoff (7074, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) eller anti-muse-HRP (NA931V, GE Healthcare, UK).
Nuclear og cytoplasmatiske cellefraksjoner ble utarbeidet etter den kjernefysiske Complex Co-IP kit (Active Motif, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk ble cellene vasket og deretter skrapet i kald PBS supplert med fosfatase-inhibitorer. Cellepelletene ble resuspendert og lysert i en hypoton løsning x plus vaskemiddel, sentrifugert ved 6000 x g i 5 min ved 4 ° C, og cytoplasmatiske fraksjoner fjernes. Nukleære pellets ble resuspendert i fordøyelse buffer pluss enzymatisk skjær cocktail og inkubert ved 4 ° C i 90 min. 0,5 M EDTA ble tilsatt for å stoppe enzymatisk skjær reaksjoner og nukleære lysatet sentrifugert i 10 minutter ved 4 ° C. Alle fraksjoner ble slått sammen med tilsvarende volum 2 x SDS-prøvebuffer og denaturert ved 95 ° C i 5 min. Prøvene ble separert på 4-15% PAGE og blottet med enten anti-AR. (N-20, Santa Cruz), cytoplasmatiske markør Vinculin (Sigma), eller det nukleære markør HDAC (Santa Cruz Bioteknologi)
Måling AR transkripsjonen aktivitet
Celler ble sådd ut (per brønn) i hvit polystyren, klar bunn, sterile 96-brønners vevkulturplater følgelig: LNCaP C4-2B (9000); PC-3 (7000); E006AA, E006AA LV-AR, E006AA LV-ikke-stanse-shRNA, E006AA LV-AR-shRNA (5000). Celler med eller uten androgen (1,0 nM R1881) ble sådd ut i seks replikater i RPMI (Invitrogen) supplert med 10% csFBS (Hyclon), men uten fenol rød eller penn /strep og tillates å følge natten over. -Celler ble transfektert ved å bruke Fugene 6 (Roche) med 50 ng Probasin-PSA-ildflue og 5 ng PRL-TK-Renilla (Promega, Madison, WI) luciferase reporter-konstruksjoner per brønn i et forhold på 3:01 (il Fugene: ug total DNA) i serumfrie medier [26]. På dag tre ble seks behandlings brønner stimulert med androgen mens seks kontrollbrønner mottok 0,1% kjøretøy. På dag fire, ble media nøye aspirert og cellene ble behandlet i henhold til Dual Luciferase Assay kit instruksjoner (Promega # E1910). I korte trekk ble 30 pl av passiv lyseringsbuffer tilsatt til hver brønn og platen rystet på en ristemaskin i 15 minutter ved romtemperatur. Ildflue og Renilla enzymatiske aktivitet ble målt ved anvendelse av en Wallac 1450 Micro Jet plate injektor. Triple transfekterte LNCaP C4-2B celler mottatt 50 ng Probasin-PSA-firefly, 5 ng PRL-TK-Renilla, og 50 ng LV-AR-S599G konstruerer per brønn i forholdet 03:01 (mL Fugene: ug total DNA) i serum-frie medier.
chromatin Immunpresipitasjon
LNCaP C4-2B og E006AA celler dyrket i fenol rød-fri RPMI, supplert med 10% csFBS, ble høstet via trypsinering og kromatin utarbeidet etter den MagnaChIP kit fra Upstate, Temecula, CA. ~ 1 x 10
7-celler ble resuspendert i 10 ml media, fast ved tilsetning av 275 ul av 37% formaldehyd og forsiktig ristet ved 22 ° C i 12 min. Etter tverrbinding, 1 ml av glycin ble tilsatt, og cellene forsiktig ristet i 5 min ved 22 ° C, vasket to ganger i kald PBS, resuspendert i 500 ul celle-lysis buffer pluss 2,5 pl proteasehemmere (5 mM PIPES pH 8, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) og sentrifugert i 5 minutter ved 4 ° C. Cellepelletene ble resuspendert i 500 ul celle-lysis buffer pluss 2,5 ul proteasehemmere, inkubert 15 minutter på is med kort vortex hver 5 min, og sentrifugert ved 800 x g i 5 min ved 4 ° C. Nukleære pellets ble resuspendert i lyseringsbuffer atom pluss 2,5 pl proteasehemmere (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,1). Chromatin ble ultralyd til et gjennomsnitt DNA lengde på 500-1200 bp hjelp Fisher Scientific Sonic Dismembrator Modell 100 (4 × 15 sek pulser på innstilling 3). Fem ul ble lagret for styreinngang, og 50 pl aliquoter ble fortynnet i 450 ul fortynningsbuffer (0,01% SDS, 1,1% Triton, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,1, 167 mM NaCl). Fire ug antistoff ble tilsatt til respektive rør: 4 ul av 1 mg /ml kanin IgG eller 40 pl 100 pg /ml kanin-anti-AR (SC-816, Santa Cruz) og roteres O /N ved 4 ° C. Immunkomplekser ble sentrifugert 10 minutter ved 10000 x g i 4 ° C for å pelletere eventuelle aggregater eller ikke-spesifikke komplekser. Supernatanten (ønskede immunkompleksene) ble høstet og kombinert med 20 ul protein A-Dynabeads (Invitrogen, CA) og forsiktig omrørt i 2 timer ved 4 ° C. Rørene ble plassert i et Millipore magnetisk stativ og immunkompleksene sekvensvis vasket en gang med lav saltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 150 mM NaCl), høy saltbuffer (0,1 % SDS, 1% Triton, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1, 500 mM NaCl), LiCl buffer, og TE, med 3 min omrøring hvert vasketrinn. Å reversere tverrbindinger, ble kulene resuspendert i 100 pl Chelex og kokt 10 min ved 95 ° C, sentrifugert 1 minutt ved 12.000 x g ved 4 ° C, og supernatantene samles opp. Kulene ble resuspendert i 120 pl vann, sentrifugert på nytt, og supernatantene slått sammen med foregående supernatant. Den fanget DNA ble renset ved hjelp av Qiagen PCR rensing kit (# 28104) i henhold til produsentens instruksjoner og analysert ved PCR og q-PCR.
PCR analyse av immunopresipitert DNA
Ved hjelp av fem Prime HotMasterMix ( Eppendorf), PCR-reaksjoner ble utført som følger: 94 ° C i 2 minutter, deretter 32 sykluser 30 sekunder denaturering ved 94 ° C, 30 sek av gløding (som angitt nedenfor for hvert primer-par), og 30 sekunder for forlengelse ved 65 ° C, og deretter en 2 min endelig forlengelse ved 65 ° C. PCR-produktene ble separert på 2% agarosegeler og farget med etidiumbromid. Primere for amplifisering av DNA-fragmenter er som følger: PSA promoter ER (52 ° C) FWD 5′-GCCAAGACATCTATTTCAGGAGC-3 «, 5′-rev CCCACACCCAGAGCTGTGGAAGG-3′; KLK2 promoter (52 ° C) fwd 5»-CTCCAGACTGATCTAGTATG-3 «, 5′-rev TTGGCACCTAGATGCTGACC-3»; SP1 nettstedet P45
Skp2 promoter (53 ° C) fwd 5′-GATCCACGCTCAGAGACGAC-3 «, rev 5′-TTCGAGATACCCACAACCCC-3′; Tcf4 bindende element i c-myc promoter (55 ° C) fwd 5»-GCTCTCCACTTGCCCCTTTTA-3 «, rev 5′-GTTCCCAATTTCTCAGCC-3».
Kvantitativ PCR analyse av immunopresipitert DNA
Bruk BioRad IQ SYBER Grønn Supermix (Hercules, CA), PCR-reaksjoner ble utført med BioRad ICycler som følger: 95 ° C i 3 minutter, og deretter 40 sykluser 30 sekunder denaturering ved 95 ° C, 30 sek av hybridisering ved 55 ° C, og 45 sek av forlengelse ved 72 ° C (data ble samlet inn under forlengelse), etterfulgt av en 110cycle smeltekurve 45-100 ° C for å sikre primer effektivitet. Tidligere er utformet primere for kvantitativ amplifisering av DNA-fragmenter inneholdende en antatt står i PSA-gen-promotoren og en ARE III i PSA-enhancer region er: ER FWD 5′- CCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACA-3 «, 5′-rev GGGAGGGAGAGCTAGCACTTG-3′; ARE III fwd 5»-TGGGACAACTTGCAAACCTG-3 «, 5′-rev CCAGAGTAGGTCTGTTTTCAATCCA-3» [27]. Prosent inngangs beregninger ble gjort som følger:% input = 2 (Ct
AR Chip – Ct
input) x100. T-test ble benyttet for å bestemme p-verdi.
Resultater
E006AA Cellene er Svulst i intakte og kastrerte NOG-SCID-mus
Koochekpour et al. rapportert etablering av en ny human prostatakreft cellelinje, E006AA, som ble hentet fra en Gleason 6 lokalisert prostatakreft i et hormon naive prostatakreft pasient av afroamerikansk avstamning [20]. Passende normale prostata stromale celler, betegnet S006AA, ble også dyrket fra de samme radikal prostatektomi prøven [20]. Den epitelial opprinnelse E006AA cellene ble bekreftet ved positivt uttrykk for cytokeratins 8 (CK8) og 18 (CK18), mens den stromal opprinnelsen til S006AA cellene ble bekreftet ved positivt uttrykk for mesenchymale markører desmin og alfa-glattmuskel aktin og den fravær av CK8 og CK18 [20]. I de opprinnelige studiene E006AA celler var ikke-tumorigent når xenopodet inn intakte hann hårløse mus [20]. Siden nakne mus har unormalt høye nivåer av aktivert natural killer (NK) T-celler, noe som resulterer i en økt vert immunreaksjon mot en voksende svulst [28], reist dette spørsmålet om disse E006AA celler ble udødeliggjort, men bare delvis omformet eller enten de er fullt ut ondartet men følsomme for NK-celledreping. For å løse dette problemet, E006AA celle subkutane vaksiner i begge intakt mannlige naken og NOG /SCID /γ
c
null trippel mangelfull mus [dvs. NOG-SCID mus mangelfull i NK, B og T-celler] var initiert [29]. Inokulering av E006AA celler i nakne mus (n = 15) viste at E006AA cellene danner palpable tumorer nådde ~100-200 mm
3 etter seks uker, i 100% av musene. Etter seks uker, men alle de E006AA tumorene i intakt hann nakne mus sluttet å vokse og tilbakegang i løpet av en andre periode på 5-10 uker (figur 1A). I motsetning til situasjonen i nakne mus, E006AA tumorer vokste i en akselererende hastighet i NOG-SCID-mus, og ikke regress (figur 1A). Interessant, selv om tumorigen, noe serum PSA kunne detekteres i E006AA tumorbærende mus (n = 10).
(A) Inokulering av E006AA celler i hann nakne mus i forhold til hann nog-SCID-mus. (B) Overføring av svulstvevet stammer fra en etablert E006AA xenograft tumor fra en mannlig NOG-SCID mus til intakte mannlige Nude og NOG-SCID mus. (C) Veksten i E006AA og CWR22 menneskelige prostata kreft xenografttumorer i kastrert vs. intakt hannmus ved åtte uker. (D) Histologisk analyse (H E) og farging av E006AA xenograft vevssnitt for AR, PSA, p63, og CK5 (bilder tatt på 20 × og 40 ×). (E) Western blot analyse av CK8 og CK18 uttrykk i LNCaP, PC-3, E006AA og S006AA celler. ß-Actin fungert som en lasting kontroll.
For ytterligere å bekrefte at den observerte spontan regresjon av E006AA xenografttumorer i nakne verter, men ikke i NOG-SCID mus, stammer fra immun anerkjennelse og eliminering av NK celler, fjernet vi et etablert og voksende E006AA tumor fra en NOG-SCID vert og transplanterte vev fra denne svulsten tilbake inn i enten intakte hann NOG-SCID (n = 5) eller nakne mus (n = 5). I likhet med våre tidligere observasjoner, gjennomgikk transplanterte E006AA svulster forsinket regresjon i intakte mannlige naken mus mens forming kontinuerlig voksende svulster i NOG-SCID-verter (Figur 1b). Disse kombinert resultater dokument som E006AA cellene er faktisk tumorigent men sårbar for NK celle drap.
Etter å ha demonstrert tumorigenitet av E006AA celler, neste vi evaluert sin androgen respons,
in vivo
, ved inokulering disse celler i begge intakt (n = 10) og kastrerte (n = 8) mannlige Nog-SCID verter. Svulster utviklet like godt i begge verter og det var ingen forskjell i veksttakten eller svulst volum i de kastrerte vs intakt Nog-SCID dyr (figur 1C). For å sikre kastrering nivåene av sirkulerende androgener, veksten av androgen-responsive CWR22 human prostatacancer xenograft i kastrerte (n = 5) sammenlignet med intakte (n = 5) hannmus ble også analysert. I motsetning til i intakte mus, veksten av CWR22 xenografttumorer hos kastrerte vertene var dypt hemmet (figur 1C). Disse resultatene dokument som E006AA celler utviser kastrering-resistente vekst,
in vivo, etter selv om de opprinnelig ble etablert fra et hormonelt naiv primær prostatakreft. For å karakterisere fenotypen av disse E006AA celler, ble Nog-SCID xenografttumorer fjernet og behandlet for histologisk og immunhistokjemisk analyse. Figur 1D illustrerer at E006AA celler er lokalt invasive, gjennomtrengende skjelettmuskelfibre på det lokale stedet av inokulasjon med de invaderende celler som viser kjennetegn funksjonene i forstørret og polymorfe kreft cellekjerner der AR protein uttrykk er synlig. Etter avtale med forrige serum analyse, gjorde E006AA xenograft cellene ikke flekker positivt for PSA (figur 1D), eller AR-regulert Nkx 3.1 proteiner (data ikke vist). I tillegg kreftcellene manglet uttrykk for basalcelle spesifikk markør, p63, men var positive for epiteliale cellemarkører cytokeratin 5 (CK5) (figur 1D), CK8 og CK18 (figur 1E), noe bekrefter epithelial opprinnelse E006AA celler [30], [31], [32].
for å utelukke en alternativ forklaring på hvorfor E006AA celler ble vist seg å være tumorigent i denne studien, men ikke-tumorigen i de opprinnelige studiene E006AA celler rutinemessig opprettholdt
in vitro
ble karyotyped direkte fra cellekultur (figur 2A) og funnet å ha en identisk, unormal karyotype som opprinnelig rapportert til E006AA cellelinjen [20]. Slike celler ble inokulert i nog-SCID verter og en stadig voksende svulst ble senere høstet for å re-etablere
in vitro
E006AA kulturer. Karyotype-analyse av disse tumor-avledede celler E006AA dokumentert den samme unormale karyotype, som vist i
in vitro
lysen cellelinje (figur 2B), noe som eliminerer muligheten for at E006AA celler ble genetisk ustabilt etter inokulering til NOG- SCID-mus og utviklet flere cytogenetiske forandringer som fullførte sin ondartet transformasjon til tumorigent variant.
(A) Karyotype analyse av E006AA celler før injeksjon og
in vivo
tumorvekst. (B) Analyse av E006AA celler avledet fra en NOG-SCID tumorbærende mus, dokumentere ingen vesentlige karyotypic endringer i løpet av tumorvekst.
Amplification, mutasjon, og uttrykk for AR i Castrate-Resistant E006AA Cells
Fluorescence
i Situ
Hybridisering (FISH) ble utført med sonder spesifikke for
AR
genet [Xq12] (rødt signal) og X-cent (grønt signal) ( Figur 3A). Mellomfase-analyse viste at i 91% av cellene ble undersøkt, var det to røde signaler forbundet med hver grønt signal. Siden det er en duplisering av X-kromosomet, betyr dette at i gjennomsnitt,
AR
gen forsterkes minst fire ganger i E006AA cellelinje.
(A) Cytogenetisk analyse av AR status i normale mannlige kontroll- og E006AA celler som bestemt ved fluorescens in situ hybridisering (FISH) ved anvendelse av sonder spesifikke for den AR-genet (Xq12, rødfarget) og X-cent (grønnfarget). (B) Sekvensering resultatene av overlappende primer PCR-amplifisering av E006AA mRNA og cDNA identifisert en missense mutasjon (Ser599Gly), som svarer til «X» -stillingen av den konserverte AXRND motiv i DBD D-boksen (som angitt med svart pilspiss i stilling
