Abstract
SLD5 er medlem av gin kompleks sammensatt av psf1, PSF2, PSF3 og SLD5, spiller en avgjørende rolle i dannelsen av DNA replikasjonsgaffelen med CDC45 i gjær. Tidligere hadde vi isolert en psf1 orthologue fra en murine stamcelle DNA bibliotek og var da i stand til å identifisere orthologues av alle de andre gin medlemmer av gjær to hybrid tilnærming ved hjelp psf1 som agn. Disse gin orthologues kan også fungere i DNA replikasjon i pattedyrceller fordi de danner tetramer komplekser som observert i gjær, og genet sletting mutanter av både psf1 og SLD5 resultat i mangel på epiblast spredning og tidlig embryodødelighet. Men vi fant ut at psf1 er også involvert i kromosomsegregering i M fase, i samsvar med de siste forslag som homologer av gener assosiert med DNA-replikasjon i lavere organismer også regulere andre enn DNA replikasjon i pattedyrceller cellulære hendelser. Her analyserte vi funksjonen til SLD5 annet enn DNA replikasjon og funnet ut at det er aktiv i DNA skade og reparasjon. Demping av SLD5 uttrykk gir markert DNA-skader i både normale celler og kreftceller, noe som tyder på at det beskytter mot DNA-skader. Demping av SLD5 forsinker DNA-reparasjonsrespons og cellesyklus restaurering i normale celler, men ikke i kreftceller. Disse funnene antyder at SLD5 kan representere en terapeutisk målmolekyl som virker på nivået av tumor stromale celler i stedet for kreftcellene selv, fordi utvikling av tumoren mikromiljøet kan bli forsinket eller avbrutt ved undertrykkelse av dets ekspresjon i de normale celletyper innenfor svulst
Citation. Gong ZY, Kidoya H, Mohri T, Han Y, Takakura N (2014) DNA Damage forbedret ved Demping av SLD5 Utsetter Cell Cycle Restaurering i normale celler, men ikke i kreftceller. PLoS ONE 9 (10): e110483. doi: 10,1371 /journal.pone.0110483
Redaktør: Ryuichi Morishita, Osaka University Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 12 august 2014; Godkjent: 15 september 2014; Publisert: 21 oktober 2014
Copyright: © 2014 Gong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den japanske departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi og Grants-i-Aid for Scientific Research (KAKENHI) fra Japan Society for fremme av vitenskap. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Nobuyuki Takakura er nå en faglig redaktør for tidsskriftet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Celler er stadig utsatt for genomisk DNA skader forårsaket av interne og eksterne agenter som oksidativt stress og UV, henholdsvis. Feil i DNA-skade reparasjon kan føre til kreftcelle utvikling [1], [2]. For å hindre onkogene transformasjon, normale celler overvåke og reparere DNA-skader i sitt genom ved å sette cellesyklus sjekkpunkter [3]. Imidlertid kreftceller er i stand til å tolerere DNA-skader, slik at replikasjon fortsetter uten reparasjon, noe som resulterer i akkumulering av unormal mutant genekspresjon [4]. Denne hendelsen har blitt foreslått som en av årsakene til kjemo- og radio-resistensutvikling i ondartede kreftceller.
SLD5 er medlem av gin kompleks sammensatt av psf1, PSF2, og PSF3. Dette komplekset regulerer DNA-replikasjon gaffel i spirende gjær [5]. Ved initiering av DNA-replikasjon, som er opphavet gjenkjennelse kompleks (ORC) binder til autonomt replikerende sekvens (ARS) som fungerer som en DNA-replikasjonsstart domene. Deretter celledeling syklus (CDC) 6 og Cdc1 binder seg til ARS guidet av ORC og indusere binding av mini-kromosom vedlikehold (Mcm) proteiner bort på ARS. Disse kalles pre-replikering komplekser (pre-RC) [6] – [8]. Videre Cdc45 og gin rekrutteres til pre-RC og danne aktivert CMG (Cdc45-Mcm-gin) helicase på DNA replikasjonsgaffelen [9] -. [12]
Vi identifiserte en mus orthologue av psf1 i et DNA-bibliotek avledet fra hematopoietiske stamceller i løpet av embryogenesen som denne cellepopulasjonen aktivt prolifererer [13]. Deretter identifiserte vi SLD5 bruker en gjær to-hybrid system med psf1 som agn [14]. Videre identifiserte vi alle medlemmer av gin i mus og bekreftet at de danner komplekser som observert i gjær [15]. Vi har tidligere rapportert at mutant mus mangel for psf1 eller SLD5 vise tidlig embryo dødelighet forårsaket av veksten arrestasjonen av epiblasts på embryonale dag 6,5 [13], [16]. Disse resultatene antydet at psf1 og SLD5 er funksjonelle i pattedyr og essensielt for celleformering, eventuelt assosiere med DNA-replikasjon som observert i gjær.
Høy ekspresjon av gin gener er blitt observert i kreft og en korrelasjon mellom graden av uttrykket med malignitet har blitt foreslått [17] – [19]. Vi rapporterte også at kreftceller som viser høyere psf1 promoter aktivitet er kreft initierende /stamceller i en murine tumorcelletransplantasjon modell [20]. En funksjon av ondartede kreftceller er kjemo- og radio-motstand. Høyt nivå uttrykk for gin gener kan indusere ikke bare cellevekst, men også motstand mot cellegift. Det har imidlertid ikke blitt fastslått om funksjonen av gin gener er involvert i DNA-skade eller reparasjon. Ved å observere benmargcellularitet i mutante mus, vi tidligere funnet at haploinsufficiency av psf1, men ikke SLD5, reduserer cellevekst [13], [16]. Derfor er det komplisert å analysere funksjonen av psf1 i DNA-skade ved å slå ned psf1 uttrykk fordi cellevekst i seg selv påvirkes også av mangel på denne faktor. Ved SLD5, heterozygot SLD5
+/- mus, som var sunn og fruktbar, ble født på mendelsk frekvens og utstilt normal vekst. Dessuten er det ingen stor forskjell på benmargcellularitet mellom vill og SLD5
+/- mus [16]. Derfor brukte vi SLD5
+/- mus embryonale fibroblaster (MEFs) for å analysere DNA-skade reparasjon og cellevekst etter DNA-skade. Videre sammenlignet vi funksjon SLD5 i DNA-skade reparasjon ved hjelp av siRNA knock-down eksperimenter i kreftceller.
Materialer og metoder
cellekultur og behandlings
MEFs, B16-celler (mus-melanomceller), og colon26 celler (mus koloncancer-celler) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Sigma) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sigma), og penicillin /streptomycin (Sigma) ved 37 ° C under en atmosfære av 5% CO
2. MEFs ble fremstilt fra villtype (WT) eller SLD5
+/- mus ved embryonisk dag (E) 15.5 i henhold til vanlige fremgangsmåter [16]. B16 celler og colon26 celler ble kjøpt fra Riken cell bank (Tsukuba, Japan). Celler ble behandlet med 1 pM eller 10 pM etoposid (Sigma). For å indusere DNA-skade på det sterkeste, brukte vi 10 mikrometer etoposid. Men 10 mm etoposid alvorlig indusert celle apoptose. Derfor brukte vi en mikrometer etoposid å observere cellesyklus restaurering. Dyrene ble plassert i miljø kontrollerte rommene på dyreforsøk anlegget ved universitetet i Osaka. Alle forsøkene ble utført i henhold til gjeldende lover og retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr i Research Institute for mikrobielle sykdommer, Osaka University, godkjent av dyreforsøk komité for Research Institute for mikrobiell sykdom, Osaka University (Permit nummer 3239- 6). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
siRNA transfeksjon
SLD5 uttrykk i B16 og Colon26 celler ble forbigående slått ned med små interfererende RNA (siRNA) . Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) ble anvendt for transfeksjon av plasmid og siRNA inn i cellene, etter produsentens protokoller, og eksperimentene ble utført 48 timer etter transfeksjon. Vi brukte to forskjellige siRNA oligonukleotider spesifikke for SLD5; Målet siRNA sekvenser var: 5′-GGA CCA CAC GGA GAC CCA CUU UAA A-3 «(# 1); 5»-GAU GAG CAG AGA GAC UAC GUG AUU G-3 «(# 2).
trypanblått eksklusjon test for celle levedyktighet og gjenvekst etter behandling med etoposid
5 × 10
3-celler ble sådd i hver brønn i en 24-brønners dyrkingsplate (BD Falcon) i 500 ul medium. Etter 24 timer ble brønnene utsatt for en uM etoposid i 12 timer. Etter at stoffet var fjernet, ble cellene høstet umiddelbart (0 timer). Cellelevedyktigheten ble evaluert ved trypan blå eksklusjon. Det samme antall levende celler ble resuspendert i friskt medium, og cellene ble dyrket i 24, 48 eller 72 timer. De ble deretter løsnet ved å tilsette 100 pl trypsin-EDTA til hver brønn; Cellene ble deretter vasket og resuspendert i 400 ul medium. 20 ul av re-suspenderte celler ble blandet med 20 ul av 0,4% oppløsning av trypan blått fargestoff (Life Technologies) i 1 min. Cellene ble umiddelbart telt ved bruk av et Neubauer mikrokammeret med et lysmikroskop. Alle tellinger ble gjort ved hjelp av fire tekniske duplikater av hver prøve. Middelverdier og standardavvik ble beregnet for hvert subkultur.
Western blotting
Celler ble oppsamlet og lysert i SDS-prøvebuffer (50 mM Tris-HCL, pH 6,8, 2% natriumdodecylsulfat, 6 % 2-merkaptoetanol, 10% glyserol, 0,003% bromfenolblått) inneholdende en cocktail av proteaseinhibitorer. Proteinene ble separert på 10% eller 15% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Etter blokkering i 1 time i TBST (25 mM Tris, pH 7,5, 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 0,05% Tween 20) som inneholdt 2% ikke-fett tørrmelk, ble membranene inkubert med anti-SLD5 (1:1000; Iwaki) , anti-γ-H2AX (1:500, Cell Signaling), anti-Rad51 (H-92, 1:1000, Santa Cruz), eller mus anti-β-actin antistoff i blokkeringsbuffer over natten. Membranene ble deretter vasket med TBST og inkubert med HRP-konjugert anti-rotte, kanin eller geit-antistoffer (1:10000) i 1 time. Bundede antistoffer ble påvist med ECL-sett (Amersham). De immunreaktive proteiner ble visualisert ved hjelp av ECL Prime Western blotting Detection System (GE Healthcare, Buckinghamshire). Blottene ble skannet med bilde densitometer Las-300 mini (Fujifilm, Tokyo, Japan).
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Elevens
t
test ble brukt for statistisk analyse. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant når
p
. 0,05
Resultater
Forbedret DNA-skader ved Demping av SLD5 uttrykk i MEFs
For å vurdere om SLD5 relaterer seg til DNA-skade respons, sammenlignet vi forskjellen mellom DNA-skade ved å bruke MEFs fra WT mus og SLD5
+/- mus [16]. Vi har bekreftet at nivået av SLD5 i SLD5
+/- MEFs var omtrent halvparten av det i WT MEFs (figur 1A og B). For å undersøke DNA-skader, utfordret vi MEFs med etoposid, en topoisomerase Π inhibitor som induserer DNA dobbel-tråd pauser [21], [22]. Celler ble behandlet med 0,01% DMSO som en kontroll, eller med 10 uM etoposid i 1 time. I den stabile tilstanden (eksponering til DMSO), graden av fosforylering av kromatin-bundet histon H2AX (γ-H2AX), som er en kvantitativ markør for DNA-skade respons på stedet av dobbelttrådsbrudd i [23], [ ,,,0],24], var tilsvarende lav i både WT og SLD5
+/- MEFs (figur 1C og D). Eksponering for etoposid førte til en økning i nivået av γ-H2AX i både WT og SLD5
+/- MEFs, men betydelig mer så i det sistnevnte (figur 1C og D).
(A) Western blot analyse av SLD5 uttrykk i WT og SLD5
+/- MEFs. β-actin ble den interne kontrollen. (B) Kvantitativ evaluering av SLD5 uttrykk som åpenbart i (A) basert på densitometrisk analyse. Resultatene er representert som fold-endring sammenlignet med nivået sett i WT MEFs. Data representerer gjennomsnittet ± SD. *,
P
0,05 (n = 3). (C) Western blot-analyse av γ-H2AX ekspresjon i WT og SLD5
+/- MEFs etter behandling med etoposid (ETO) eller kontroll bærer (DMSO). β-actin ble den interne kontrollen. (D) Kvantitativ evaluering av γ-H2AX uttrykk som åpenbart i (C). Resultatene er fold-endringer i forhold til nivået sett i WT MEFs behandlet med DMSO. Data representerer gjennomsnittet ± SD. *,
P
. 0,05 (n = 3)
Forsinkelse av cellesyklus restaurering av demping av SLD5 uttrykk i MEFs etter DNA-skade
Å belyse hvorvidt merket DNA-skade forårsaket av dempningen av SLD5 ekspresjon er relatert til DNA-skade reparasjon, målte vi nivået av Rad51 protein, som er den sentrale komponenten for homolog rekombinasjon [25]. Som beskrevet ovenfor, ble MEFs behandlet med 1 pM etoposid i 12 timer, og Rad51 protein-ekspresjon ble deretter analysert ved 0, 24, 48 og 72 timer etter dens fjerning (figur 2A, B). Nivået på Rad51 uttrykk var tilsvarende i WT og SLD5
+/- MEFs før behandling med etoposid. I WT MEFs, nivået på Rad51 økt betydelig raskt etter eksponering for etoposid, men i mindre grad i SLD5
+/- MEFs, og gradvis redusert på 24, 48 timer, nesten tilbake til utgangspunktet på 72 timer. I motsetning til dette, Rad51 protein i SLD5
+/- MEFs økes langsommere enn i WT MEFs og ble opprettholdt for en lengre tid. Dette tyder på at en lengre periode er nødvendig for DNA-reparasjon etter omfattende DNA-skader i SLD5
+/- MEFs. Langvarig DNA reparasjonstiden i SLD5
+/- MEFs i sin tur tyder på forsinket cellesyklusen restaurering etter DNA-skader. Derfor, vi telles antall levedyktige celler etter behandling med etoposid slik som beskrevet ovenfor. Celleformering ble bestemt ved trypan blå eksklusjon test. Det var ingen signifikant forskjell mellom WT og SLD5
+/- MEF proliferasjon etter eksponering for DMSO-kontroll (figur 3A), hvilket antyder at halvert SLD5 ekspresjon i MEFs ikke påvirker cellevekst selv. I motsetning til dette, ved å utsettes for etoposid, viste SLD5
+/- MEFs betydelig retardert cellevekst sammenlignet med WT MEFs (figur 3B).
(A) Western blot-analyse av Rad51 ekspresjon i WT og SLD5
+/- MEFs. β-actin ble den interne kontrollen. MEFs ble behandlet med etoposid i 12 timer (-12~0) og lysert ved de angitte tider. (B) Kvantitativ evaluering av Rad51 uttrykk som åpenbart i (A) basert på densitometrisk analyse. Resultatene er sammenlegg endring sammenlignet med nivået sett i WT MEFs før behandling med etoposid. Data representerer gjennomsnitt ± SD *,
P
. 0,05 (n = 3)
MEFs ble behandlet med DMSO (A) eller etoposid (B) som angitt i. Figur 2 og det samme antall av levende celler som indikert ble dyrket med friskt medium i 72 timer. Cellene ble talt ved den angitte tid. Data representerer gjennomsnittet ± SD. *,
P
0,05 (n = 3)
DNA-skade er forbedret i kreftceller ved demping av SLD5 uttrykk
I normale celler slike. som MEFs, ble DNA-skade sterkt indusert av dempningen av SLD5 uttrykk. Vi neste testet om kreftcellene viser også lignende svar til etoposid når SLD5 uttrykk ble forhindret. For dette formål ble SLD5 ekspresjon slått ned i B16 musemelanomceller og Colon26 mus tykktarmskreftceller ved å transfektere siRNA (# 1 og # 2) som er rettet mot SLD5 (siRNA B16 og siRNA Colon26). Vi bekreftet at SLD5 uttrykk kan bli effektivt brakt til taushet av spesifikke siRNA i B16 og Colon26 celler, men ikke av egge kontroll siRNA (SCR B16 og SCR Colon26) (figur 4A-D). Ved hjelp av disse cellene, vi kvantifisert DNA-skade ved å måle nivået av γ-H2AX ved Western blotting. Etter at vedlikehold i komplett medium i 48 timer, ble cellene behandlet med DMSO som en kontroll eller 10 pM etoposid i 0,5 time. Den initiale γ-H2AX ekspresjonsnivået var ikke høy på enten SCR B16 eller B16 siRNA-celler (figur 5A, B). Eksponering for etoposid ført til et økt nivå av γ-H2AX i begge SCR B16-celler og siRNA B16-celler, men det var signifikant høyere i den sistnevnte (figur 5A, B). Tilsvarende, i Colon26 celler, dempning av SLD5 ekspresjon forsterket DNA-skade forårsaket av etoposid (figur 5C, D). Tatt sammen, konkluderer vi med at SLD5 ekspresjon er relatert til DNA-skade i normale celler og kreftceller.
B16 eller Colon26-celler ble transfektert med egge negativ kontroll (SCR) eller SLD5 sirnas (# 1, # 2) og høstet 48 timer etter transfeksjon. SLD5 protein ekspresjonsnivåene i B16 (A, B) eller Colon26 (C, D) ble kvantifisert ved Western blotting. β-actin ble den interne kontrollen. Data ble kvantitativt evaluert basert på densitometrisk analyse (B, D). Resultatene er representert som fold-endring i forhold til nivået vist i siRNA-ubehandlede B16-celler (B) eller Colon26-celler (D), respektivt. Data representerer gjennomsnitt ± SD *,
P
. . 0,05 (n = 3)
Western blot analyse av γ-H2AX uttrykk i SCR eller SLD5 siRNA-transfektert B16 (A, B) eller Colon26 (C, D) celler etter behandling med etoposid (ETO) eller kontroll bærer (DMSO). β-actin ble den interne kontrollen. Data ble kvantitativt evaluert basert på densitometrisk analyse (B, D). Resultatene er sammenlegg endring sammenlignet med nivået sett i SCR siRNA-behandlede B16 celler (B) eller Colon26 celler (D), henholdsvis. Data representerer gjennomsnittet ± SD. *,
P
0,05 (n = 3)
Demping av SLD5 uttrykk i kreftceller ikke forsinke cellesyklusen restaurering etter DNA-skader
. spådd at demping av SLD5 uttrykk ville forsinke DNA-reparasjon og cellesyklus restaurering i kreftceller som observert i normale celler. Imidlertid, selv om nivået av Rad51 ekspresjon var den samme i SCR B16 og SLD5 siRNA B16-celler, og i SCR Colon26 og SLD5 siRNA Colon26 cellene før behandling med etoposid, deretter en rask økning av Rad51 ble likeledes observert i alle fire cellelinjer ( Figur 6A-D). Tilsvarende den som er merket DNA-skader i siRNA B16 og siRNA Colon26 celler, ble langvarig høyt nivå Rad51 uttrykk observert i disse linjene. Således, en lengre periode for DNA-reparasjon var felles for normale celler og kreftceller, men avtok hurtig respons til DNA-skade som følge av dempningen av SLD5 ekspresjon i normale celler ble ikke sett i kreftceller.
eller SCR SLD5 siRNA transfekterte B16 (A, B) eller Colon26 (C, D) celler ble behandlet med etoposid i 12 timer (-12~0). Celler ble lysert ved de angitte tider. Western blot analyser av ekspresjon Rad51 er vist. β-actin ble den interne kontrollen. Data ble kvantitativt evaluert basert på densitometrisk analyse. Resultatene er sammenlegg endring sammenlignet med nivået sett i SCR B16 (B) eller SCR Colon26 (D) før behandling med etoposid. Data representerer gjennomsnitt ± SD *,
P
. . 0,05 (n = 3)
For å vurdere hvordan rask respons på DNA-skade i SLD5 slått ned kreftceller påvirker cellesyklus restaurering, nummerert vi cellene etter behandling med etoposid. Celleproliferasjon i seg selv var ikke påvirket av banket ned SLD5 i enten siRNA B16 eller siRNA Colon26-celler i nærvær av kontroll DMSO behandling (Figur 7A, C). Førti-åtte timer etter etoposid-mediert DNA-skader, var det bare en liten forsinkelse av cellesyklus restaurering i både siRNA B16 og siRNA Colon26 i forhold til det man ser i SCR B16 og SCR Colon26. Imidlertid, etter 72 timer ble cellevekst indusert i SLD5-dempede kreftceller i samme grad som i kontroller i både B16 og Colon26 celler (figur 7B, D). Derfor konkluderer vi med at omfattende DNA-skader som følge av demping av SLD5 uttrykk alvorlig påvirker cellesyklus restaurering i normale, men ikke kreftceller.
SCR eller SLD5 siRNA transfekterte B16 (A, B) eller Colon26 (C, D ) celler ble behandlet med DMSO (A, C) eller etoposid (B, D) som vist i Figur 6, og det samme antall av levende celler som indikert ble dyrket med friskt medium i 72 timer. Celle tall ble registrert. Data representerer gjennomsnitt ± SD *,
P
. 0,05 (n = 3)
Diskusjoner
Det har blitt rapportert at SLD5 danner en gin. kompleks med andre grupper, såsom psf1, PSF2, og PSF3 og er involvert i DNA-replikasjon i gjær [5]. I den foreliggende rapporten, foreslår vi at SLD5 er involvert i DNA-skade og reparasjon i pattedyrceller. Demping av SLD5 uttrykk resulterte i markert DNA-skade av agenter fremme DNA-dobbelttrådbrudd; dette var vanlig for normale celler og kreftceller. En lengre periode var nødvendig for restaurering av cellesyklusen når DNA-skade ble omfattende. For dette svaret, cellene trenger for å forbedre DNA reparasjon. Når SLD5 uttrykk ble redusert i normale celler, ble uttrykk for Rad51 forsinket, noe som tyder på at SLD5 er også involvert i DNA reparasjon protein montering. I motsetning til dette ble hurtig Rad51 ekspresjon indusert i kreftceller etter DNA-skade og forsinkelse av cellesyklus restaurering var ikke så alvorlig som i normale celler. Roller av gin gener i andre typer kreft har blitt rapportert [17], [26]. Derfor antyder det at funksjonen av SLD5 i DNA-skade og reparasjon blir også benyttes i andre tumorcelletyper enn melanom og kolon kreftceller som brukes i våre eksperimenter. Ytterligere eksperimenter kreves for å klargjøre dette
Som beskrevet ovenfor, er gin komplekset er involvert i DNA-replikasjon.; men trenger gin komponenter psf1, PSF2, PSF3, og SLD5 ikke alltid danne komplekser og kan ha andre funksjoner. For eksempel, regulerer psf1 microtubuli organisasjon i M fase og er involvert i kromosom segregering [20]. Nylig har det blitt rapportert at homologe molekyler assosiere med DNA-replikasjon i lavere organismer kan også regulere andre enn DNA-replikasjon [27] cellulære hendelser – [29]. Derfor er det mulig at SLD5, et molekyl som er involvert i DNA-replikasjon i gjær, er også involvert i DNA-skade reparasjon. En tidligere rapport antydet at DNA-skade forhindres når kromatin kondensert med histone [30]. Men under DNA replikasjon, er nakent DNA skilt fra histon og er truet av agenter som induserer DNA-dobbelttrådbrudd. Hvordan SLD5 beskytter mot DNA-dobbelttrådbrudd er så langt uklart, men det kan være involvert i histone modifikasjon. Videre presis analyse er nødvendig for å belyse mekanismen av DNA-skade beskyttelse som gis ved SLD5.
Det var å vente at en lengre periode ville være nødvendig for DNA-reparasjon i celler med dårligere DNA-skade som et resultat av mangel på SLD5. Vi antok at rask Rad51 uttrykk ville bli indusert i SLD5
+/- MEFs sammenlignet med WT MEFs for reparasjon sterkt skadet DNA. Imidlertid SLD5 dempning ble funnet å forsinke Rad51 ekspresjon i MEFs, noe som resulterer i alvorlige retardasjon av cellesyklus restaurering. Disse funnene antydet at SLD5 ikke bare beskytter mot DNA-skader, men regulerer hurtighet av DNA-reparasjon. Nylig er det blitt rapportert at PSF2, også et medlem av gin-komplekset, fosforylert av ATM på DNA-trådbrudd [31]. Derfor er det mulig at PSF2 er involvert i DNA-reparasjon også. Videre har det blitt rapportert at de N-terminale og C-terminale områder i Sld5 samhandle med den N-terminale og C-terminale regioner av Psf2 i krystallstrukturen av humane gin komplekset [32], og Sld5 ble funnet å samhandle etter to-hybrid med PSF2 i
Drosophila product: [33]. Det vil være interessant å analysere samspillet mellom SLD5 og fosforylert PSF2 under DNA-reparasjon.
Nyere studier har vist at tumorvekst og metastase bestemmes ikke av kreftceller alene, men også av ulike stromale celler. Stroma utgjør en stor del av de fleste faste tumorer og kreft-celle-interaksjon stromal bidrar funksjonelt til tumorvekst og metastase [34], [35]. Tumor stroma inneholder mange forskjellige typer celler, inkludert kreft-assosiert fibroblaster (CAF), pericytes, endotelceller, infiltrert immunceller. Blant dem, kafeer er hovedcelletype som spiller en avgjørende rolle i tumorigenese og metastase [36], [37]. Resultatene av våre forsøk har vist at dempningen av SLD5 induserte markert DNA-skade og undertrykket hurtig cellesyklus restaurering i MEFs. Derfor spådde vi at SLD5 hemmere kan være kandidat anti-kreft narkotika. Vi fant ut at i kreftceller, er DNA-skade sterkt indusert av stanse SLD5 uttrykk, som observert i MEFs; Men Rad51 økt raskt og cellesyklus restaurering ble ikke sterkt berørt. Dette tyder på at kreftceller har ekstra DNA-reparasjon maskiner, uavhengig av SLD5, og dermed opprettholde proliferativ kapasitet. Dempe SLD5 i kreftceller kan derfor ikke være effektiv som en strategi for å hemme tumorvekst. Imidlertid, ikke bare kreftceller, men også normale celletyper som for eksempel endotelceller og fibroblaster prolifererer i tumoren mikromiljøet støtte veksten av svulsten som stromal cellekomponenter [38] – [40]. Blokkering av angiogenese har vist seg å være en effektiv strategi ved inhibering av tumorvekst og metastase [41]. Derfor tie SLD5 ekspresjon eller undertrykkelse av SLD5 funksjon av en liten forbindelse eller en nukleosidanalog som mikroRNA i tumor stromale celler kan inhibere utvikling av tumoren mikromiljøet, og kan være en lovende metode for å hemme tumorvekst i likhet med den strategi til hemning av tumor angiogenese.
takk
Vi takker Ms K. Fukuhara, Ms Fujimoto for teknisk assistanse.
