Abstract
BORIS (CTCFL) er paralog av CTCF (CCCTC bindende faktor; NM_006565), en allestedsnærværende uttrykt protein DNA-bindende med ulike roller i genekspresjon og kromatin organisasjon. BORIS og CTCF har nesten identiske sink finger domener, men viser store forskjeller i sine respektive C- og N-terminale regioner. I motsetning CTCF har BORIS uttrykk rapportert bare i testiklene og visse kreftformer, som fører til klassifiseringen som en «kreft-testis» antigen. Med uttrykket mønster av BORIS er både en betydelig og uløst spørsmål innen DNA-bindende proteiner. Her identifiserer vi BORIS i cytoplasma og cellekjernen av et bredt spekter av normale celler og kreftceller. Vi sammenligner lokalisering av CTCF og BORIS i kjernen og demonstrere berikelse av BORIS innenfor kjerne, inne i nucleolin kjernestruktur og grenser til fibrillarin i den tette fibrillar komponent. I kontrast er CTCF ikke beriket i nucleolus. Live-avbildning av celler transient transfektert med GFP tagget BORIS bekreftet nukleolært opphopning av BORIS. Mens BORIS transkripsjonsnivåer er lave sammenlignet med CTCF, dets protein nivåer er lett synlig. Disse funnene viser at BORIS uttrykk er mer utbredt enn tidligere antatt, og foreslå en rolle for BORIS i nukleolært funksjon
Citation. Jones TA, Ogunkolade BW, Szary J, Aarum J, Mumin MA, Patel S, et al. (2011) Utbredt Uttrykk for BORIS /CTCFL i normale celler og kreftceller. PLoS ONE 6 (7): e22399. doi: 10,1371 /journal.pone.0022399
Redaktør: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Frankrike
mottatt: 18 mars 2011; Godkjent: 21 juni 2011; Publisert: 19.07.2011
Copyright: © 2011 Jones et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Cancer Research UK program stipend C5321 /A8318. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CTCFL eller BORIS (Bror av Regulator av trykt nettsteder), en paralog av CTCF, har blitt klassifisert som et kreftfrem testikkel antigen som sin distribusjon er rapportert å være begrenset til testis og visse kreftformer [1] . Unormalt høye nivåer av BORIS transkripter er tilstede i en rekke humane tumorer og kreft-avledede cellelinjer og i noen, er økt ekspresjon vært knyttet til promoteren-spesifikk demetylering og de-undertrykkelse av co-uttrykt kreft-testis gener [2] , [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Ulike studier har rapportert motstridende funn av BORIS uttrykk i enkelte typer kreft. For eksempel ble en rapportert øket ekspresjon i flere brystcancercellelinjer, og i de fleste primære bryst-tumorer ble testet i en studie som ikke er bekreftet av en annen [3], [13]. Videre har økte transkripsjonsnivåer BORIS blitt funnet i melanomcellelinjer, men ikke i primære melanomer [7]. Likevel er betydningen av BORIS i kreft foreslått av funn av høye nivåer i avansert ovarialcancer [14].
BORIS Hotell og
CTCF
gener er tenkt å har utviklet seg i løpet av virveldyr utvikling fra et gen duplisering hendelse [15]. Mens sink finger-domener som binder DNA i de respektive proteiner er svært like, de C- og N-terminale domenene til BORIS oppviser ingen signifikant homologi med CTCF eller andre proteiner [16]. BORIS inneholder ikke de modulære substrater for spesielle post-translasjonelle modifikasjoner som er kritiske for CTCF funksjon og mangler den konserverte C-terminal fosforylering motiv som kreves for CTCF-mediert veksthemming. Dette ville foreslå ulike funksjoner for de to proteinene.
Flere linjer av bevis peker på en rolle for BORIS i epigenetisk regulering av genekspresjon. Under musen mannlige bakterie-line utvikling, er BORIS observert i primær spermatocytter men blir gradvis erstattet av CTCF i post-meiotisk bakterie linjer celler [17]. Denne bryteren i uttrykket fra BORIS til CTCF sammenfaller med reetablering av stedspesifikke DNA-metylering mønstre under mannlig bakterie celledifferensiering [17]. Videre i tumorcellelinjer hvor CTCF stillhet gener ved DNA metylering, betinget uttrykk for BORIS fører til utskifting av CTCF av BORIS på disse genene, noe som resulterer i lokal demetylering og genaktivering [6], [10], [11], [18 ].
DNA-binding og epigenetiske funksjoner tilskrives BORIS vil foreslå en kjernefysisk lokalisering. Men nyere rapporter viser BORIS presentere hovedsakelig i cytoplasma av prostata epitel, testikler og prostata kreft cellelinjer [1] mens kjernefysiske lokalisering er bare identifisert på bestemte stadier av spermatogenesen og i noen 5-aza-dexoxycytidine-behandlet prostatakreft cellelinjer [ ,,,0],5]. Her viser vi dominerende lokalisering av BORIS innenfor nucleolus i flere kreftcellelinjer og primære celler, med berikelse i nucleolin kjernestruktur og grenser til fibrillarin i den tette fibrillar komponenten.
Diskusjon
Resultater og
BORIS ekspresjon i normale celler og kreftceller og vev
for å bestemme nivået av BORIS ekspresjon i normale humane vev, totalt RNA ble oppnådd fra human adipose, blære, hjerne, cervix, tykktarm, spiserør, nyre, lever , eggstokk, placenta, prostata, skjelettmuskel, tynntarm, milt, testikler, thymus, tyroid og luftrør (Ambion). Real-time RT-PCR viste de høyeste BORIS transkripsjonsnivåer i testiklene (10
10 transkripsjoner /ug total RNA), mens lavere nivåer ble påvist i andre vev (10
5-10
8 transkripsjoner /ug total RNA) i overensstemmelse med andre rapporter [7] (fig. 1). Vi gjorde ikke oppdage BORIS i hjerte eller lunge, selv om dette kan skyldes en begrensning i følsomheten for vår analyse. CTCF transkripsjonsnivåer var relativt konstant i alle vev (10
9-10
10 transkripsjoner /ug total RNA) (fig 1).
Boris transkripsjonsnivåer i normale menneskelige vev (First Choice Menneskelig Total RNA Survey Panel, Ambion, UK). Feilfelt representerer standardavvik.
Neste, vi sammenlignet transkripsjonsnivåer av BORIS og CTCF i en rekke av normale og kreftcellelinjer. Real-time RT-PCR analyse viste tilsvarende nivåer av BORIS og CTCF mRNA i fibroblaster, embryonale nyreceller, nevrale stamceller, nevroner, colorectal, prostata, medulloblastoma, glioblastom, melanom og neuroblastom celle linjer til de som ble observert i menneskelige vev. BORIS uttrykk var lavere (10
6-10
7 transkripsjoner /ug total RNA), sammenlignet med den mer rikelig CTCF (10
9-10
10 transkripsjoner /ug total RNA) (fig. 2A). Derfor BORIS og CTCF er til stede i både normale celler og kreftceller, med uttrykk av CTCF ofte tusen ganger større.
En Boris transkripsjonsnivåer i utvalgte cellelinjer. B, Western blotting for BORIS viser store band (*) på ca 76 kd (BORIS teoretisk størrelse), 60 kd og 45 kd. De mindre band kan representere BORIS isoproteins som beskrevet nylig [19]. C, Western blotting for CTCF viser store band (*) ved ca 130 kDa, 60 kDa og 48 kDa. Disse forskjellige band kan representere forskjellig uttrykt CTCF isoformer som beskrevet nylig [36]. BORIS og CTCF er tilstede i normale celler (nevroner, neurale stamceller (NSC) og MRC5 føtale lungefibroblaster), neuroblastom cellelinjer (ACN, IMR32 og LAN-1), melanom cellelinjer (26258M, A375M og WM983B), glioblastoma celle linjer (CRL-2365, U87MG, CRL-2610, CRL-1620, U138MG og U251) og kolorektal cellelinjer (HCT55, HCT116, HCT15 og LoVo). D, GAPDH ble anvendt som en kontroll for lasting forskjeller. Invitrogen Novex®Sharp Pre-Stained Protein Standard, LC5800, ble benyttet for bestemmelse av bandet størrelse. Feilfelt i (A) representerer standardavvik.
Uventet, Western blotting viste tilsvarende nivåer av BORIS uttrykk i normale og tumorcellelinjer (Fig. 2B). Vi identifiserte sterke store band av 60-70 kDa i samråd med den teoretiske molekylvekt på BORIS [19]. Vi har også oppdaget noen lavere og høyere molekylvekt band. Det er ennå ikke klart hvilke av disse bandene tilsvarer nylig beskrevet isoformer av BORIS [19] eller som er BORIS med posttranslasjonelle modifikasjoner. Men inkubere BORIS antistoff med BORIS peptid fullstendig blokkert alle band (fig. S1). Ingen av disse BORIS reaktive båndene ble oppdaget da membranene ble undersøkt med CTCF antistoffer (Fig. 2C).
For å bekrefte spesifisiteten av BORIS antistoff, ble HEK293T celler transfektert med GFP-merket BORIS, eller GFP- tagget CTCF konstruksjoner. Western-analyse bekreftet tilstedeværelsen av BORIS protein i celler transfektert med GFP-merket BORIS, mens bare endogene BORIS ble påvist i ikke-transfekterte celler eller celler transfektert med GFP-CTCF eller tom vektor (fig. S2).
Vi deretter brukte sanntids RT-PCR for å bestemme nivåene av BORIS ekspresjon i normalt musevev inkludert cerebellum, tarm, nyre, lever, ovarie, milt og testikler. Som i humant vev, har vi funnet en mye lavere nivå av BORIS forhold til CTCF i musevev med unntak av testis (fig. 3A). Western blotting på et utvalg av musevev avdekket flere band, det mest tallrike av dem var ved 60-70 kDa (Fig. 3B). Vi har også oppdaget at et bånd på omtrent 48 kDa i nyrene, hippocampus, gut og cortex, mens andre mindre intense bånd over 200 kDa var tilstede i testis, milt, lunger og lever (Fig. 3B). Disse høyere molekylvekt bånd kan svare til homo- /heterodimer av BORIS, eller poly (ADP) -ribosylation som er blitt beskrevet for CTCF [20]. Igjen ble ingen band oppdaget når membraner ble undersøkt med BORIS antistoffer pre-inkubert med gratis BORIS peptider (Fig. S3), heller ikke vi skal finne de samme bandene når membraner ble undersøkt med CTCF antistoffer (Fig. 3C). Selv BORIS protein er klart synlig, vi bare påvise lave nivåer av BORIS vitnemål, både i celler og vev (fig 1, fig 2A og 3A). Men disharmoni mellom mRNA nivå og protein overflod har blitt rapportert å være dårlig for enkelte andre gener [21], [22], [23].
En Boris og CTCF mRNA nivåer i utvalgte normale mus vev. B, Western blotting for BORIS som viser hovedbånd (*) ved 60-70 kd og 45 kd i musevev. C, Western blotting for CTCF viser bånd (*) mellom 70-100 kd i musevev. D, GAPDH ble anvendt som en kontroll for lasting forskjeller. GE Healthcare Full Range Rainbow Marker, RPN800E, ble benyttet for bestemmelse av bandet størrelse. Feilfelt i (A) representerer standardavvik
I lys av likheten i deres sink finger domener har BORIS blitt foreslått å være en antagonist, konkurrent eller regulator av CTCF i kjønnsceller og kreft hos mennesker [17]. Faktisk BORIS og CTCF konkurrerer om binding til felles DNA-mål. For eksempel, CTCF belegg på
MAGE-A1
promoter oppstår bare hvis BORIS uttrykk nivåer er lav [11]. Som N- og C-terminale endene av BORIS og CTCF er forskjellige, er de sannsynligvis til å være ansvarlig for ulike funksjonelle utfall, for eksempel formidling DNA demetylering, etter binding til DNA. De relative nivåer av BORIS og CTCF er derfor trolig være avgjørende for å opprettholde stabilitet i normale genuttrykk profiler.
nukleolære lokalisering av BORIS
immunfluorescens farging viste at BORIS ligger innenfor cytoplasma og kjerne av flere humane celletyper, inkludert MRC5 fibroblast, HEK293T embyonic nyreceller, neurale stamceller, kolorektal, neuroblastom, melanom, prostata og glioblastoma cellelinjer. I alle celletyper som ble undersøkt, ble BORIS immunreaktivitet anriket på kjerne (fig. 4 og S4 fig.). Inkubering over natten av BORIS antistoff med peptidet fullstendig blokkert immunfluorescerende signal ytterligere bekrefter spesifisiteten av de BORIS antistoffer (Fig. S5). Ingen immunoreaktivitets ble oppdaget når cellene ble farget med ikke-spesifikke IgG antistoffer. Co-farging av celler for BORIS eller CTCF og fibrillarin, en høyt konservert protein som er assosiert med en liten nukleolære RNA [24], bekreftet anrikning av BORIS men ikke CTCF i den kjerne (fig. 4A, B). Videre co-farging viste BORIS innenfor nukleolært plassen okkupert av nucleolin, et rikt ikke-ribosomale nukleolært protein [25] (Fig. 4C). Konfokal mikroskopi og 3D rekonstruksjon bekreftet at BORIS var innenfor kjerne, som grenser til fibrillarin i både normale celler og kreftceller (fig. 5A, B og filmer S1, S2, S3 og S4).
A, B immunfluorescens bildebehandling av BORIS eller CTCF flekker i grønt (Alexa 488) sammen med fibrillarin flekker i rødt (Alexa 594) i MRC5 og kolorektal cellelinje HCT116 viser anrikning av BORIS, men ikke CTCF, innenfor nucleolus. Celler ble kontra med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) vises i blått. BORIS og fibrillarin er nære naboer med hverandre og den tette fibrillære komponent (DFC) av kjerne. Bildene vises på 100x forstørrelse. C Dobbel farging viser BORIS flekker i grønt (Alexa 488) i Nucleolin regionen (rød, Alexa 594) i humane nevrale stamceller og glioblastom cellelinje CRL2365. Celler ble kontra med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) vises i blått. Bildene vises på 100x forstørrelse.
Tredimensjonal confocal bilder som viser BORIS flekker i grønt (Alexa 488) og fibrillarin flekker i rødt (Alexa 594). Celler blir motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, blå). A, MRC5 fibroblaster og B, C99 kolorektal cellelinje. Bildene vises på 63x forstørrelse.
For å bekrefte disse funnene, ble HEK293T celler transfektert med GFP-merket BORIS eller GFP-merket CTCF konstruksjoner. Ved hjelp av levende celle bildebehandling, ble GFP funnet å akkumulere gradvis i nucleoli av celler transfektert med GFP-BORIS. 71,3% +/- 1,7 av GFP-BORIS transfekterte celler viste klart nukleolært lokalisering (873 celler analysert totalt fra to uavhengige forsøk). I kontrast, celler transfektert med GFP-CTCF viste en jevn fordeling av GFP i hele kjernen, og disse celler transfektert med tom vektor GFP viste hovedsakelig GFP i cytoplasma (fig. 6). Videre farging av celler 72 timer etter transfeksjon av celler med HEK293T BORIS spesifikke shRNA plasmider, men ikke er tom vektor, signifikant (
p
0,05) reduserte nukleolært farging av BORIS (Fig. S6a, B). Dette ble fulgt av en tilsvarende reduksjon i BORIS transkripsjonsnivåer (Fig S7).
Live cell imaging av HEK293T celler transient transfektert med GFP-merket BORIS (grønn), GFP-merket CTCF (grønn) eller tom vektor ( grønn), kontra med Hoechst 333412 (blå). Bildene vises på 40x forstørrelse.
Antatte nukleolære Lokalisering Sekvenser
Computational analyse av BORIS proteinsekvens Q8NI51, [26], avslørte 2 antatte nukleolære lokaliserings sekvenser i sink finger domene :
LIQHQKTHKNEKRFKCKHCSYACKQ (mellom posisjonene 473 og 497) (ZF6 /7)
AKSAASGKGRRTRKRKQTILKEATKGQK (mellom posisjonene 573 og 600) (ZF9 /10)
Fem antatte nukleolære lokalisering sekvenser ble spådd i CTCF, tre av dem er i N-terminalen og overlapper med CTCF K /R acetylering nettsider spådd av Klenová, et al. [17]. De predikerte nukleolære lokaliserings sekvensene i CTCF er som følger:
ESETFIKGKERKTYQRRREGGQEE (mellom posisjonene 12 og 35)
KDPDYQPPAKKTKKTKKSKLRYTEEGKDV (mellom posisjonene 193 og 221)
VGNMKPPKPTKIKKKGVKKTFQCEL (mellom posisjonene 246 og 270) (N-terminal)
GENGGETKKSKRGRKRKMRSKKEDSSDSENA (mellom posisjonene 585 og 615) (ZF 9/10)
QPVTPAPPPAKKRRGRPPGRTNQPKQNQPTAI (mellom posisjonene 639 og 670).
Disse sekvensene vil støtte funn av BORIS i den kjerne, så vel som den translokasjon av CTCF inn i kjernen i løpet av differensieringen av humane hematopoetiske celler [27].
UBF (oppstrøms bindende faktor) er nylig blitt identifisert som den første felles samspill partner for BORIS og CTCF [28]. Denne interaksjonen ble vist å være direkte og å kreve at sink finger domener av BORIS og CTCF, høy mobilitet gruppe (HMG) -boks en, og dimerization domenet til UBF. CTCF ble funnet å binde umiddelbart oppstrøms av ribosomet avstands promoteren i en metylering-sensitiv måte, hvor det er foreslått å laste UBF på rDNA for å danne en del av et nettverk som opprettholder rDNA-gener klar for transkripsjon. Vår immunfluorescens farging viste ikke anrikning av CTCF i den kjerne, men lave nivåer av CTCF kan være tilstede, men under deteksjons i vår analyse. Torrano et al., Viste at translokasjon av CTCF til nucleolus etter induksjon av differensiering i humane og rotte-celler ble regulert av poly (ADP-ribosyl) asjon [27]. UBF er meget rikelig i kjerne og har vist seg å være svært dynamisk [29]. Således kan den direkte interaksjon mellom CTCF og UBF være forbigående, og siden BORIS gjenkjenner de samme DNA-bindingsseter [1], kan det være konkurranse mellom CTCF og BORIS å binde UBF [22]. Tatt sammen med funnene som er beskrevet her, BORIS spiller direkte interaksjon av BORIS med UBF antyder en viktig rolle i ribosomet biogenesis.
Avsluttende kommentarer
Dette er den første rapporten som viser BORIS lokalisering hovedsakelig nucleolus i mange forskjellige maligne og ikke-maligne celletyper. Den kjerne er en multi-funksjonelle sub-kjernekammeret, hvor for eksempel, er ribosomale RNA syntetisert, bearbeidet og satt sammen med ribosomale proteiner [30], [31], [32]. Imidlertid har omfattende proteomikk analyser avslørte den dynamiske natur nukleolært proteomet og antyder at nucleolus kan utføre mange andre biologiske roller i tillegg til ribosom biogenesis som regulering av bestemte aspekter av mitose og cellecyklusprogresjonen [24], [33] , [34]. Her viser vi at BORIS er klart mer enn en testikkel-spesifikt protein, og viser en tydelig subcellulære lokalisering i flere cellelinjer så vel som normale mennesker og mus vev. BORIS er beriket i nucleolus, inne nucleolin kjernestruktur og grenser til fibrillarin. Vår nye funn av utbredt uttrykk for BORIS sammen med sine nukleolære lokalisering garanterer videre undersøkelser for å fastslå den nøyaktige funksjon i denne sammenheng.
Materialer og metoder
Cell Culture
Kreft celle linjer ble holdt i RPMI eller i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (med mindre annet er angitt), 100-enheter /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin og 0,29 mg /ml L-glutamin (Invitrogen). Cellelinjer som ble anvendt var humane lungefibroblaster MRC5 (ECACC); embryonale nyrecellelinje HEK293T; kolorektal cellelinjer C99, HCT55, HCT116, HCT15, LoVo og SW837; medulloblastoma cellelinje DAOY; prostata kreft cellelinjer Du45 og PNT2; melanoma cellelinjer A375M, Mel 501, SBCL2, UISO, Mel 6, WM115, WM1158, M2629bM og WM278; neuroblastom cellelinjer ACN, IMR-32 og LAN1 og glioblastom cellelinjer CRL-2365, CRL-2610 (LN-18), CRL-1620 (A-172), CRL-2020, CRL-2611, U-118 mg, U- 138 MG, U251 og U87 MG (ATCC). MRC5-celler ble dyrket i de ovenfor angitte media, supplert med 20% føtalt bovint serum. Humane neurale stamceller avledet fra cellelinje H9 (46, XX) (EnStem-A, Millipore) ble dyrket i Neurobasal medium (Invitrogen, 21103-049) supplert med B27 (Invitrogen, 12587-010), FGF-2 10 ng /ml (Peprotech), 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen) og 2 mM glutamin (Invitrogen). Halvparten av mediet ble endret annenhver dag. In vitro differensiering ble indusert ved å utelate FGF-2 fra mediet.
Tissue protein isolasjon
Mus vev ble isolert fra tre måneder gamle C57BL6 eller NOD mus og hurtigfrosset i flytende nitrogen. Alle forsøksprotokoller som involverer mus vev ble godkjent av Home Office Animal Prosedyrer Komiteen, under prosjektet lisensnummer PPL 70/6693. Vevene ble avbrutt i Qiagen RLT lyseringsbuffer for RNA-ekstraksjon, eller inn i 1X RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Na deoksycholat, 0,1% SDS) inneholdende proteaseinhibitorer (Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-fri, Calbiochem) og fosfatase-hemmere (fosfatase hemmer Cocktail Set II, Calbiochem) for protein analyse. Totalt proteinlysatene ble fremstilt fra 10
8 celler i 1X RIPA buffer. Lyserte cellene ble ultralydbehandlet kort med en Bioruptor og rusk fjernet ved sentrifugering. Proteininnholdet av ekstraktene ble estimert ved hjelp av BCA-kit (Thermo Fisher Scientific) i henhold til produsentens protokoll.
RNA Isolation og revers transkripsjon
Total RNA ble isolert ved anvendelse av silika-baserte spin-kolonne utvinning kit (RNeasy mini kit, Qiagen) etter produsentens protokoll. Totalt RNA ble behandlet med RNase-fritt DNase1 (Ambion) for å redusere genomisk DNA-forurensning. RNA integritet ble evaluert ved bruk av Agilent Bioanalyzer. To mikrogram av total RNA ble revers transkribert med SuperScriptase III (Invitrogen) ved anvendelse av oligo-dT primere eller tilfeldige heksamerer i henhold til produsentens protokoll. Negative (-RT) kontroller inneholdt RNase-fritt vann byttet ut med revers transkriptase.
Kvantitativ Real-Time PCR
Begge de publiserte primere [3] og vår egen designet med Primer Express 2.0 ble brukt I denne studien. Sammen disse primere forsterke 19 av de 23 isoformer av BORIS beskrevet nylig [19]. Menneske primere var som følger:
BORIS exon 4-5 frem:
5′-AAAACCTTCCGTACGGTCACTCT-3 «
og omvendt: 5′-TGTTGCAGTCGTTACACTTGTAGG-3′
og probe: Fam-TAACACCCACACAGGAACCA-Tam
CTCF exon 5-6 frem: 5′-GAGAAGCCATTCAAGTGTTCCAT-3 «
og omvendt: 5′-CTCCAGTATGAGAGCGAATGTGA-3′
og sonde. Fam-ATTACGCCAGTGTAGAAGTCAGC-Tam
Mus primere var som følger:
BORIS exon 5-6 frem:
5′-AGTGCTCCCTGTGCAAGTACG-3 «
og omvendt 5′-GTAAGCACACTGGCAACACTGG-3′
og probe: Fam-AAGCAAGATGAAGCGTCACAT-Tam
CTCF exon 5-6 frem:
5 «-TCGTTATAAACACACTCATGAGAAACC-3»
og omvendt: 5′-TCTCCAGTATGAGAGCGAATGTG-3 «
og sonde. Fam-AGTGTTCCATGTGTGATTGTCAG-Tam
mRNA nivåer ble kvantifisert på en ABI7500 instrumentet med SYBR Grønn Jumpstart Taq READYMIX kit (Sigma-Aldrich) eller platinium Taq polymerase kit (Invitrogen) med 50-100 ng cDNA (unntatt for BORIS primere når 150-200 ng av cDNA ble brukt) og 100-200 nM primere. Vi brukte primere som spenner over exon 4/5 krysset av BORIS og funn ble bekreftet ved hjelp av publiserte primere til ekson 6/7 [2], [3], og ekson 9/10 [13] i en QRT-PCR-analyse med forskjellige konsentrasjoner av total cellulær RNA. Absolutte konsentrasjoner ble beregnet ved bruk av standardkurver generert fra serie fortynning av amplikonene. Terskelen sykle fra serielle fortynninger av enkelt strandet oligonukleotider ble plottet mot log kopiantall av målet PCR produktene, og rapporteres som kopiantall /mikrogram total RNA [35].
Western Blot analyse
20-50 ug protein ekstrakt og 10 pl av molekylvektstandard (Invitrogen Novex®Sharp Pre-farget protein standard, LC5800 eller GE Healthcare Total Rainbow Marker, RPN800E) ble separert på en 4-12% gradient NuPAGE polyakrylamidgel (Invitrogen) og deretter blottet på nitrocelluose membran (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Nitrocellulosemembranen ble inkubert i Tris-bufret saltvann blokkeringsoppløsning inneholdende 5% skummet melk og 0,1% Tween-20. Membranen ble deretter probet med primære antistoffer ved hjelp av standard betingelser. Vi valgte to antistoffer mot BORIS; et kanin polyklonalt antistoff ab18377 (Abcam), fremskaffet mot et syntetisk peptid i løpet av de første 100 aminosyrer, og et kanin polyklonalt antistoff HPA001472 (Sigma), dannet mot aminosyrene 33-172. Disse kommersielt tilgjengelige antistoffer bør kjenne igjen de fleste av de 23 isoformer av BORIS og har vært preget tidligere [13], [28]. BORIS antistoff ab18337 (1:1000 fortynning, Abcam) ble brukt for alle vestlige data vist og BORIS antistoff HPA001472 (1:200 fortynning, Sigma) ble brukt til å bekrefte bandene (data ikke vist). For CTCF, brukte vi antistoff 07-729 (1:1000 fortynning, Millipore) og for GAPDH vi brukte antistoff 14C10 (1:2000 fortynning, Cell Signal). Etter flere vaskinger ble bånd avdekket mot den tilsvarende pepperrot peroksidase koblet sekundært antistoff og påvist ved anvendelse av ECL-påvisning kit (GE Healthcare) i henhold til produsentens protokoll.
Immunofluorescence
Celler ble dyrket på dekkglass og fiksert med 4% paraformaldehyd (elektronmikroskopi Sciences) i fosfat-bufret saltoppløsning, 0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, pH 7,2-7,4 i 10 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av permeabiliseringen i blokkeringsbuffer (fosfat-buffret saltvann inneholdende 0,1% Triton X-100, 0,01% saponin og 10% geiteserum) i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble så inkubert med de spesifikke antistoffer i blokkeringsbuffer over natten ved 4 ° C. BORIS antistoff ab18337 (1:100 fortynning, Abcam) ble brukt for alle standard bildebehandling. BORIS antistoff HPA001472 (1:25 fortynning, Sigma) ble brukt for confocal bildebehandling og filmer. Farging med begge antistoffer viste identisk lokalisering. Vi brukte CTCF antistoff 07-729 (1:1000 fortynning, Millipore), Nucleolin (C23) antistoff sc-8031 (1:1000 fortynning, Santa Cruz Biotechnology) og Fibrillarin antistoff ab18380 (1:1000 fortynning, Abcam). Celler ble vasket i PBS, og primære immunreaksjoner visualisert etter inkubasjon i en time ved romtemperatur med Alexa Fluor 594 kylling anti-mus IgG, A-21201 og Alexa Fluor 488 kylling-anti-kanin-IgG, A-21441 (begge Invitrogen). Kjerner ble motfarget med 0,1 mg /ml 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, Molecular Probes), og dekkglassene ble montert i Mowiol (Calbiochem). For standard 2 dimensjonale analyseprøver ble visualisert ved hjelp av en Zeiss Axiophot mikroskop utstyrt for epifluorescence bruker Zeiss plan-neofluar 20x, 40x eller 100x mål. Separate gråtonebilder ble registrert med et avkjølt CCD-kamera (Hamamatsu, Welwyn Garden City, UK). Bildeanalyse ble utført ved hjelp av Smart X programvare (Digital Scientific, Cambridge, UK). For 3-dimensjonal analyse prøvene ble undersøkt ved hjelp av en Zeiss Meta 510 LSM bruker en 63x objektiv. Deconvolution av bilder ble utført ved hjelp av Huygens Essential og bilder deretter behandles i Imaris x64 (v7.1.1).
Peptide Competition
Antistoff spesifisitet ble vurdert ved hjelp av en bestemt blokkering peptid ab22203 (Abcam). 20 ug peptid ble tilsatt til 10 ug BORIS antistoff ab18337 (Abcam) i 200 ul TBST-buffer og inkubert ved 37 ° C over natten. Både blokkert og avblokkert antistoff ble fortynnet 1:10 i blokkeringsbuffer i immunfluorescens. Alle bilder for både blokkert og avblokkert antistoff ble samlet ved hjelp av samme eksponeringstider. BORIS antistoff spesifisitet ble også vurdert ved å utføre Western blotting med peptid blokkerte antistoff fortynnet 1:100 i blokkeringsløsning inneholdende 2 pg /ml blokkerings peptid. Kontroll ublokkert antistoff ble inkubert på samme tid i hensiktsmessig blokkeringsbuffer uten tilsetning av blokkerende peptid.
Kloning og Transfeksjon
Rekombinant-konstruksjonene GFP-BORIS eller GFP-CTCF, ble fremstilt ved å sette inn BORIS eller CTCF cDNA inn pEGFP-C3 vektor (Clontech). Fragmenter som koder for full lengde BORIS (1-663aa) og CTCF (1-727) ble generert ved PCR ved hjelp av følgende primere:
BORIS-GFP frem:
5′-CGGAATTCTGATGGCAGCCACTGAGATCTCTGTC-3 «
og omvendt: 5′-GCGGGATCCTCACTTATCCATCGTGTTGAGGAGC-3 «
CTCF-GFP frem:
5′-CGGAATTCTGATGGAAGGTGATGCAGTCGAAGCC-3′
og omvendt: 5 «-GCGGGATCCTCACCGGTCCATCATGCTGAGAGGATC-3»
og pCMV6-XL5-BORIS eller pCMV6-XL5-CTCF plasmider (Origene) som maler, hhv.
PCR-fragmenter ble fordøyd med EcoRI /BamHI satt inn i pEGFP-C3 MCS i-frame of EGFP. Hver konstruksjon ble bekreftet ved sekvensering. Den resulterende GFP-BORIS, GFP-CTCF og pEGFP-C3 vektorer ble transfektert inn HEK293T celler ved hjelp Fugene 6-HD (Roche) i henhold til produsentens protokoll. Live-transfekterte celler sådd ut på dekkglass ble farget med Hoechst 333412 (Invitrogen) og avbildes 48 timer etter transfeksjon. For Vest-analyse, ble tre millioner celler transfektert hjelp Fugene 6-HD (Roche) og cellene samlet for protein utvinning 72 timer senere.
shRNA mediert knockdown Boris
HEK293T celler ble transient transfektert hjelp rensede og sekvensen bekreftet plasmider: GI320730 (. målrettet mot en BORIS bestemt område kodet for av Exon 5 som er inkludert i 19/23 spleisevarianter som er identifisert av Pugacheva et al, [19]), GI320731 (målrettet til en BORIS bestemt område kodet for av Exon 3 som er til stede i alle 23 varianter), TR30007 (tom pGFP-V-RS vektor) og TR30008 (29-mer ikke Effektiv GFP (pGFP-V-RS)) fra Origene (kit katalognummer TG305184). Kort fortalt ble HEK293T celler transfektert med shRNA kloner GI320730, GI320731, TR30008 eller TR30007 hjelp Fugene 6-HD (Roche). Celler ble analysert 72 timer etter transfeksjon. Tre biologiske gjentatte shRNA eksperimenter ble utført for hver klon shRNA. Kvantifisering av mRNA-transkripter ble utført ved anvendelse av RT-PCR og alle data normalisert til GAPDH og tom vektor satt til 1. For kvantifisering av BORIS immunfluorescens farging ble bilder av HEK293T cellene oppsamlet 72 timer etter transfeksjon ved bruk av den samme eksponeringstid. Bilder tatt fra 5 tilfeldige felt som inneholder minst 30 celler ble importert til ImageJ programvareversjon 1.44 (Rasband, WS, ImageJ, amerikanske National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/) . Regioner av interesse (ROI) ble opprettet som en maske rundt DAPI farget kjerner (blå) og terskelen justeres for å fjerne bakgrunnen. Fluorescensintensitet ble beregnet for BORIS Alexa 594 signal (rød) innenfor denne masken og bety atom fluorescens ble beregnet ved å dividere den totale intensitet ved kjerneområde i hvert bilde. Data ble eksportert til Excel og statistisk signifikans ble vurdert av One-Way Anova analyse.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Antistoff peptid konkurranse i normale og kreftcellelinjer. Western blot analyse ved hjelp BORIS antistoff ab18337 (Abcam) med og uten spesifikk blokkering peptid ab22203 (Abcam). Inkubering av 20 ug peptid med 10 ug BORIS antistoff ab18337 (Abcam) i 200 ul TBST-buffer ved 37 ° C over natten fullstendig blokkert båndene som oppnås ved hjelp av un-blokkerte antistoff. magnification.
doi:10.1371/journal.pone.0022399.s011
(AVI)
Acknowledgments
Colorectal
