Abstract
Bakgrunn
Chromodomain-helicase-DNA-bindende protein 5 (CHD5 ) er et nylig identifisert tumor suppressor som ofte nedregulert i en rekke humane krefttyper. Vår tidligere arbeid viste at den lave uttrykk for CHD5 i kolorektal kreft er korrelert med CHD5 promoter CpG island hypermethylation. I denne studien undersøkte vi effekten av mikroRNA-211 (MIR-211) -regulated CHD5 uttrykk på tykktarms tumorigenesis.
Metodikk /hovedfunnene
MIR-211 ble spådd å målrette CHD5 av TargetScan programvare analyse. En stabilt uttrykker eksogent MIR-211 tykktarmskreft cellelinje (HCT-116
MIR-211) ble generert ved hjelp lentiviral transduksjon og brukes som modell for
in vitro Hotell og
in vivo
studier. Uttrykket nivået av MIR-211 i HCT-116
MIR-211 celler ble oppregulert med 16 ganger sammenlignet med vektorkontrollceller (HCT-116
vektor). Eksogent MIR-211 binder direkte til den 3′-ikke-translaterte området (3′-UTR) av CHD5 mRNA, noe som resulterer i en 50% reduksjon i CHD5 proteinnivå i HCT-116
MIR-211-celler. Nivåene av celleproliferasjon, tumorvekst, og celle migrasjon av HCT-116
MIR-211 celler var betydelig høyere enn HCT-116
vektor celler både under
in vitro Hotell og
i vivo
betingelser, som bestemt ved hjelp av metodene til MTT, kolonidannelsen, strømningscytometri, ripe analysen, og tumorxenografter, respektivt. I tillegg fant vi at tvangs uttrykk for MIR-211 i HCT-116 cellene var i stand til å endre p53 sti-forbundet regulatoriske proteiner, slik som MDM2, BCL-2, BCL-XL, og Bax.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater viser at CHD5 er et direkte mål på MIR-211 regulering. Tvangs ekspresjon av MIR-211 fremmer tumorcellevekst i det minste delvis av downregulating ekspresjonsnivået av CHD5 tumor suppressor. Våre resultater gir en bedre forståelse av sammenhengen mellom MIR-211-regulerte CHD5 uttrykk og CHD5 funksjon i kolorektal tumorigenesis
Citation. Cai C, Ashktorab H, Pang X, Zhao Y, Sha W, Liu Y , et al. (2012) mikroRNA-211 Expression Fremmer tykktarmskreft cellevekst
In Vitro Hotell og
In Vivo
av Targeting Tumor suppressor CHD5. PLoS ONE 7 (1): e29750. doi: 10,1371 /journal.pone.0029750
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 5 oktober 2011; Godkjent: 03.12.2011; Publisert: 03.01.2012
Copyright: © 2012 Cai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av midler fra National Cancer Health (CA118770 og CA102681) og Nasjonalt Senter for Forskningsressurser (RCMI to G12 RR003048), USA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Identifisere kreftrelaterte gener og forstå deres bidrag til tumorigenesis er viktige skritt i å kontrollere kreft. Nyere studier har vist at genuttrykk kan bli påvirket av endringer i kromatinstruktur og foreningen av DNA med nucleosomes [1]. For eksempel kan Swi /SNF-proteiner føre til at ATP-avhengige forstyrrelser av nucleosome struktur ved en promoter, som forbedrer binding av transkripsjonsfaktorer til deres bindingsseter [1]. Virkningene av disse proteinene kan også føre til nucleosome bevegelser og forandringer i kromatin konformasjon, noe som resulterer i dyp transkripsjonen aktivering (eller represjon) av et gen eller en region [1].
Chromodomain-helicase-DNA-bindende gener ( CHD) kode en ny klasse av Swi /SNF proteiner som ikke bare inneholder en Swi /SNF-lignende heli ATPase domenet, men også flere funksjonelle domener [2], [3]. Disse proteiner har et DNA-bindende domene, samt en chromodomain motiv som kan direkte påvirke kromatinstruktur og gentranskripsjon. Det er økende bevis for at CHD protein komplekser kan ha en dyp effekt på kromatinstruktur og genuttrykk. Derfor er det sannsynlig at de spiller en viktig rolle i å regulere utviklingen, cellesykluskontroll, og onkogenese [4]. CHD er en superfamilien som kan deles inn i fem subfamilier basert på tilstedeværelse av spesifikke protein-motiver, som utruster hver familie av proteiner med en unik funksjon. CHD5 er mest lik CHD3 og CHD4 i at det er inneholder plante homeodomain motiver. CHD5 ble nylig identifisert som en ny tumor suppressor som er tilordnet 1p36, som ofte slettet i mange typer humane cancere [5], [6], og den kromatin-remodelle aktivitet av CHD5 er nødvendig for hensiktsmessig transkripsjonen aktivering av p19
Arf /p53 sti [7].
Det er klart at CHD5 mangel er en vanlig innledende hendelsen i human tumorgenese. CHD5 ofte nedregulert gjennom promoter hypermethylation i mage, bryst, eggstokk, og glioma tumorer [8], [9], [10], [11], som tyder på epigenetisk stanse av CHD5 ved metylering kan bidra til tumorgenese i disse vevene. Tykktarmskreft (CRC) er en av de tre mest utbredte kreftformer i USA [12] og CHD5 ofte hypermethylated i humane tarmkreftcellelinjer og primære svulster [2], [13], [14].
Selv om det er mange studier om metylering status for CHD5 i ulike typer svulster, er det få studier på hvordan en annen viktig epigenetisk mekanisme, microRNAs (mirnas), kan også spille en avgjørende rolle i CHD5 mangel under kolorektal tumorigenesis. mirnas er små, ikke-kodende RNA-molekyler finnes i dyr, planter og virus som er primært involvert i genet Slå av ufullkommen baseparing med 3′-utranslaterte regioner (3′-UTR) av spesifikke mRNA, som induserer mRNA degradering [ ,,,0],15]. De løse binde begrensninger tillater en miRNA å binde seg til flere steder i løpet av en 3′-UTR og til flere mRNA-mål innenfor den transkriptomet, endowing mirnas med evnen til å inhibere flere gener på en gang [16]. Mange mirnas er konservert over vidt forskjellige phyla, indikerer deres fysiologiske betydning [15]. mirnas spiller en nøkkelrolle i regulering av diverse cellulære prosesser, inkludert utvikling, differensiering, cellevekst, apoptose, viral infeksjon, og metabolismen [17].
Noen av mirnas som er feilregulert i kreft funksjon som tumor-suppressorer eller onkogener [18]. Flere slike mirnas har blitt identifisert i kolorektal kreft, inkludert oppregulert MIR-31, MIR-96, MIR-135b, og MIR-183 og downregulated MIR-133b og MIR-145 [19]. Siden mirnas binde 3′-UTR av sine mål mRNA ved baseparing, regionen komplementaritet mellom en miRNA og dens mRNA målet er liten. Dette område omfatter nukleotider 2-7 fra 5′-enden av miRNA og blir referert til som «seed» region [20]. Forskjellige beregningsfremgangsmåter har blitt utviklet for å forutsi miRNA målområder i hele genomet [21]. Ved å bruke informatic verktøy Miranda, PicTar, og TargetScan ble MIR-211 spådd å basepar med 3′-UTR av CHD5, men
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter er nødvendig for å bekrefte om MIR-211 faktisk er rettet mot CHD5.
i denne studien undersøkte vi rollen som MIR-211 på kolorektal kreftceller gjennom nedregulering av CHD5
in vitro Hotell og
in vivo
. Først undersøkte vi uttrykket nivåer av MIR-211 og CHD5 i kolorektal kreft cellelinjer RKO og HCT-116. Vi valgte HCT-116 og etablerte MIR-211-stabilt transfektert cellelinje HCT-116
MIR-211. Til slutt, vi brukte denne cellelinje for å utføre en rekke
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter for å finne ut om Mir-211 er rettet mot CHD5.
Resultater
Expression nivåer av CHD5 protein og MIR-211 er omvendt korrelert i menneskets tykktarm kreft cellelinjer
MIR-211 ble valgt som kandidat miRNA for målretting CHD5 på grunn av sin ufullkommen baseparing til 3 « -UTR av CHD5 (fig. 1a). Vi undersøkte ekspresjonsnivået av MIR-211 i disse to cellelinjer ved kvantitativ sanntids RT-PCR (fig. 1B). For å velge de riktige cellelinjer for vår studie, vurderte vi nivået CHD5 protein i fire tykktarmskreft cellelinjer ved Western blot analyse (Fig. 1C), som inkluderte to tidligere etablerte cellelinjer (RKO og HCT-116) og to CHD5 transfekterte cellelinjer (RKO-S og RKO-AS). Våre resultater viser at HCT-116 hadde det høyeste uttrykk for CHD5 og RKO hadde lavest uttrykk for CHD5. Derfor ble HCT-116 og RKO cellelinjer brukes for etterfølgende eksperimenter. Vi fant en invers korrelasjon av CHD5 og Mir-211 uttrykk (Fig. 1 D). Uttrykket nivået av CHD5 i HCT-116 var fire ganger høyere enn i RKO, mens uttrykket nivået av MIR-211 i HCT-116 var bare 20% av det i RKO. Siden HCT-116 celler hadde både det høyeste uttrykk nivå av CHD5 og laveste uttrykk nivå av MIR-211, ble denne cellelinjen valgt som kandidat cellelinje til å stabilt transfektere med MIR-211 for videre etterforskning i funksjonen av MIR-211 i regulering av CHD5 til uttrykk under cellekultur og tumor xenograft forhold.
(A) RNA sekvens kart over 3′-UTR av CHD5 (Gene ID 26038) mRNA med utfyllende nettsted (3′-UTR 130- 136) for frøet regionen miRNA-211. (B) MIR-211 nivåer i RKO, HCT-116, RKO-S, og RKO-AS cellelinjer ved kvantitativ RT-PCR basert på MIR-211 /U6 uttrykk fold verdier. (C) CHD5 protein nivåer i to tykktarmskreft cellelinjer (RKO og HCT-116) og to etablerte cellelinjer (RKO-S og RKO-AS) med håndheves CHD5-S uttrykk ble analysert ved Western blot og semi-kvantifiseres basert på CHD5 /p-aktin relative intensiteter. Bio-Rad Antall One-programvaren ble brukt for densitometrisk analyse av Western blot. (D) Sammenligning av CHD5 og Mir-211 uttrykk nivåer i HCT-116 og RKO cellelinjer. * Angitt som P . 0,05
stabilt håndheves uttrykk for MIR-211 direkte nedregulerer CHD5 proteinnivået i HCT-116 celler
For å undersøke hvilken rolle MIR-211 i den nedregulering av CHD5 etter celledyrkningsforhold, bygget vi en HCT-116 cellelinje som stabilt uttrykte MIR-211 ved hjelp av en lentiviral-levering system for å sette inn et uttrykk kassett med en P
CMV promoter, EGFP, og MIR-211 forløper (fig. 2A). Vi har også konstruert en HCT-116 cellelinje, HCT-116
vec, som stabilt uttrykte GFP kontroll vektor. Fjorten dager etter lentiviral infeksjon, nesten alle HCT-116 celler hadde påvisbare nivåer av grønn fluorescens, som er en indikator på effektiv infeksjon. Den lentiviral levert EGFP-Mir-211 uttrykk ble kvantifisert ved real-time RT-PCR. MIR-211 uttrykk i HCT-116
MIR-211 økte med 16 ganger (
p
0,05). I tillegg uttrykket nivået av CHD5 sunket betraktelig (Fig. 2B), med proteinnivået CHD5 i HCT-116
MIR-211 celle på bare 50% av det i HCT-116
VEC celler (Fig . 2C). I tillegg ble CHD5 bekreftet å være et direkte mål for MIR-211 ved et luciferase reporter-analyse. Fluorescens-aktivitet ble redusert over 90% etter 293T-celler ble ko-transfektert med MIR-211 ekspresjonsvektor og 3′-UTR av CHD5 mRNA luciferase reporter vektor i forhold til 3′-UTR av CHD5 luciferase reporter vektor alene (figur 2D.).
(A) Skjematisk representasjon av MIR-211 vektor, som inneholder en ekspresjonskassett av P
CMV-promoter, EGFP, og MIR-211-forløper og en selektiv kassett av P
PGK promoter og Puro
r. (B) CHD5 proteinnivåer i cellelinjer HCT-116
vec og HCT-116
MIR-211 ble undersøkt ved Western blot og (C) semi-kvantifisert basert på CHD5 /p-aktin relative intensiteter. (D) luciferase reporter analyse ved bruk av HEK 293T-celler som var transfektert med enten luciferase /3′-UTR MIR-211 reporter vektor, MIR-211 vektoren, eller begge deler. Skjematisk fremstilling av luciferase-rapportør CHD5 vektor og luciferase reporter kontroll vektor ble også satt inn. * Angitt som P . 0,05
Tvungen Mir-211 uttrykk øker spredning og migrasjon av tykktarmskreft celler
in vitro
Effekten av MIR-211 på celleformering ble undersøkt ved anvendelse av en kolorimetrisk assay formasjon og cellenes levedyktighet ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. HCT-116
VEC og HCT-116
MIR-211-celler ble sådd ut i separate 6-brønns plater og cellevekst ble overvåket daglig under et mikroskop i ti dager inntil koloniene var klart synlig for det blotte øye. Som ventet, viste HCT-116
MIR-211-celler signifikant økt proliferasjon, som fører til dannelse av flere kolonier. Den kolonidannende evne HCT-116
MIR-211 celler var 221% (
p
0,05) mer enn for HCT-116
VEC celler (figur 3A.). MTT-analysen viste at tvungen ekspresjon av MIR-211 i HCT-116
MIR-211-celler førte til en 30% økning i celleproliferasjon i forhold til HCT-116
VEC-celler (fig. 3B). cellecyklus målinger av FCM de viste at andelen av celler i G1 fase ble redusert med 53% (
p
0,05), og at det i S økte fase med 51% (
p
. 0,05
(a) ripete åpne områder ble observert ved timer 0, 5, 8 og 24 for HCT-116
vec og HCT-116
MIR-211 celle linjer under et lysmikroskop ved × 400 forstørrelse. (B) Cellene ble telt fra de forskjellige tidsperioden i den samme størrelsen på bunnen område som det refereres til ved tid 0 timer. Resultatene fra scratch analysen var fra to uavhengige forsøk med tre paralleller og * angitt som P . 0,05
Tvungen MIR-211 øker spredning av tykktarmskreft celler
in vivo
i tillegg til å undersøke de biologiske funksjonene i MIR-211
in vitro
, vi også vurdert
in vivo
funksjon av MIR-211 ved hjelp av en xenograft transplantasjon modell. Ved subkutant transplantasjonen HCT-116
vec eller HCT-116
MIR-211 celler i nakne mus, overvåket vi tumorvekst over en seks ukers periode. Som vist i figur 5, etter 6 uker en fast tumor hadde dannet i den høyre flanken til hver av musene med en gjennomsnittlig størrelse på 284 mm
3 og en gjennomsnittsvekt på 0,592 g. Imidlertid var mye mindre svulster som dannes i venstre flanke med en gjennomsnittlig størrelse på 13.55 mm
3 og en gjennomsnittsvekt på 0,028 g, noe som antyder at MIR-211 øker proliferasjonen av tykktarmskreftceller
in vivo
.
(A) Tumor xenograft vekst av HCT-116 og HCT-116
MIR-211 er vist under en lys og fluorescens imaging system. Tumormassen (g) ble målt på den siste forsøksdagen umiddelbart etter at tumorvevet ble fjernet fra musen ved kirurgisk inngrep. Svulst xenograft vekst for HCT-116 og HCT-116
MIR-211 grupper ble sammenlignet. (B) Den dagen celle inokulasjon var den eksperimentelle start dagen og alle musene ble avlivet på dag 43. veksten av faste tumorxenotransplantater ble overvåket en gang i uken, og målt ved hjelp av vernier calipers.
Tvungen uttrykk av MIR-211 endrer uttrykk for vekst assosiert proteiner og p53-relaterte pathway proteiner
uttrykk nivåer av celle overlevelse bærende proteiner BCL-2 og Bcl-XL i HCT-116
speil 211 ble økt med 37% og 29%, henholdsvis, mens uttrykket nivået av døds fremme protein Bad ble redusert med 22% (fig. 6A, B). Uttrykk for MDM-2, en negativ regulator av p53, ble økt 33% i HCT-116
Mir-211 celler i forhold til HCT-116
VEC celler. Imidlertid ekspresjon av p53 og dets målgenet Bax redusert med 18% og 51%, henholdsvis (fig. 6C, D).
(A) Konsentrasjonene av cellevekst assosierte proteiner i HCT-116
vec og HCT-116
MIR-211 cellelinjer ble analysert ved hjelp av Western blot og (B) semi-kvantifisert basert på målrettet protein /p-aktin relative intensiteter. Nivåene av p53-relaterte pathway proteiner i HCT-116
vec og HCT-116
MIR-211 cellelinjer ble analysert ved hjelp av Western blot (C) og semi-kvantifisert basert på målrettet protein /p-aktin relative intensiteter (D).
Diskusjoner
CHD5 er en nylig identifisert tumorsuppressorgen [2] ligger på 1p36 [7]. Sin reduserte ekspresjon forekommer i mange tumortyper på grunn av sin hypermethylation promoter [8], [9], [11]. Flere studier har antydet at CHD5 positivt regulerer p53-mediert veier. Den nedregulering og hypermethylation av CHD5 har blitt funnet i CRC [2], [13], [15]. Men lite er kjent om hvorvidt mirnas, et annet aspekt av epigenetisk regulering, påvirkning CHD5 uttrykk og fenotype av CRC celler.
mirnas er spådd til å regulere over 30% av alle genekspresjon og kan forklare noe av avvikende genuttrykk i kreftceller. Vi brukte bioinformatiske verktøy og fant at MIR-211 er spådd å basepar til 3′-utranslaterte område (3′-UTR) av CHD5 (Fig. 2A). MIR-211 signifikant oppregulert i andre typer kreft [22] og kan fungere som et onkogen, som er konsistent med det tumor suppressor funksjon av CHD5. Men om MIR-211 direkte rettet mot CHD5 og påvirker fenotypen av celler fra tarmen som trengs for å bli bekreftet. I denne studien, fant vi ut at håndheves uttrykk for MIR-211 i en tykktarmskreft cellelinje direkte nedregulerer CHD5, noe som resulterer i økt celle levedyktighet, cellecyklusprogresjonen, og migrasjon evne og redusert apoptose. Vi bekreftet våre resultater på flere ulike nivåer, inkludert cellekultur, tumorxenotransplantater, og proteinforandringer i CHD5 relaterte veier.
Vi opprettet en tykktarmskreft cellelinje som stabilt uttrykte EGFP-MIR-211, HCT- 116
MIR-211, ved hjelp av stabil genet transfeksjon teknologi (fig. 2A). RKO og HCT-116 er både kolorektal kreft cellelinjer. CHD5 ble ydmyk uttrykt i RKO og sterkt uttrykt i HCT-116 celler [14]. Uttrykket nivåer av CHD5 og MIR-211 i RKO, RKO-S, RKO-AS, og HCT-116 ble oppdaget av Western blot og real-time PCR. Mens RKO-S er CHD5-stabilt transfektert cellelinje, HCT-116 hadde det høyeste uttrykk nivå CHD5. Siden HCT-116 hadde også det laveste uttrykket nivået av MIR-211, vi valgte denne cellelinjen til å stabilt transfektere med MIR-211 (Fig. 1 D). Vi opprettet håndheves EGFP-Mir-211 uttrykk i tykktarmen cellelinje HCT-116
MIR-211 bruker Lenti-X ™ Lentiviral Expression System. Vi har også etablert en cellelinje transfektert med tom EGFP vektor, HCT-116
vec. Siden EGFP genet delte den samme P
CMV arrangøren med MIR-211-genet, var vi i stand til å enkelt overvåke Mir-211 uttrykk i cellene under et fluorescerende mikroskop. Siden ekspresjonen av MIR-211 i HCT-116 og HCT-116
VEC-celler var like, HCT-116
vec ble anvendt som kontrollcellelinje for de følgende eksperimenter. Uttrykket nivået av MIR-211 var 15 ganger høyere i HCT-116
Mir-211 celler sammenlignet med HCT-116
veccells.
I tillegg er nivået av CHD5 uttrykk ble betydelig redusert i HCT-116
MIR-211 celler sammenlignet med HCT-116
VEC celler (fig. 2B, C). Tvangs uttrykk for MIR-211 i HCT-116 celler økt spredning, kolonidannelse, levedyktighet (Fig. 3), og migrasjon evne (Fig. 4)
in vitro
. Cell transitt fra G0 /G1 til S fase ble akselerert (Fig. 3 C, D) og uttrykk av celleoverlevelsesbærende proteiner BCL-2 og Bcl-XL økt mens uttrykk for døds fremme protein Bad redusert (fig. 6A, B ). Oppregulering av MIR-211 forbedret spredning av kolorektal kreft celler kan være av downregulating CHD5 (Fig. 2D) og også fremmet tumorvekst
in vivo
. Seks uker etter subkutan transplantasjon av HCT-116
MIR-211 og HCT-116 celler i nakne mus, HCT-116
MIR-211 utviklet seg til svulster med en gjennomsnittsvekt på 0,592 g mens HCT-116 celler bare dannet mye mindre svulster med en gjennomsnittsvekt på 0,028 g. Tatt i kontoer som HCT-116 og HCT-116
vec viste ingen signifikante forskjeller i biologisk atferd, våre resultater viser at MIR-211 fremmer tumorvekst av xenografter
in vivo plakater (Fig. 5 ).
Interessant, nedregulering av CHD5 ved MIR-211 påvirker fenotypen av kolorektal cellelinje ved å påvirke ekspresjon av p53-relaterte pathway proteiner (fig. 6C, D). p53 er en av de mest studerte tumor-suppressorer og over 50% av humane tumorer bære tap av funksjonsmutasjoner [23]. p53 undertrykker tumorigenesis gjennom induksjon av celle-syklus-arrestere eller apoptose programmer som reaksjon på en mengde forskjellige cellulære spenningssignaler [24]. Svulsten suppressor funksjon av p53 inkluderer også andre mekanismer, inkludert regulerer metabolske veier [25]. CHD5 ser ut til å modulere karsinogenese via en p53-relaterte veien [7]. I vår studie fant vi at oppregulering av MIR-211 i HCT-116 celler resulterte i nedregulering av CHD5, påvirker uttrykket av flere p53-regulert sti proteiner, inkludert MDM-2, p53, og Bax. Nivået av MDM-2, en negativ regulator av p53, ble øket mens nivåene av p53 og dets målgen, Bax, ble redusert, noe som indikerer at CHD5 mangel kompromitterer p53-regulert trasé og letter tumorigenesis. Den maligne fenotype av HCT-116-celler ble øket ved oppregulering av MIR-211 og forbedring av proliferasjon og migrering av HCT-116-celler kan være involvert etterfølgende endringer i p53-relaterte veier. Videre studier vil være nødvendig for å fastslå om p53-relatert signalering er den eneste mål for miRNA-211 regulering av CHD5.
Til sammen er det avvikende uttrykk for MIR-211 og påfølgende endring i nivået av CHD5 forbundet med kolorektal tumorigenesis. Våre resultater viser at tvangs ekspresjon av MIR-211 i kolorektal cancer cellelinje HCT-116 økte den ondartede fenotypen av cellene ved direkte downregulating ekspresjonen av CHD5 og kan være ved modulering av p53-relaterte veier. Spesielt håndheves uttrykk for MIR-211 forbedret markedsføring og migrasjon, redusert apoptose, akselererte overgangen fra G0 /G1 til S fase
in vitro Hotell og forbedret spredning
in vivo
. Men siden en enkelt miRNA kan modulere flere forskjellige mål de andre mulige roller MIR-211 i tykktarmskreft trenger videre studier. I tillegg er flere studier for å validere forholdet mellom MIR-211 og CHD5 i human kolorektal kreftutvikling og prognose. Vår studie gir en bedre forståelse av reguleringskapasitet på Mir-211 i å fremme tykktarms tumorigenesis ved å målrette CHD5 uttrykk.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
Menneskelig tykktarmen kreftcellelinjer (RKO og HCT-116), og en human embryonisk nyrecellelinje (HEK293T) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Vi brukte to CHD5-Sens og CHD5-antiSens tvunget uttrykk stabilt etablerte RKO cellelinjer (CHD5 oppregulert cellelinje RKO-S og sin anti-sense RKO-AS) [26]. RKO-celler ble dyrket i MEM og RKO-S og RKO-AS-celler ble dyrket i MEM inneholdende 900 ug /ml G418. HCT-116-celler ble dyrket i McCoys 5A medium (ATCC). HEK293T-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Gibco, USA). Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin, og alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i 5% CO
2 og 95% fuktighet.
Identifikasjon av mikroRNA mål
algoritmene av Miranda (https://www.sanger.ac.uk), PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu), og TargetScan (http: //www.targetscan. org /) ble brukt til å forutsi hvilke menneskelige mirnas kan binde til 3′-UTR av CHD5 (Gene ID 26038). Kort fortalt disse algoritmene gir 3′-UTR justeringer med spådd nettsteder og linker til ulike offentlige databaser for prediksjon av miRNA bindingssteder.
miRNA utvinning og kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert bruker RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD, USA). En MIR-211 forover primer (5′-TTCCCTTTGTCATCCTTCGCCT-3 «) ble syntetisert ved Sigma (Woodlands, TX). Total RNA ble polyadenylert av polyA polymerase fra
E. coli
, og deretter første tråd cDNA syntese og kvantitativ PCR ble utført med Høy spesifisitet miRNA QRT-PCR Detection kit (Stratagene, La Jolla, CA). Polymerase kjedereaksjon (PCR) ble utført på en Mx3000P ™ Instrument (Stratagene Laboratory), med U6 som en intern kontroll på grunn av sin stabil ekspresjon på tvers av menneskelig vev og cellelinjer, som foreslått av produsenten og andre forskere [27]. Vi brukte sammenligningsterskelsyklusen (Ct) metoden for å måle relative endringer i miRNA uttrykk. Ct er syklusen nummeret som fluorescens-signalet til forsterkning plottet passerer en fast terskel. ΔCt = Ct (MIR-211) -Ct (U6), ΔΔCt = ΔCt (vektor) -ΔCt (MIR-211). Expression fold verdi = 2
-ΔΔCt. Alle forsøk ble utført in triplo. En negativ kontroll uten en mal ble kjørt parallelt for å vurdere den samlede spesifisiteten av reaksjonen.
Stabil transfeksjon av MIR-211
Vi endret kommersielle pLVX-Tight-Puro vektor (Clontech, Mountain View, California) med et uttrykk kassett som inneholder P
CMV promoter, EGFP, miRNA linker, og pre-MIR-211 ved å erstatte P
stramt promoter [28]. Den miRNA linker inneholdt et multippelt kloningssete. Den pre-MIR-211 dobbel tråd sekvensen ble designet basert på miRBase Sequence database versjon 12.0. De konstruerte vektorer ble verifisert ved DNA-sekvensering. De rekombinante lentiviral partikler som inneholder enten MIR-211 vektor eller EGFP kontroll vektor ble transfektert inn i HEK 293T emballasje celler ved hjelp av lentiphos ™ HT pakkesystem og etter produsentens instruksjoner (Clontech, Mountain View, California). HCT-116-celler ble dyrket til 70-80% konfluens i 6-brønners plater og infisert med 200 pl lentivirus inneholdende enten den MIR-211 vektoren eller kontrollvektor i 2 timer. Deretter ble 2 ml McCoys 5A medium med 10% FBS tilsatt til hver brønn. Etter 48 timer ble de infiserte celler valgt med friskt medium inneholdende 5 ug /ml puromycin i 4-5 passeringer. Cellelinjer som stabilt uttrykker enten MIR-211 eller kontroll vektor ble generert og de infiserte celler kan sees under et fluorescens mikroskop.
Luciferase reporter analysen
En luciferase reporter analysen ble brukt til å verifisere at den komplementære sekvens av MIR-211 binder seg til det 3′-UTR av CHD5 mRNA. Et fragment av CHD5 mRNA, som inkluderte MIR-211 er bindingssetet ble klonet inn i phCMV-FSR luciferase reporter vektor (Genlantis, San Diego, California). HEK-293T-celler ble sådd i en 24-brønns plate, slik at de var 50% konfluent på tidspunktet for transfeksjon. Luciferase reporter-vektoren og enten GFP styre vektoren eller MIR-211 ekspresjonsvektor ble transfektert i HEK-293T-celler ved bruk av kalsiumfosfat utfelling. Luciferase aktivitet ble målt i levende celler 48 timer senere i henhold til produsentens protokollen med bioluminescence bildebehandling med en Xenogren IVIS instrument (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
3- (4, 5-dimetyltiazol-2- vl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay
en MTT-analyse ble utført som tidligere beskrevet [29]. I korthet ble cellene sådd på 96 brønners plater ved en initial densitet på 5000 celler /brønn. Etter 72 timer ble 200 ul av MTT-løsning (5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Supernatanten ble så kastet, og 200 ul dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt til hver brønn for å oppløse bunnfallet. Etter 30 minutter ved romtemperatur ble platene skannet spektrofotometrisk med en mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA) innstilt på 560 nm for å måle absorbansen. Hver test ble gjentatt i fem brønner.
kolonidannelse assay
A kolonidannelse analyse ble utført som tidligere beskrevet [29]. Kort fortalt ble HCT-116
VEC og HCT-116
MIR-211 celler sådd ut i 6-brønners vevskulturplater (Palo Alto, California). Fem hundre celler HCT-116
vec og HCT-116
MIR-211 ble sådd i hver brønn i tre eksemplarer, ble inkubert i 10 dager, og kolonier ble farget med 0,1% trypanblått i 50% etanol. Kolonier som inneholder 50 eller flere celler ble regnet som levedyktige klonogene celler. I det minste to uavhengige eksperimenter ble utført.
Cell syklus assay
cellesyklus-analyse ble utført som tidligere beskrevet [29]. I korthet, HCT-116
vec og HCT-116
MIR-211-celler i log-fase vekst ble oppsamlet og fiksert med kald 75% etanol og lagret ved -20 ° C i 24 timer. Etter at etanolen var fjernet, cellene ble inkubert med 1 mg /ml RNase A i PBS i 30 min ved romtemperatur, og deretter ble cellene inkubert i ytterligere 30 minutter i mørket i 0,5 ml 50 mg /ml propidiumjodid. Fordelingen av cellene gjennom cellesyklusen ble analysert ved hjelp av Becton-Dickinson FACScan, og DNA-histogrammer ble analysert med modifisert programvare. Hver test ble gjentatt tre ganger.
Skrape analysen
I korthet ble et åpent område eller «scratch» produsert i 90% HCT-116
MIR-211 cellemono ved hjelp av en 200 ul pipettespiss som tidligere beskrevet [30]. HCT-116
MIR-211-celler ble vasket med PBS for å fjerne de ford cellene i det åpne området, og dyrket i McCoys 5A for angitte tider. HCT-116
vec ble behandlet på samme måte og dyrket i McCoys 5A. Migrasjon i det åpne området ble observert med det blotte øye.
Western blot analyse
HCT-116
vec og HCT-116
MIR-211 celler ble vasket med kald PBS og lysert i RIPA lysebuffer på is i 30 min.
