Abstract
Tumor microenvironement er en viktig aktør for kreft progresjon i eggstokkene, men forholdet mellom mesenchymale celler og eggstokkreft celler forblir uklart. Målet med denne studien var å fastslå eggstokkreft cellenes biologiske endringer forårsaket av mesenchymale celler. For å løse dette problemet, brukte vi to forskjellige eggstokkreft cellelinjer (NIH: OVCAR3 og SKOV3) og co-dyrket dem med mesenchymale celler. Ved co-kulturen de ulike cellepopulasjoner ble sortert for å studere deres transkriptom og biologiske egenskaper. Transcriptomic Analysen avdekket tre biologiske funksjons gensamlingene ble beriket ved kontakt med mesenchymale celler. Disse var knyttet til økningen av metastatiske evner (adhesjon, migrasjon og invasjon), spredning og chemoresistance
in vitro
. Derfor kontakt med mesenchymale cellen nisje kan øke metastatisk initiering og ekspansjon gjennom modifisering av kreftceller. Tatt sammen disse funnene tyder på at veier som er involvert i hetero cellular interaksjonen kan være målrettet for å forstyrre kjøpt pro-metastatisk profil
Citation. Lis R, Touboul C, Raynaud CM, Malek JA, Suhre K, Mirshahi M , et al. (2012) Mesenchymale Cell Interaksjon med eggstokkreft celler Triggere Pro-Metastatisk egenskaper. PLoS ONE 7 (5): e38340. doi: 10,1371 /journal.pone.0038340
Redaktør: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Frankrike
mottatt: 9 februar 2012; Godkjent: 04.05.2012; Publisert: 30 mai 2012
Copyright: © 2012 Lis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne publikasjonen ble gjort mulig av en bevilgning fra Qatar National Research Fund under sitt nasjonale satsinger Program award nummer NPRP 09-1174-3-291 og NPRP 4-640-1-096. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle utsikt over Qatar National Research Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De fleste pasienter med eggstokkreft vanligvis dør av peritoneal sykdom [1]. Utvikling av peritoneal karsinomatose innebærer definerte kritiske trinn, inkludert celleavgivelse, interaksjon og adhesjon til mesothelial lag, og spredning i det sub-mesothelium [2]. Flere rapporter beskriver en pre-metastatisk nisje innenfor målorganet, tilrettelegge den første overlevelse av kreftceller [3], [4], [5].
mesenchymalceller (MCS) er pluripotente celler som gir opphav til en rekke av bindevevscelletyper [6]. Bone Marrow-avledet stamceller (BM-MSC) er rekruttert i betydelig antall til kreft områder hvor de bidrar til invasjon, metastaser, og motstand mot kjemoterapi av eggstokkreft cellelinjer [7], [8], [9], [ ,,,0],10], [11]. MSC har vist seg å bidra til eggstokkreft tumorigenicity gjennom endret produksjon av Bone Morfogenetisk Protein (BNIP2) fører til en økning av kreft i eggstokkene celle (OCC) spredning
in vitro Hotell og
in vivo product: [ ,,,0],12]. Mens mange studier fokuserer på spesifikke faktorer i oppkjøpet av metastatisk profil, kun få studier vurdere de globale transcriptomic endringene som skjer i kreftceller på deres interaksjon med mesenchymale stamceller (MSC) [13]. Zhang S et al.
13 rapporterte at modifiseringen av prostatakreft celle transkriptomet indusert ved interaksjon med MC. Endringene definert en ny pro-metastatisk tilstand. Forstå trasé påvirket av samspillet mellom kreftceller og deres mikromiljøet og de induserte globale endringer er obligatorisk for å kunne målrette mikro bestemte veier [13].
Her undersøker vi co-kulturen i to forskjellige typer OCC linjer med MCs. Vi viser at denne interaksjonen øker metastatiske evner OCC. Bruke transcriptomic analyse og funksjonelle analyser; Vi viser at gener relatert til mobilnettet tilslutning, invasjon, migrasjon, spredning og chemoresistance er endret på OCC /MC kontakt i en cellelinje bestemt måte. Våre resultater tyder på at bestemte veier kan være målrettet for å forstyrre kjøpt pro-metastatisk profil.
Materialer og metoder
Cell Kultur
Eggstokkreft cellelinjer SKOV3 (HTB-77 ) og OVCAR3 (HTB-161) ble kjøpt fra ATCC og vedlikeholdes i kultur følgende ATCC anbefalinger (DMEM høy glukose [Hyclone, Thermo Scientific], 10% FBS [Hyclone, Thermo Scientific], 1% Penicillin–Amphotericyn streptomycin B løsning [ ,,,0],Sigma], 1X Non Essential amino-Acid [Hyclone, Thermo Scientific]). Eggstokkreft cellelinjer ble stabilt transduced av lentiviral vektorer som koder EGFP (Genethon, Evry). Mesenchymale celler ble kjøpt fra stamceller, Inc (MSC-001F, Vancouver, CA) opprettholdt og utvidet i kultur ved hjelp MesenCult® MSC Basal Medium ferdig med Mesenchymale stamcellestimulerende kosttilskudd (Stamcelle Inc, Vancouver, CA). Deres evne til å differensiere i adipocytter, osteoblaster og chnodrocytes ble verifisert i henhold til instruksjonene leverandør (data ikke vist).
Co-kulturer
Vi etablerte co-kulturer av EGFP-OCC med BM- MC ved forhold på 01:02 i 24 timer. OCC ble differensiert fra BM-MC basert på deres EGFP og Ep-Cam. De forskjellige cellepopulasjoner ble sortert ved hjelp av fluorescens Activated Cell Sortering (FACS).
Fluorescent aktivert celle sortering
Celler ble høstet og blokkert i PBS-5% FBS-1% BSA-10% FcR Blokkering Reagens (Myltenyi Biotec). Enkeltcellesuspensjonen ble analysert og sortert på Sorp FACSAria2 (BD Biosciences). Data ble behandlet med FACSDiva 6.3 (BD Biosciences). Dubletter ble ekskludert av FSC-W × FSC-H og SSC-W x SSC-H-analyse ble enkelt farget kanaler som brukes for kompensasjon, og fluorophore minus én (FMO) kontrollene ble brukt for gating. EGFP fluorescens ble kjøpt med 488 nm blå laser og 510/50 nm utslipp, ble 50 000 hendelser ervervet per prøve. Diagrammer viser medianen av fluorescens intensitet (MFI) i forhold til kontroll. Under celle-sortering renhet-fase maske ble brukt. OCC monokulturer ble behandlet og sortert som kontroller.
genekspresjonsanalyser
Ved celle sortering mRNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens etterfulgt av rensing ved hjelp RNAeasy utvinning kit fra Qiagen. 200 ng av total RNA ble analysert på Affymetrix Genechip Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Data ble analysert ved hjelp av Partek programvare (St Louis, MO). Klasse sammenligning mellom ulike forhold (tre biologiske replikat) ble utført for å identifisere genuttrykk endringer med betydelige uttrykk forskjeller og to ganger økt eller redusert uttrykk [14], [15], [16]. Prinsipal komponent analyse (PCA) ble utført ved hjelp av Partek med standard innstillinger. Statistiske sammenligninger for microarray data ble beregnet ved hjelp av to-tailed Studenter t-test. Benjamini-Hochberg korreksjon ble brukt til å begrense positiv falske funnraten til 5%. Statistiske sammenligninger for kategoriske data ble oppnådd ved hjelp av Chi-squared test. Korrelasjoner ble utført ved anvendelse av Pearson korrelasjon. Alle andre statistiske sammenligninger ble beregnet ved hjelp av tosidige t-test.
Oppfinnsomhet Pathway Analysis
Vi brukte Oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare (IPA) (Oppfinnsomhet Systems, Redwood City, California) for nettverksanalyse av gener som er differensielt regulert ved ko-kulturen. Vi definerte globale genet listene representerer IPA søkeord: «metastaser», «Spredning av cellelinjer» og «Cell død av tumorcellelinje». Alle kanter er understøttet av minst en referanse fra litteraturen, lærebok, eller kanoniske informasjon som er lagret i oppfinnsomhet Pathways kunnskapsdatabase.
P-
verdier for anriking av biologiske funksjoner ble generert basert på den hypergeometriske fordelingen og beregnet med høyre-tailed Fishers eksakte for 2 × 2 krysstabeller som gjennomføres i oppfinnsomhet.
Overholdelse analyse
96 godt plater ble belagt med Matrigel (BD-biovitenskap). 20 000 OCC-EGFP ble sådd ut pr brønn og inkubert i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 15, 30 og 60 minutter. Ikke-adherente celler ble vasket bort. Heftende celler ble kvantifisert ved bruk av fluorescens plateleser (Wallac, Perkin Elmer) (488 nm eksitasjon, 510 emisjon). Alle funksjonelle forsøkene ble utført i biologiske triplicates.
Migrasjon /Invasion analyser
8 mikrometer porer Transwell permeable støtter ble belagt med Matrigel. 50 000 levedyktig OCC (sortert fra ko- og monokultur) ble sådd ut pr brønn og inkubert i 5% CO2 ved 37 ° C i 12 og 24 timer. OCC migrasjon og invasjon ble deretter vurdert ved hjelp av en fluorescens plateleser (Wallac, Perkin Elmer).
spredningsanalyse
5000 OCC ble sådd i monokultur eller på MSC-Morange enkeltlag i et serum gratis /cytokin frie medier. OCC ble talt hver to dager i løpet av 14 ble belagt med Matrigel. 50 000 dager under et mikroskop ved hjelp av GFP fluorescens. Hver dag ti feltene ble kvantifisert.
Chemoresistance
100000 OCC ble sådd i monokultur eller med BM-MSC i 1:02 ratio. Mono- og ko-kultur ble behandlet med 90 pM cisplatina og 6 pM paclitaxel (Sigma) i 24 timer. Cellene ble deretter farget med Calcein rød-oransje, LIVE /DEAD Aqua blå (Invitrogen, molekylære prober), CD73-APC (Biolegend, klone: AD2) i henhold til produsentens instruksjoner og analysert ved FACS. OCC ble definert som celler GFP + CD73-, stue OCC ble definert som calcein Rød-Oransje + LIVE /DEAD havbruk. 50 000 arrangementer ble kjøpt per prøve.
Statistisk analyse
Student-t-tester, Fisher nøyaktige tester og chi-kvadrat testene ble utført etter behov. Alle p-verdier er to-sidig med statistisk signifikans evaluert på 0,05 alfa-nivåene. Ninety-fem prosent konfidensintervall (95% KI) ble beregnet for å vurdere presisjonen i de innhentede estimater. All statistisk analyse ble gjort ved hjelp av dataanalyse plug-in for Microsoft Excel 2008.
Resultater
Endring av OCC transkriptomet ved interaksjon med MC
For å undersøke endringer av OCC transkriptomet på MC kontakt, vi utformet et coculture modell der OCC er dyrket alene (kontroll tilstand) eller i nærvær av MC (test tilstand) under 24 timer i et serum gratis, cytokin fritt medium. OCC (kontroll- og testforhold) ble deretter sortert etter FACS basert på deres co-uttrykk for epitelceller adhesjonsmolekyl (EpCAM, CD326) og den forbedrede-grønt fluorescerende protein (EGFP) (figur 1.a).
Contour plott som viser en typisk diskriminering av OCC og MC ved FACS. OCC ble definert som EGFP + EpCAM + (grønn befolkningen), mens MCs ble definert som EGFP-EpCAM- (mørk grå befolkningen). B. PCA analyse for eggstokkreft cellelinjer alene eller post-kontakt med mesenchymalceller
Ved MC kontakt, transkriptomet av de to cellelinjene vi testet (NIH. OVCAR3-EGFP og SKOV3 -eGFP) ble dramatisk endret (figur 1.B). NIH: OVCAR3 oppregulert betydelig 26 gener og downregulated 10 gener (Tabell S1); SKOV3 oppregulert betydelig 18 gener og downregulated 3 gener (Tabell S2). Endringer observert i de to eggstokkreft cellelinjer ikke tillate oss å etablere et felles gen signatur ved MC kontakt (figur 1.B, Tabell S1, Tabell S2). Men ved hjelp av Oppfinnsomhet Pathway Analysis programvare, var vi i stand til å identifisere tre biologiske funksjons klynger beriket ved kontakt med MC: «Metastase» (NIH: OVCAR3, p = 6,48 * 10
-6; SKOV3, p = 5.42 * 10
-5), «spredning av cellelinjer» (NIH: OVCAR3, p = 4.36.48 * 10
-7, SKOV3, p = 6,79 * 10
-6) og «Cell død av tumorcellelinje «(NIH: OVCAR3, p = 5,68 * 10
-8, SKOV3, p = 7,62 * 10
-5). Disse klyngene ble delt mellom NIH. OVCAR3-EGFP og SKOV3-EGFP (tabell 1)
Til sammen disse dataene indikerer at til tross for mangel på overlapp om genene opp-eller ned-regulert av MC kontakt, de samme biologiske funksjon klaser ble anriket i de to ovarian cancer cellelinje vi testet. I denne artikkelen har vi satt frem ideen om at MC utøve en pro-metastatisk effekt på OCC, derfor bestemte vi oss for å validere de biologiske funksjons klynger beskrevet i tabell 1 med
in vitro
eksperimenter.
MCs øke OCC metastase biologisk funksjon: tilslutning, migrasjon og invasjon
Peritoneal metastase innvielse innebærer tilslutning, migrasjon og invasjon gjennom mesothelium. Ved hjelp av IPA programvare, identifiserte vi en biologisk funksjon klynge: «metastase», som ble beriket på eggstokkreft celle kontakt med MC. Vi undersøkte derfor den biologiske effekt som tilsvarer denne genomisk pro-metastatisk modifikasjon utfører
in vitro
migrasjon, etterlevelse og invasjon analyser. Ved 24 timer co-kultur med MC, OCC (EpCAM + EGFP +) ble sortert (figur 1A). Vi testet OCC evne «til å følge ECM. OCC (NIH: OVCAR3 og SKOV3) ble utsådd på en Matrigel (BD Biosciences) -belagt godt i 10 min, 15 min, 30 min og 1 time. Vi definerte tilslutningen til ECM som rest GFP fluorescens vi var i stand til å tilegne seg følgende PBS vask. Som vist i figur 2. En, både eggstokk-kreft cellelinje viser en økt tilslutning til ECM: 1,38 gangers økning i forhold til kontroll for NIH: OVCAR3-EGFP på 10 min, og 1,94 ganger økning på 1 time, 1,28 og 1,85 gangers for SKOV3-EGFP på 10 min og 1 time hhv.
A. OCC-EGFP (NIH: OVCAR3, venstre diagram og SKOV3, rett diagram) ble sådd på en Matrigel (BD Biosciences) -belagt godt i 10 min, 15 min, 30 min og 1 time. Økt tilslutning til ECM er observert når OCC ble preemptively dyrket med MC (lys grå søyler) sammenlignet med kontrollgruppen (mørke grå søyler). B. Skjema representerer invasjonen og migrasjon analysen. C. Ordnet OCC ble sådd på (u) belagt transwells og GFP signal fra hver brønn under belagte membranen ble kjøpt etter 24 timer. Økt migrasjon og invasjon gjennom ECM er observert når OCC ble preemptively dyrket med MC (lys grå søyler) sammenlignet med kontrollgruppen (mørke grå søyler). SEM er representert, n = 3,
