Abstract
Resveratrol, hentet fra kinesisk urtemedisin Polygonum cuspidatum, er kjent for å hemme invasjon og metastasering av menneskelige tykktarmskreft (CRC), hvor lang ikke-kodende metastaser Associated Lung Adenocarcinoma Avskrift 1 (RNA-MALAT1) spiller også en viktig rolle. Ved hjelp av MALAT1 lentiviral shRNA og over-ekspresjonskonstruksjoner i CRC-avledede cellelinjer, LoVo og HCT116, demonstrerte vi at anti-tumor-effekter av resveratrol for CRC er gjennom inhibering Wnt /β-catenin signalering, og dermed ekspresjonen av dets målgener såsom c-Myc, MMP-7, så vel som ekspresjon av MALAT1. I detalj resveratrol nedregulerer MALAT1, noe som resulterer i redusert nukleær lokalisering av β-catenin således svekkede Wnt /β-catenin signalering, noe som fører til hemming av CRC invasjon og metastase. Dette funnet av oss gir sikkert viktig pre-kliniske bevis som støtter fremtidig bruk av resveratrol i forebygging og behandling av CRC
Citation. Ji Q, Liu X, Fu X, Zhang L, Sui H, Zhou L, et al. (2013) Resveratrol hemmer invasjon og metastasering av tykktarmskreftceller via MALAT1 mediert Wnt /β-catenin Signal Pathway. PLoS ONE 8 (11): e78700. doi: 10,1371 /journal.pone.0078700
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 9 mai 2013; Godkjent: 15 september 2013; Publisert: 11.11.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81202812, 81303102, 81303103), Program for Shanghai Municipal Education Commission (2011JW57, 12YZ058), Shanghai Municipal Health Bureau (ZYSNXD-CC-YJXYY-JS20, 2011ZJ030, 20114Y001, 20114037), Shanghai Key Laboratory of tradisjonell kinesisk klinisk medisin (C10dz2220200). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP er resultatene av mutasjon av multiple gener, inkludert proto-onkogener og tumorsuppressorgener. Som onkogener som kontrollerer celledeling gjenværende sterkt uttrykt, eller tumorsuppressorgener som blir mutert, de resulterende kreftceller unngå immunsystemet, danne tumorer i distale steder /organer, dvs. metastase og terminalen stadium av kreft begynner [1].
Fremveksten veksten~~POS=HEADCOMP av nye kinesisk medisin monomer kreftmedisiner har gitt et nytt alternativ til reptoire av syntetiske stoffer for kreftbehandling [2]. Polygonum cuspidatum er de jordstengler og rot i Tateshina flerårig urt – Polygonum cuspidatum [3]. Tidligere data viste at Polygonum cuspidatum hatt forskjellige hemmende effekter på tumor, bakterielle /virale infeksjoner og betennelser [3] – [7]. Resveratrol ekstrahert fra Polygonum cuspidatum er en naturlig antioksidant, som kan redusere blod viskositet, hemmer blodplateaggregasjon og vasodilatasjon, opprettholde blodstrømmen, og hindre forekomst og utvikling av kreft [8] – [10].
Tidlig i 2003, Ji
et al
først identifisert lang ikke-kodende RNA – MALAT1. I 225 tilfeller av stadium I ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), ble det funnet i 70 tilfeller, korrelerer metastaser med MALAT1 over-uttrykk i et kurs og vev bestemt måte, noe som tyder på at MALAT1 uttrykk kan tjene som en potensiell markør for overlevelse i trinn 1 NSCLC [11]. Videre er andre grupper viste at MALAT1 over-uttrykker i lever, cervical og tykktarmskreft [12] – [14]
Mange studier har vist at Wnt /β-catenin signalveien regulerer tumorcelleinvasjon og metastase.. Soichi
et al
funnet at i orale squamous cell carcinoma celler, akkumulering av β-catenin i cytoplasma induserer TCF /LEF transkripsjonen aktivitet, og øke MMP-7 uttrykk, for derved å bevirke omdannelsen av epitelceller til mesenchymalceller samt styrke invasjon og metastasering [15]. Guo
et al
vist i CRC-HT29-cellelinjen, NGX6 genproduktet hemmet overføring av β-catenin fra kjernen og cytoplasma til cellemembranen, for derved å inhibere den transkripsjonelle aktivitet av TCF og nedregulering av ekspresjon av wnt målgener c-myc, cyclinD1 og COX-2, som fører til redusert kreftcelle invasjon og metastasering [16].
Våre nåværende studier avhørt de mekanismer som resveratrol regulerer MALAT1 og wnt /β-catenin signalveien , noe som resulterer i trykt kreft celle invasjon og metastasering.
Materialer og metoder
in Situ Hybridisering på vevsprøver fra pasienter med CRC
Parafin-embedded tumor og tilstøtende normale vevsprøver fra 60 CRC pasienter som gjennomgikk tumorreseksjon på Putuo Hospital, Shanghai Universitetet i tradisjonell kinesisk medisin (SUTCM) mellom 2010 og 2012 ble valgt for hybridisering med digoxigenin (DIG) -merket MALAT1 DNA-probe (Shinegene molekylær bioteknologi, Shanghai, Kina). Forsøket ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Tanner
et al product: [17]. Studien ble godkjent av etikk komité av Pu Tuo Hospital, SUTCM og alle pasientene ble gitt med skriftlig informert samtykke.
Screening av kinesisk medisin Monomer kreft narkotika på MALAT1 Expression i LoVo Cells
LoVo -celler (avledet fra venstre supraclavicular region metastase, Dukes type C, klasse IV, kolorektal adenokarsinom) ble dyrket i F12K-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 g /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin, ved 37 ° C, 5% CO2, og høy luftfuktighet. Alle de kinesiske medisin monomer kreft narkotika ble seriefortynnet å oppdage halv hemming konsentrasjon på spredning av LoVo celler. Proliferasjon av LoVo-celler ble bestemt ved celletelling leder-8 (CCK-8) analyse som beskrevet tidligere [18]. Sanntids PCR ble brukt for å påvise inhibering frekvensen av kandidat legemidler på MALAT1 uttrykk. For sanntid PCR-analyse, ble det forover primer, revers primer, og Taqman probe konstruert på følgende måte: forover (5-AGGCGTTGTGCGTAGAGGA-3), omvendt (5-GGATTTTTACCAACCACTCGC-3), TaqMan probe (5-fam + CCTAGACCAGCATGCCAGTGTGCC + tamara-3). Real time PCR ble utført på Applied Biosystems 7300 System (Applied Biosystems Deutschland GmbH) bruker Premiks Ex Taq (Takara, Dalian, Kina). GAPDH ble anvendt som intern referanse
knockdown og over-ekspresjon av MALAT1 Gene
Humant MALAT1 cDNA (Gene ID: 378938). Ble amplifisert ved RT-PCR med RNA ekstrahert fra LoVo-celler, og deretter klonet inn i vektoren pLV4. MALAT1 ble søkt etter passende siRNA målsekvenser ble tre siRNA sekvenser designet, syntetisert, og bekreftet ved sekvensering hhv. Lentiviral partiklene ble produsert av co-trans ekspresjonsvektor pLV4-MALAT1 cDNA eller pLV4-MALAT1 shRNA med viral partikkel emballasje hjelper vektor i 293T celler. Innledende forsøk plukket ut de mest effektive siRNA sekvenser av knockdown fra de ovennevnte tre kandidat siRNA (figur S1): forstand 5′-GAGGUGUAAAGGGAUUUAUTT-3 «, anti-sense 5′-AUAAAUCCCUUUACACCUCTT-3′; med en negativ kontroll siRNA sekvens: 5»-følelse UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «., anti-sense 5»-ACGUGACACGUUCG
GAGAATT-3′. Titer på viruspartikler inneholdende MALAT1 shRNA og MALAT1 cDNA ble bestemt ved seriefortynning begrenset. Effektiviteten av knockdown eller over-ekspresjon ble bestemt ved sanntids-PCR. LoVo celler eller HCT116-celler ble infisert med lentivirus med pLV4-MALAT1 cDNA, pLV4-MALAT1 shRNA eller pLV4-vektor.
luciferaserapportørplasmid analysen
For å teste MALAT1 promoter eller LSF /TCF promoter aktivitet, LoVo-celler ble ko-transfektert med enten det rekombinante plasmid pGL3-basis-MALAT1 promoter eller pGL3-basis-LEF /TCF-promoteren med et styre positiv plasmid PRL-SV40 som tidligere beskrevet [19]. Arrangøren aktivitet ble analysert ved hjelp av en kommersiell dual-luciferase assay kit (Beyotime Institutt for bioteknologi, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner.
Migrasjon og invasjon analysen
Det er totalt 5 × 10
5 LoVo-celler dyrket i 100 pl F12K med 0,5% FBS ble sådd på den øvre del av en transwell kammer (Corning Incorporated, Corning, NY). For migrasjon analyse, i den nedre del av kammeret, ble 600 ul F12K med 15% FBS og 10 ug /ml fibronektin tilsatt og analysen ble utført i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2. Migrerte celler ble analysert ved hjelp av krystall-fiolett farging, etterfulgt av å observere under en DMI3000 B invertert mikroskop (Leica, Tyskland). For invasjon analyse ble 100 ul matrigel (BD, USA) først tilsatt til bunnen av transwell kammeret før LoVo-celler ble sådd, og de følgende fremgangsmåtene var de samme som migreringsanalyse, med unntak av de invasive cellene som blir analysert etter ko-kulturen i 48 timer. Som å HCT116 cellene, prosedyrene var like, den eneste forskjellen var celler blir dyrket med RIPM 1640.
Western Blot
Hele cellen, cytoplasma, og kjernefysiske proteiner fra LoVo eller HCT116-celler ble forberedt i henhold til produsentens instruksjoner ProteoJET Cytoplasmatiske og Nuclear Protein Extraction Kit (Fermentas, USA). Proteiner ble applisert på SDS-PAGE-geler og elektroforese, overført til PVDF-membraner og blokkert i 5% melk før inkubering med de angitte primære antistoffer og de sekundære antistoffer. De resulterende immunkomplekser ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens. Protein lasting ble normalisert ved β-aktin (hele protein eller cytoplasma protein) eller PCNA (kjernefysisk protein).
RNA-bindende protein Immunpresipitasjon
RNA-bindende protein immunoprecipitation (RIP) ble utført i henhold til produsentens protokoller fra EZ-Magna RIP Kit (Millipore, USA). Kort sagt ble LoVo-celler ble skylt med iskald fosfatbufret saltløsning (PBS), lysert ved RIP lysisbuffer. Både β-catenin (CST, USA) og ikke-spesifikke kontroll kanin IgG-antistoffer ble anvendt for immunopresipitering. RIP lysatene og magnetiske kuler-bundet β-catenin antistoff ble inkubert sammen med roterende for natten ved 4 ° C. Etterpå ble proteiner i immunpresipitatet fordøyd med proteinase K og bundet RNA ble renset fra supernatantene, reverse-transkribert ved hjelp PrimeScript RT REAGENSSETTET fulgt av kvantitativ analyse.
Inmunofluorescence Mikros
LoVo celler ( 2,5 x 10
5) ble dyrket på kammers objektglass (Millipore, USA) i 8 timer, sultet i 12 timer. Celler ble fiksert i 40 minutter med 4% paraformaldehyd i PBS ved romtemperatur, permealized og blokkert med 5% ikke-fettholdig tørrmelk, 1% BSA, 0,5% Triton X-100 og inkubert over natten med kanin monoklonalt anti-β-catenin ( CST, USA). Etter vasking av glassplatene, ble Cy3-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff (Beyotime Institute of Biotechnology, Kina) tilsatt i blokkeringsløsning i 1 time. 4-6-diamidino-2-fenylindol ble påført beis kjerner. Immunofluorescence bildene ble tatt med en DMI3000B invertert mikroskop (Leica, Tyskland).
Statistical Analysis
Alle data ble presentert som betyr SEM. De gjennomsnittlige verdier av to grupper ble sammenlignet ved Student «s
t
test. Assosiasjoner mellom uttrykket av MALAT1 og clinicopathological parametre ble analysert ved hjelp av Fishers eksakte test, chi-kvadrat tester eller kontinuitet korreksjon chi-kvadrat tester av SPSS18.0 programvare.
Resultater
1. MALAT1 er overuttrykt i Colorectal Cancer Vev og korrelerer med metastase og Invasion
Bruk
in situ
hybridisering, fant vi at det var høyere uttrykk av MALAT1 i kolorektal kreft vev (CRC) enn tilstøtende normalt kolorektal vev (Figur 1 og Tabell 1). Vi neste utført korrelasjonsanalyse mellom MALAT1 uttrykk og clinicopathological karakteristikker av CRC. En statistisk signifikant sammenheng ble observert mellom MALAT1 uttrykk og omfanget av metastaser og invasjon. I motsetning til tilstøtende normale vev, det MALAT1 ekspresjon i CRC vev resektert fra pasienter med metastatiske sykdommer som var høyere enn de med ingen metastaser (tabell 2). Denne foreningen mellom MALAT1 uttrykk og omfanget av metastaser og invasjon ble også bekreftet av Real Time PCR (figur S1).
In situ
hybridisering ble brukt for å undersøke MALAT1 uttrykk i 60 parafin-embedded svulstvev og tilstøtende prøver av CRC pasienter normalt vev.
2. Resveratrol Hemmer spredning, migrasjon og invasjon av LoVo Cells
For å screene kinesisk medisin monomer kreft narkotika som hemmet MALAT1 uttrykk i LoVo celler, vi først undersøkte effekten av kandidat narkotika på spredning av LoVo celler, og beregnet halv inhiberingskonsentrasjon (IC50) av alle kandidat legemidler (tabell 3). Neste vi undersøkt effekten av kandidat legemidler på inhibering av MALAT1 uttrykket. Våre resultater viser at resveratrol og osthole var de 2 øverste kreft narkotika med hensyn til å hemme MALAT1 uttrykk, med resveratrol å være den beste blant disse to (figur 2A). Derfor valgte vi resveratrol for våre videre studier på MALAT1 og relaterte mekanismer. Med våre data viser en resveratrol IC50 på 55 mikrometer i lovo celler (figur 2B), ble stoffet doser på 15, 30 og 50 mikrometer dermed valgt for å undersøke av resveratrol effekt på invasjonen og migrasjon evner av kreftceller. Våre resultater viste LoVo celler ble betydelig hemmet på deres evne til å invadere og migrere av resveratrol, på en doseavhengig måte (figur 2C)
(A):. Tjueto kandidat kinesisk medisin monomer kreft narkotika ble testet for de effektive hemming doser på MALAT1 uttrykk i LoVo celler. (B): Korrelasjon av resveratrol legemiddeldoser og veksthemming i LoVo celler. Y-aksen: Prosent av veksthemming; X-aksen: resveratrol konsentrasjoner (mm). (C): Vurdering og kvantifisering av cellemigrering og invasjon av LoVo-celler. Verdier representerer antall trekkende /invasive celler per 5 høy effekt felt. *
p
0,05 eller **
p
. 0,01, sammenlignet med kontroll LoVo celler
3. Resveratrol Hemmer Nuclear Lokalisering av β-catenin, Nivåer av sine Nedstrøms Proteiner og MALAT1 Expression i LoVo Cells
Deretter fant vi at resveratrol dempes den cellulære lokalisering av β-catenin, et protein som regulerer kreftcelle invasjon og metastasering. Som vist i figur 3A, på en doseavhengig måte, resveratrol forbedret cytoplasmisk nivåer av β-catenin, mens redusere dens tilstedeværelse i kjernen, med liten effekt på den totale cellulære β-catenin protein.
( A): Totale eller celleekstrakter av forskjellige cellulære fra LoVo-celler ble behandlet med resveratrol ble probet for β-catenin. β-catenin protein nivåer ble kvantifisert. *
p
0,05 eller **
p
0,01, sammenlignet med kontrollgruppen. (B): Totale celleekstrakter av LoVo-celler ble behandlet med resveratrol ble probet for c-Myc, MMP-7, og proteinnivåer ble kvantifisert. *
p
0,05 eller **
p
0,01, sammenlignet med kontroll LoVo celler. (C): Uttrykket nivåer av MALAT1 fra LoVo-celler ble behandlet med angitte doser av resveratrol ble bestemt ved sanntids-PCR. De relative MALAT1 promoter aktiviteter i LoVo celler behandlet med angitte resveratrol doser ble målt. *
p
0,05 eller **
p
. 0,01, sammenlignet med kontroll LoVo celler
Vi neste undersøkt uttrykk for nedstrøms β-catenin målgener i nærvær av resveratrol, for den viktigste rollen β-catenin i kjernen er gjennom forskrift om gentranskripsjon. Ikke overraskende, har vi funnet at ekspresjonen av β-catenin nedstrøms målgener c-Myc og MMP-7 ble signifikant redusert ved resveratrol, på en doseavhengig måte (figur 3B). Disse data indikerte at resveratrol kan hemme kreft celle invasjon og migrasjon gjennom undertrykke Wnt /β-catenin signalveien.
Videre oppdaget vi at resveratrol nedregulert uttrykk for lange ikke-kodende RNA-MALAT1 i en dose -avhengig måte (Figur 3C). For å verifisere effekten av resveratrol på MALAT1 uttrykk, brukte vi MALAT1 promoter dual-luciferase reporter system og fant at resveratrol hemmet arrangøren aktivitet MALAT1, f.eks direkte bare 10% promoter-aktivitet ble oppnådd med 50 uM av resveratrol i forhold til kontroll (figur 3D). Disse data antydet at resveratrol har direkte innvirkning på MALAT1 gentranskripsjon.
4. MALAT1 Fremmer spredning, Invasion og migrasjon, og Øker Nuclear Lokalisering av β-catenin og Nivåene av sine Nedstrøms genprodukter i LoVo Cells
Deretter bruker lentivirus-mediert konstruerer, vi slått ned eller over uttrykt MALAT1 genet uttrykk i LoVo celler. Våre data viser tydelig at proliferasjonen og invasjon /migrering evne til LoVo-celler ble signifikant redusert ved MALAT1 knockdown, og økes med MALAT1 over-uttrykket (figur 4A, 4B)
(A):.
i vitro
vekst av LoVo celler som uttrykker MALAT1-shRNA, MALAT1-overekspresjon, tom vektor vs foreldre celler. (B): Vurdering og kvantifisering av cellemigrering og invasjon av indikerte LoVo-celler i A. Verdier representerer antall trekk /invaderende celler pr 5 høye strømfelt. *
p
0,05 eller **
p
. 0,01, sammenlignet med kontroll LoVo gruppe
Når vi slått ned, MALAT1 genuttrykk ved hjelp shRNA konstruere i LoVo celler, var vi overrasket over å finne at β-catenin protein ble beholdt i cytoplasma mens dens tilstedeværelse i kjerner ble remarkedly økt (figur 5A). I tillegg fant vi MALAT1 knockdown redusert uttrykk av β-catenin nedstrøms målgener som c-myc, MMP-7, som MALAT1 overuttrykk gjorde det motsatte (figur 5B). Dette settet med data antydet sterkt at resveratrol hemmet av spredning, invasjon og migrasjon egenskaper CRC celler via nedregulering av MALAT1 uttrykk
(A). Hele eller celle ekstrakter av ulike cellulære avdelinger fra LoVo celler uttrykker MALAT1 -shRNA, MALAT1-overekspresjon, tom vektor ble analysert for β-catenin og proteinnivåene ble kvantifisert. *
p
0,05 eller **
p
0,01, sammenlignet med vektor kontroll. (B): Hele eller celleekstrakter av forskjellige cellulære fra LoVo-celler som uttrykker MALAT1-shRNA, MALAT1-overuttrykt, ble tom vektor probet for c-Myc, MMP-7, og proteinnivåer ble kvantifisert. *
p
0,05 eller **
p
. 0,01, sammenlignet med vektor kontroll
5. Overekspresjon av MALAT1 redder LoVo Celler fra Trykt migrasjon og invasjon av Resveratrol
For å bekrefte våre funn av resveratrol undertrykke migrasjon og invasjon av LoVo cellene gjennom MALAT1, ble en MALAT1 redning eksperiment utført. Våre resultater viser at lentivirus-mediert overekspresjon av MALAT1 betydelig svekket resveratrol-indusert hemming av cellemigrasjon og invasjon i LoVo celler (Figur 6A). Med andre ord, kan overekspresjon av MALAT1 reversere effekten av resveratrol. I tillegg vestlige blot Resultatene viste at overekspresjon av MALAT1 reverseres effekten av resveratrol på kjernefysisk β-catenin og protein uttrykk av c-myc og MMP-7 i LoVo celler (figur 6B).
(A) : LoVo-celler som uttrykker MALAT1-overuttrykt, tom vektor ble behandlet med eller uten 50 mM resveratrol i 48 timer og cellulær migrering og invasjon evne ble målt. (B): Hele eller celleekstrakter av forskjellige cellulære fra LoVo-celler som uttrykker MALAT1-overuttrykt, tom vektor behandlet med eller uten 50 mM resveratrol ble probet for β-catenin, c-Myc, MMP-7, og proteinnivåer ble kvantifisert . *
p
0,05 eller **
p
. 0,01, sammenlignet med LoVo celler behandlet med 50 mikrometer resveratrol
6. Resveratrol Hemmer Wnt /β-catenin Signa via MALAT1
Vi antok at resveratrol hemmet Wnt /β-catenin signalveien gjennom MALAT1 regulering. For å teste denne hypotesen, brukte vi farging og Western blot analyser for å observere om β-catenin trans-plassert fra cytoplasma til kjernefysisk med tilstedeværelse av resveratrol og manipulering av MALAT1 uttrykk nivåer. For å gjøre virkningen mer åpenbare, brukte vi LiCl for å inhibere GSK3P fra å binde til P-catenin protein, for å øke den aktive status for Wnt /β-catenin signalveien. Våre resultater etablert, som LiCl faktisk indusert translokasjon av β-catenin protein fra cytoplasma til kjernen, resveratrol (50 uM) i betydelig grad hemmet denne prosessen (figur 7A). Deretter, nedregulering av MALAT1 forsterket effekten av resveratrol på inversjon av β-catenin translokasjon fra cytoplasma til kjernen i shRNA /MALAT1 LoVo-celler, mens oppregulering av MALAT1 svekket det (figur 7B, 7C).
(A): resveratrol negerte LiCl indusert nukleær translokasjon av β-catenin. Immunfluorescens farging av β-catenin i LoVo-celler behandlet med LiCl, med eller uten resveratrol. (B): Kjerne ekstrakter fra LoVo-celler som uttrykker MALAT1-shRNA, MALAT1-overuttrykt, tom vektor, ble behandlet med LiCl med eller uten resveratrol, ble probet for β-catenin, c-Myc, MMP-7. (C) Kvantifisering av β-catenin, c-Myc, MMP-7 proteinnivåer fra dataene som er vist i (A). **
p
0,01, sammenlignet med blank gruppe eller LiCl alene gruppen. (D): De relative LEF /TCF promoter aktiviteter i LoVo celler som uttrykker MALAT1-shRNA, MALAT1-uttrykt, tom vektor, behandlet av LiCl, med eller uten resveratrol. **
p
0,01, sammenlignet med blank gruppe eller LiCl alene gruppen. (E): Ingen interaksjon mellom MALAT1 og β-catenin. Sett: RT-PCR resultat som viser mengden av RNA-trukket ned av RNA-bindende protein immunutfelling. Som negative kontroller ble det ikke i noe cDNA (blank) eller IgG alene anvendes. Nedre ruten: kvantifisering resultat av innsatsen
I tillegg testet vi effekten av resveratrol på Wnt /β-catenin signal ved hjelp av en reporter LSF /TCF promoter dual-luciferase konstruere.. Våre resultater klart indikerte at resveratrol hemmet arrangøren aktiviteten til LEF /TCF indusert av LiCl, og co-undertrykkelse av MALAT1 ført til forbedring av denne effekten, som co-overekspresjon av MALAT1 motstrid det (figur 7D). Alle disse dataene underbygget at resveratrol hemmer aktiviteten av Wnt /β-catenin signalveien via undertrykke den MALAT1 uttrykk. Siden MALAT1 og β-catenin protein begge finnes i kjernen, så det er av stor interesse for oss å vite om disse to molekyler kan direkte samhandler med hverandre, noe som kan oppdages ved hjelp av et RNA-bindende protein immunoprecipitation teknikk. Overraskende, våre data viste liten interaksjon mellom MALAT1 og β-catenin (figur 7E). Dette illustrerer at MALAT1 kanskje indirekte samhandle med β-catenin å påvirke signalkaskade.
7. Bekreftelse av våre Viktige funn i annen CRC cellelinje HCT116
For å bekrefte våre viktige funn i LoVo celler, vi testet en annen CRC HCT116 cellelinje med lignende tilnærminger. Våre resultater viste at resveratrol hemmet proliferasjonen av HCT116-celler ved IC50 på 100 uM (figur 8A). HCT 116 celler hadde mye lavere MALAT1 ekspresjon enn LoVo-celler, men ikke desto mindre, som i likhet med LoVo-celler, overekspresjon av MALAT1 fremmet spredning av HCT116-celler (figur 8B, 8C, 8D)
(A):. Resveratrol inhiberte proliferasjonen av HCT116-celler med en IC50 på 100 uM. (B): HCT 116 celler viste lavere MALAT1 uttrykk enn LoVo celler. **
p
0,01, sammenlignet med LoVo celler. (C): Overekspresjon av MALAT1 i HCT116-celler. (D): Overekspresjon av MALAT1 fremmet in vitro vekst av HCT116-celler. (E): Overuttrykte av MALAT1 dempes den undertrykkende effekten av resveratrol på migrasjon og invasjon i HCT116 cellene. HCT116-celler som uttrykker MALAT1-overuttrykt, tom vektor ble behandlet med eller uten 50 mM resveratrol i 48 timer og cellulær migrering og invasjon evne ble målt. (F): Hele eller celleekstrakter av forskjellige cellulære fra HCT116-celler som uttrykker MALAT1-overuttrykt, tom vektor behandlet med eller uten 50 mM resveratrol i 48 timer ble probet for β-catenin, c-Myc, MMP-7, og proteinnivåene ble kvantifisert. *
p
0,05 eller **
p
. 0,01, sammenlignet med HCT116-celler behandlet med 100 mikrometer resveratrol
I tillegg resveratrol også betydelig hemmet migrasjon og invasjon evne HCT116. Som i LoVo celler, overekspresjon av MALAT1 reddet HCT116-celler fra undertrykkelse av migrasjon og invasjon av resveratrol (figur 8E). Western blot Resultatene viste også at overekspresjon av MALAT1 reverseres effekten av resveratrol på kjernefysisk β-catenin og protein uttrykk av c-myc og MMP-7 i HCT116-celler (figur 8F).
Diskusjoner
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste ondartede svulster i verden, med høy grad av tilbakefall og metastasering. Mekanismene for tilbakefall og metastasering er fortsatt svært komplisert. Foreløpig behandling av tykktarmskreft er i hovedsak kirurgisk reseksjon, kombinert med kjemoterapi, immunterapi, og andre alternative bekymringer for eksempel tradisjonell kinesisk medisin. Tradisjonell kinesisk medisin og dens mer nylig avledet hentet monomer behandling kan forbedre kreft symptomer, redusere kreftmetastaser, samt redusere risikoen for tilbakefall av tykktarmskreft. Men de terapeutiske mål og mekanismer forblir unnvikende. Blant disse hentet monomerer, er resveratrol et perfekt eksempel. Så tidlig som i 1993, Jayafilake
et al
har funnet ut at resveratrol har anti-kreft karakteristisk på grunn av sin undertrykkende effekt på protein-tyrosinkinase aktivitet [20]. Andre forskere funnet videre at resveratrol har hemmende effekt på et stort spekter av ondartede kreftceller avledet fra bryst, mage, tykktarm, prostata, eggstokk, og hudkreft [21] – [26]. Vår nåværende studier viste at resveratrol hemmer spredning, invasjon og metastasering av kolorektal kreft celler.
Å være nøkkelen transcriptional aktivering faktor på Wnt /β-catenin signalveien, på oppstrøms aktivering, β-catenin ofte translocates til kjernen fra cytoplasma, i samordning med andre transkripsjonsfaktorer som TCF /LEF, for å aktivere dets målgener c-myc, cyclinD1, MMP-7, og CD44, som i sin tur spiller avgjørende rolle i startfasen og utvikling [27] – [ ,,,0],30]. Våre data antyder at det resveratrol blokkerte translokasjon av β-catenin til kjernen, noe som resulterer i redusert ekspresjon av c-myc og MMP-7.
lang ikke-kodende RNA-MALAT1 ble først rapportert i den ikke-invasive liten celle karsinom, og i det siste blitt funnet i-uttrykkende i mange andre kreftvev, som indikerte MALAT1 er forbundet med invasjon og metastase [11] – [14]. Våre undersøkelser viste MALAT1 over-uttrykt i 60 CRC vev i forhold til de tilstøtende normalt vev, og MALAT1 overekspresjon korrelert med CRC invasjon og metastase funksjoner. I våre screening eksperimenter, har vi identifisert to tradisjonell kinesisk medisin hentet monomerer som har direkte effekt på MALAT1 uttrykk. Resveratrol er den beste av dem. I våre nåværende studier, illustrert vi at shRNA mediert knockdown av MALAT1 åpenbart redusert invasjons og migrasjons egenskapene til CRC LoVo og HCT116-celler. I likhet med resultatene av resveratrol behandling, knockdown av MALAT1 inhiberte trans-plasseringen av β-catenin fra cytoplasma til kjernen, noe som resulterer i redusert c-Myc og MMP-7 uttrykk, mens MALAT1 overekspresjon gjorde det motsatte.
ved å bruke en LEF /TCF promoter dual-luciferase reporter-konstruksjonen og aktivering av Wnt /β-catenin signalveien med LiCl, vi videre demonstrert at knockdown av MALAT1 forbedret inhiberende effekt av resveratrol på promoteren aktiviteten til LEF /TCF indusert av LiCl, mens over-uttrykk for MALAT1 svekket den. Alle disse resultatene antydet at den understreker mekanismen for resveratrol kan være gjennom en undertrykkelse av Wnt /β-catenin signalering, via nedregulering av ekspresjon MALAT1.
MALAT1 er spesifikt holdt tilbake i kjerne flekker, i forbindelse med lagring eller modifisering av pre-mRNA behandling maskineri, har potensiell effekt på gen-funksjon regulering, alle disse innebære at MALAT1 kan spille en viktig rolle i kreftutvikling [31] – [33]. På grunn av at MALAT1 og β-catenin protein både ligge i kjernen, undersøkte vi hvorvidt det er en direkte interaksjon mellom disse to molekyler i kjernen. Dessverre observerte vi liten direkte interaksjon mellom MALAT1 og β-catenin, noe som tyder på at det kan være andre molekyler som er involvert i reguleringen mellom MALAT1 og β-catenin. Ingen direkte sammenheng mellom høy MALAT1 uttrykk i kliniske prøver og kjerne akkumulering av β-catenin ble funnet. Som foreslått av Brabletz T
et al
, β-catenin (figur S1) i kolon karsinom viste en sterk kjerne anrikning ved invasjonen foran, mens det i store deler av det sentrale tumorområdet, ble β-catenin påvist i cytoplasma og ved membran [34] – [36]. Dette betyr at vi bør skille invasjonen foran fra resten av CRC vev og måle uttrykk nivåer av MALAT1, β-catenin og deres lokalisering, for deres korrelasjon. Vi planlegger i fremtidige studier, ved hjelp av teknologier som prediksjon analyse programvare, co-immunoprecipitation, protein sekvensering, protein chips og genet chips, for å identifisere de spesifikke koblinger mellom MALAT1 og β-catenin.
I konklusjonen, våre resultater avdekket de mekanismer som regulerer resveratrol MALAT1 i sin tur endrer den nukleære lokalisering av β-catenin, noe som resulterer i senket Wnt /β-catenin signalering og eventuell inhibering av invasjon og metastase. Denne oppdagelsen vil sikkert gi viktig pre-kliniske bevis som støtter fremtidig bruk av resveratrol i forebygging og behandling av CRC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Valg av den mest effektive shRNA for MALAT1, påvisning av MALAT1 mRNA og β-catenin protein uttrykk i CRC vev og tilstøtende normalt vev. (A): LoVo-celler ble infisert med lentivirus med tre pLV4-MALAT1 shRNAs eller pLV4-vektor. Deres effektivitet av knockdown ble oppdaget av real time PCR *
p
. 0,05 eller **
p
0,01, sammenlignet med vektor kontroll. (B): MALAT1 mRNA-ekspresjonsnivåer ble målt ved hjelp av sanntids-PCR, CRC vev og tilstøtende normale vev. **
p
0,01, sammenlignet med normalt vev eller CRC vev uten metastaser.
