Abstract
Bakgrunn
Spesifikke gener er metylert med høy frekvens i kolorektal neoplasi, og kan lekke inn blod. Påvisning av flere denaturert DNA biomarkører i blod kan forbedre analysen følsomhet for tykk- og endetarmskreft (CRC) i forhold til en enkelt markør. Vi foretok en case-control studie som evaluerer tilstedeværelse av to metylering DNA-markører,
BCAT1 Hotell og
IKZF1
, i omløp for å finne ut om de var utfyllende for påvisning av CRC.
Metoder
metylering spesifikke PCR-analyser ble utviklet for å måle nivået av metylert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
i DNA ekstrahert fra plasma hentet fra koloskopi-bekreftet 144 friske kontroller og 74 CRC tilfeller
Resultater
DNA gir varierte 2-730 ng /ml plasma. (mener 18.6ng /ml, 95% CI 11-26 ng /ml) og ikke korrelerer med kjønn, alder eller CRC status. Metylert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA ble påvist i henholdsvis 48 (65%) og 50 (68%) av de 74 kreftformer. I kontrast, bare 5 (4%) og 7 (5%) kontroller var positive for
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA metylering, henholdsvis. En to-genet klassifiseringsmodell ( «enten eller» -regelen) forbedret segregering av CRC fra kontrollene, med 57 av 74 kreftformer (77%) sammenlignet med bare 11 av 144 (7,6%) kontroller være positivt for
BCAT1
og /eller
IKZF1
DNA metylering. Økende nivåer av denaturert DNA ble observert som CRC scenen kommet.
Konklusjoner
Påvisning av denaturert
BCAT1 Hotell og /eller
IKZF1
DNA i plasma kan ha klinisk anvendelse som en roman blodprøve for CRC. Kombinere resultatene fra de to metylering spesifikke PCR-analyser forbedret CRC gjenkjenning med minimal endring i spesifisitet. Ytterligere validering av denne to-genet blodprøve med tanke på bruk i screening er nå angitt
Citation. Pedersen SK, Baker RT, McEvoy A, Murray DH, Thomas M, Molloy PL, et al. (2015) En to-Gene Blood Test for metylert DNA Sensitive for tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (4): e0125041. doi: 10,1371 /journal.pone.0125041
Academic Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Det medisinske fakultet, CHILE
mottatt: 13 november 2014; Godkjent: 08.03.2015; Publisert: 30 april 2015
Copyright: © 2015 Pedersen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble delfinansiert av Clinical Genomics Pty Ltd og Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO). LCL, SKP, RTB, AM DHM og MT er ansatt i klinisk Genomics Pty Ltd PLM, SM og TL blir ansatt av CSIRO. GPY er en betalt konsulent for klinisk Genomics Pty Ltd. finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Følgende forfattere erklærer potensial konkurrerende interesser, ved at de ble ansatt i, eller mottatt konsulenthonorarer fra, Clinical Genomics Technologies Pty. Ltd .: LCL, SKP, RTB, AM, DHM, MT, og GPY. LCL, RTB, SKP, PLM, SM, TL er oppfinnere på en eller flere patentsøknader som dekker metylering DNA biomarkører som er beskrevet i denne artikkelen. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en stor folkehelseutfordring og screening er et viktig verktøy i kreft kontroll i land med en betydelig CRC byrde. Men deltakelse med screening basert på invasiv koloskopi eller avføring prøvetaking er lav [1]. En fersk undersøkelse av screening-alder fagene støtter sannsynlig aksept av en blodprøve for CRC med 78% av deltagerne foretrakk et blodprøve til et krakk test [2].
Nye forbedringer i molekylære teknologi har vist at tumor-avledet nukleinsyrer i blodet kan bli detektert i en robust og reproduserbar måte [3]. Spesielt er det akkumulerende litteratur som dokumenterer sirkulerende tumorspesifikt muterte og /eller denaturert DNA og RNA [4-8].
Vi har tidligere beskrevet oppdagelsen og validering av en rekke nye hypermethylated gener som er karakteristiske for kolorektal neoplastisk vev [9]. Metylering spesifikke analyser konstruert for å oppdage disse hypermethylated genene viste minimalt signal i DNA ekstrahert fra sammenslått blod fra friske donorer for en undergruppe av markørene [9]. Basert på deres relative nivåer av potensielle bakgrunn valgte vi to gener, forgrenet-chain amino syre nase 1,
BCAT1
, og Ikaros familie sink finger protein 1,
IKZF1 product: [9,10] som bly kandidater til vurdering som grunnlag for en blodprøve for CRC.
rapportere evalueringen av to metylering spesifikke PCR analyser for påvisning av denaturert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA ekstrahert fra plasmaprøver fra 218 koloskopi undersøkes individer (144 friske kontrollpersoner og 74 CRC tilfeller) å avgjøre om metylering biomarkører var utfyllende for påvisning av CRC.
Materialer og metoder
saker og kontroller
blod ble innhentet fra frivillig og informert emner planlagt for koloskopi ved Flinders Medical Centre (FMC) eller Hjemsendelse General Hospital (Adelaide, SA, Australia) som ga skriftlig samtykke i samsvar med studieprotokollen og godkjent av Forsknings og etikkomiteen av Hjemsendelse General Hospital og etikkomiteen av Flinders Medical Centre. Blod ble samlet opp ved blodprøvetaking etter tarm forberedelse, men før koloskopi. Klinisk diagnose ble fastsatt på grunnlag av colonoscopic funn og histologisk vurdering. Kreft ble iscenesatt i henhold til AJCC Cancer staging 7
th utgaven. Andre plasmaprøver fra koloskopi-undersøkt pasienter ble hentet fra Proteogenex Inc. CA, USA (PGX) som samlet blod fra frivillige 3-10 dager etter sitt utforsk koloskopi. Prøvene ble valgt ut for analyse i ettertid til koloskopi basert diagnose. Krefttilfeller (FMC: n = 25, PGX: n = 49) ble valgt basert på volum tilgjengelighet, mens kontroller (FMC: n = 85, PGX: n = 84) ble valgt basert på ingen opptreden av hyperplastiske og adenomatøse polypper (men slik godartet forhold som hemorroider og divertikulær sykdom), med et forsøk på å kjønns alder kamp CRC tilfeller tilgjengelig for testing.
Plasma forberedelse
plasma komponent fra fullblod samlet i K
3EDTA Vacuette rør (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland) ble isolert ved sentrifugering ved 1,500g i 10 minutter ved 4 ° C (bremsene er deaktivert på sentrifuge). Det øverste lag plasmafraksjon ble hentet og sentrifugering ble gjentatt. Det resulterende «to-spin» plasma ble lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse. Den totale tiden fra blodprøvetaking til frysing av plasma var ikke mer enn fire timer på alle rekrutteringssider.
Prosesskontroll
Pooled plasma av kjønns- og alderstilpassede donorer under 30 år er kommersielt hentet (Bioreclamation, NY, USA) og anvendt godt som en negativ kontroll eller tilsatt sonikert fullt metylert humant genomisk DNA (Millipore, MA, USA), 1250pg /ml, som en positiv kontroll. Disse prosess kontroller ble fremstilt som 2-liters porsjoner og lagres deretter som 4 ml alikvoter ved -80 ° C inntil videre anvendelse.
Studiedesign
Plasma-prøver ble behandlet tilfeldig i grupper på 24 prøver, inkludert ett positiv prosesskontroll, et negativ prosesskontroll og 22 kliniske prøver (fenotyper blindet for å analysere operatører).
Isolering og bisulfitt omdannelse av cellefritt sirkulerende DNA
Cell-free sirkulerende DNA (cfDNA) ble hentet fra 4 ml plasma ved hjelp av QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Utvinningen ble semi-automatisert på to Qiacube flytende handlers (12 prøver per instrument per løp) som anbefalt av produsenten (Qiagen). Elueringsvolumet ble satt til 40 pl av og eluatet ble på nytt manuelt påført på silikakolonne for å forbedre cfDNA utbytte. Den EpiTect Fast Bisulfite Conversion kit (Qiagen) ble brukt til å bisulfitt konvertere isolert cfDNA. Bisulfitt omdannet DNA ble renset på Qiacube instrumentering ved hjelp av EpiTect Plus Bisulfite kit (Qiagen) med to modifikasjoner: 1) kolonner fra QIAamp Circulating nukleinsyre kit ble anvendt i stedet for kolonner anordnet i Epitect Plus Bisulfite kit; 2) Epitect Plus bindingsbuffer ble fremstilt med isopropanol i stedet for etanol. Elueringsvolumet ble satt til 40 pl eluat og ble på nytt manuelt påført på silikakolonne for å forbedre cfDNA utbytte. Totalt 36μL bisulfitt omdannet cfDNA ble gjenopprettet fra hver 4 ml plasmaprøve. Vellykket utvinning av bisulfitt konvertert cfDNA ble bekreftet på duplikat input av 5 ul 1: 5 utvannet bisulfitt omdannes DNA ved hjelp av en ACTB PCR assay som tidligere beskrevet [11] med mindre modifikasjoner (se S1 tabell). Hver PCR-kjøring inkludert tre no-mal kontrollprøver og en standardkurve basert på en 4-fold seriefortynning av 5 ng bisulfitt-konvertert menneskelig DNA isolert fra hvite blodceller (WBC; Roche Applied Science, Basel, Sveits) utarbeidet i en bakgrunn av nukleasefritt vann (Promega, WI, USA). Massen av gjenvunnet bisulfitt omdannet cfDNA for hver behandlet prøven ble beregnet ut fra standardkurven ved hjelp av lineær regresjon passer til Cycle terskel (CT) verdier (se S1 figur).
Påvisning av denaturert
BCAT1
og
IKZF1
DNA
Utseende av denaturert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA i omløp ble målt på tre eksemplarer input av 5 ul renset bisulfitt omdannet DNA (tilsvarer f.eks til 0,5 ml plasma per PCR) med bisulfitt på konverteringer og metylering konkrete analyser som tidligere beskrevet [9] med mindre modifikasjoner (se S1 tabell). Kort fortalt de to real-time PCR-analyser målrettet denaturert CpG steder i regionene spenner 102- eller 95- nukleotider, enten innenfor eller like oppstrøms for første ekson av på
BCAT1 Hotell og
IKZF1
gener, henholdsvis (se S2 figur). DNA target forsterkning ble utført i 50 sykluser i en LC480 LightCycler, Modell II (Roche). Ct verdier ble beregnet ved hjelp av en 2
nd derivat algoritme som følger med LC480 programvare.
BCAT1
PCR-analyse (hydrolyse probe) og
IKZF1
PCR-analyse (SYBR grønt /smelte) ble kvalitativt kalt «positive» for
BCAT1
metylering hvis en total endring i fluorescens intensitet over bakgrunnsnivå ble målt innen 50 PCR amplifiseringscykluser. Videre for
IKZF1
positive kall, smelteprofilanalysen del av
IKZF1
PCR assay måtte gi en smeltetemperatur høyere enn 80 ° C (se S1 tabell). PCR-analyser uten signaler ble tildelt en vilkårlig Ct verdi på 50 for grafiske formål. Hver PCR-kjøring inkludert tre no-mal kontrollprøver, tre 5NG bis-konverterte WBC DNA (Roche) negative kontrollprøver, og en standardkurve basert på 4 ganger serie fortynning av 5 ng bisulfitt-konvertert fullt metylert humant genomisk DNA (Millipore) utarbeidet i en bakgrunn av bisulfitt-omdannet WBC DNA (Roche) (se fig S2). Hver standard punkt konsentrasjonen inneholdt til sammen 5 ng DNA. Metyleringen spesifikke analyser var kvantitativt fra 20pg (0,4%) til 5 ng (100%) av denaturert mål-DNA i en bakgrunn av WBC DNA (R «> 2 firkant verdier:
BCAT1
, 0,9370;
IKZF1
, 0,9387, S2 figur), men i stand til å detektere ned til 5PG (tilsvarer 1-2 genomiske kopier) av denaturert
BCAT1
og
IKZF1
DNA. Massen av denaturert
BCAT1 Hotell og
IZKF1
DNA for hver behandlet prøve ble beregnet ut fra standardkurven ved hjelp av lineær regresjon passer til CT-verdier. Massen av denaturert
BCAT1
eller
IKZF1
DNA uttrykt som den gjennomsnittlige massen (pikogram, pg) av denaturert
BCAT1
eller
IKZF1
DNA per tre eksemplarer PCR-analyse eller per ml plasma (se S2 tabell).
Prøveresultat Tolkning
gjenoppretting av bisulfitt konverterte DNA ble bekreftet dersom minst ett replikat var positiv i
ACTB
qPCR analyse. De resterende bisulfitt konverterte DNA ble deretter analysert som tredoble tilførsler av 5 ul i enten
BCAT1
eller
IKZF1
qPCR analyser. Følgende data ble samlet inn for hver behandlet prøve: to
ACTB
qPCR Ct målinger, masse bisulfitt konverterte DNA, tre
BCAT1
qPCR Ct målinger, tre metylert
BCAT1
masse målinger, tre
IKZF1
qPCR Ct målinger og tre metylert
IKZF1
målinger (S2 Table). Alle PCR forsterkning kurver ble visuelt inspisert. Før avsløre prøve fenotyper ble et eksemplar kvalitativt definert som klinisk positivt for CRC rapporteringsøyemed hvis noen av de tre paralleller i
BCAT1
eller listen
IKZF1
PCR analyser var positiv.
statistiske analyser
statistiske analysene ble utført ved hjelp GraphPad Prism v5.0d for Mac OS X (GraphPad Software, San Diego, California). For tetthet plott av mengder denaturert
BCAT1
eller
IKZF1
DNA, prøver med «no signal» resultater ble utelatt. Hver av triplikate bestemmelser inneholdt DNA isolert fra den tilsvarende 0,5 ml plasma. Den empiriske tetthet av ln (metylert
BCAT1
, pg) eller ln (metylert
IKZF1
, pg
)
ble beregnet separat for friske kontroller, tidlig stadium (stadium I + II) og sent trinn (trinn III + IV) kreft. Forutsatt en gaussisk fordeling for de metylering masse verdier (pg), for å gi maksimal entropi (verste tilfellet) med den observerte gjennomsnittet og variansen, ble tettheten igjen estimeres. Ved hjelp av disse tettheter beregnet vi den kumulative fordelingsfunksjon (F (x) = P (X≤x)) og rapportere en-F (x) for ln (s) denaturert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
verdier av 3, 3,9 og 4,6. Vi rapporterer også likelihood ratio i forhold til friske kontroller.
Resultater
Isolering av cellefritt DNA fra plasmaprøver
Ti individuelle satser ble utført for å behandle 218 plasmaprøver . Prosesskontroll bekreftet ikke confounding variasjon i gruppebehandling (data ikke vist).
ACTB
qPCR-analyse bekreftet vellykket gjenoppretting av bisulfitt omdannet DNA fra alle 218 bearbeidede plasmaprøver (se fig S3 og S2 tabell) og median DNA-konsentrasjoner i forhold til fenotype og kliniske tilstander av samlingen er oppsummert i tabell 1. de fleste av de gjenvunnede DNA-utbyttene var innenfor et to-gangers konsentrasjonsområdet (95% CI område~~POS=HEADCOMP: 11.2-26.2ng /ml). Betydelig lavere avkastning av bisulfitt konverterte DNA ble gjenvunnet fra prøver samlet inn av FMC i forhold til gjennomsnittlig avkastning utvinnes fra prøver samlet inn av PGX (median konsentrasjoner: FMC: 7,0 ng /ml, PGX: 17.8ng /ml, t-test p value 0,0001, se S3 figur). Inter-site protokoll forskjeller er blitt rapportert å forårsake den sterkeste variasjon i målte sirkulerende DNA-konsentrasjoner [12]. Vi overvåkes nøye innsamlings- og behandlingsprosedyrer for å sikre felles protokoller. Den eneste systematiske variasjonen som kan forklare disse kontrasterende DNA avkastning var forskjellige tidspunkter der blod ble samlet inn i forhold til koloskopi. Det var ingen korrelasjon mellom mengden av DNA utvunnet fra plasma og kliniske fenotype (se fig S3) i motsetning til studier med en høyere andel av sent stadium kreft [13,14]. Videre ble ingen korrelasjon observert mellom DNA yield, pasientens alder eller kjønn (data ikke vist).
Påvisning av sirkulerende metylert
BCAT1
og
IKZF1
DNA
nivåene av denaturert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA i bisulfitt omdannet DNA isolert fra de 218 plasmaprøver ble målt ved tre eksemplarer analyse av tilsvarende plasmavolum på 0,5 ml plasma per PCR godt. Sixty-åtte av de 218 plasmaprøver var positive for enten
BCAT1
anmeldelser og /eller
IKZF1
metylering (tabell 1 og S2 tabell). Ingen korrelasjon ble observert mellom analyse positivitet priser og utbyttet av gjenvunnet bisulfitt omdannet cfDNA, pasientens alder (figur 1) eller kjønn (se S4 figur). Statistisk signifikante høyere positivitet priser ble målt i CRC tilfeller sammenlignet med kontroller både metylering analysene (Fig 2, p-verdier og lt; 0.0001).
BCAT1
metylering analysen var positiv i 53 av de 218 analyserte prøvene inkludert 48 (65%) kreft og 5 (4%) kontroller.
IKZF1
analysen hadde en litt høyere positivitet sats med 57 positive prøver blant annet 50 (sekstiåtte%) CRC tilfeller og 7 (5%) kontroller. Økende positivitet rater ble observert med CRC scenen for begge merkene som vist i Tabell 1. Lesjon steder ble kjent for 70 av de 74 krefttilfeller (S2 Table). Det var ingen forskjell i positivitetsrater målt i proksimale versus distale kreft (proksimale, n = 21, 16 positiver (76%), distal, n = 49, 38 positiver (78%), t-test p-verdi: 0,9029).
Korrelasjons plott av gjennomsnittlig Ct signaler målt i
BCAT1
(svarte trekanter) og
IKZF1 plakater (hvite trekanter) metylering analyser versus (A) masse av gjenvunnet bisulfitt omdannet DNA per ml plasma eller (B) alder av fag på tidspunktet for blodprøvetaking. Analyse replikerer med «ingen signal» ble tildelt vilkårlig Ct verdien av ’50» for skildring formål.
BCAT1 plakater (toppanelet, svarte trekanter) og
IKZF1
(nederst panel, hvite trekanter) metylering konkrete analyser ble brukt for å vurdere utseendet av sirkulerende metylert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA i 218 plasmaprøver inkludert 144 friske kontrollpersoner og 74 kreftformer. Mann-Whitney t-tester ble utført på beregnede positivitet priser for hver fenotypiske klasse å utlede P-verdier. De beregnede 95% konfidensintervall (95% CI) er indikert.
Metylering biomarkør komplementaritet
Sixty-åtte prøver var positive i minst ett av de to metylering analyser, hvorav bare 42 var positive for begge metylering markører (41 CRC tilfeller og en kontroll). Fig 3A viser at en kombinasjon kvalitativ resultat basert på minst én positiv replikere i enten
BCAT1
eller
IKZF1
metylering analyse produsert den høyeste klassifiseringen nøyaktighet (0,8469, 95% KI: 0,7848 til 0,9091 ) sammenlignet med noen av de markører alene (
BCAT1
; 0,8070, 95% KI 0,7368 til 0,8771,
IKZF1
; 0,8135, 95% KI: 0,7448 til 0,8822). Den 2-genet klassifiseringsmodell ( «enten eller» regelen) hadde en estimert følsomhet for CRC på 77% (95% KI: 65,8 til 86,0) sammen med en spesifisitet på 92,4% (95% KI: 86,7 til 96,4, fig 3), og dermed forbedre diagnose av kreft hastighet av mer enn 10%, med mindre enn en nedgang i spesifisitet 4%. Den kombinerte to-genet analysen positivitet for CRC etapper jeg-IV var 50%, 68%, 87% og 100% (Tabell 1).
sensitivitet, spesifisitet og diskriminerings nøyaktighet verdier for
BCAT1
,
IKZF1 Hotell og kombinert to-gen-analyser ble beregnet ved hjelp av sanne og falske positivitet priser målt i 144 friske kontrollgruppen og 74 krefttilfeller (A) og deretter plottes på Receiver Operatør Karakteristisk (ROC) plass tomter (B). Single-genet analyser: En plasmaprøve ble kvalitativt kalt «positive» hvis minst en PCR gjenskape resulterte i en Ct signal. To-genet analysen: Et eksemplar ble kvalitativt kalt «positivt» dersom minst en gjengivelse i enten
BCAT1
eller
IKZF1
analyser produsert en Ct-verdien
Nivåer av metylert
BCAT1
eller
IKZF1
DNA kontra sykdommens alvorlighetsgrad
god korrelasjon ble observert i syklus-terskel (CT) verdier målt i prøver positive for både
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA metylering (korrelasjon co-effektivitet R
2 = 0,9053, figur 4A). Hver av triplikate analysene inneholdt DNA isolert fra den tilsvarende 0,5 ml plasma. De gjennomsnittlige masser av denaturert
BCAT1
eller
IKZF1
DNA målt i CRC stadier II, III og IV ble betydelig høyere i forhold til gjennomsnittet massen av metylering målt i begrenset antall kontroller som var positive (fig 4B og 4C). Forholdet mellom målte nivåene av sirkulerende metylert
BCAT1
eller
IKZF1
DNA i plasma og kreft stadium ble modellert for å anslå sannsynligheten for kreft, gitt en metylert
BCAT1
eller
IKZF1
DNA masse estimat per tre eksemplarer analysen. Tetthet tomter ble estimert (Fig 5A og 5B, brutte linjer) med bare positive metylering massene for plasma kjente fenotyper klassifisert som friske kontroller, forstadier til kreft (Stage I + II) og sent stadium lungekreft (trinn III + IV). De modellerte tetthet tomter, forutsatt de observerte metylering nivåene ble trukket fra en normalfordeling (Fig 5A og 5B, heltrukne linjer), der brukes til å anslå kumulative sannsynligheter (figur 5C) som en plasmaprøve fra en kjent klassifisering ville vike en observert kreft avledet DNA-metylering nivå lik eller større enn den som svarer til 20-, 50- eller 100 pg. Vi fastslått at mindre enn 8% av positive kontrollplasmaprøver er funnet å inneholde minst 20 pg av denaturert
BCAT1
eller listen
IKZF1
-DNA, mens 63-77% av tidlig stadium kreften hadde 20 pg eller mer. Dermed er sannsynligheten for en plasmaprøve med ≥ 20 pg metylert
BCAT1
eller
IKZF1
DNA for å være et tidlig stadium kreften er ca 9: 1 og 210: 1, henholdsvis (tidlig stadium CRC: kontroll). Videre, en plasma-prøven med 100 pg av metylert
IKZF1
-DNA er ca 2,5 ganger større sannsynlighet for å bli trukket fra et motiv med sent stadium CRC (stadium III eller IV) enn en gjenstand med tidlig stadium CRC (Stage I eller II).
(A) Korrelasjon tomt på gjennomsnitts Ct-verdiene (log (CT)) målt ved
BCAT1
eller
IKZF1
essay fra 144 friske kontroller (svart sirkler) og 74 CRC (hvite sirkler). PCR gjentak med noe signal ble tildelt en vilkårlig Ct verdi på 50 for skildring formål. Square kvadranter (a) til (d) representere: (a) 15
BCAT1
negativ, men
IKZF1
positive tilfeller; (B) 42
BCAT1 Hotell og
IKZF1
positive tilfeller inkludert 41 kreft og en kontroll; (C) 11
BCAT1
positiv, men
IKZF1
negative saker; (D) 150
BCAT1 Hotell og
IKZF1
negative saker. En lineær regresjonsanalyse ble utført på 38 av 41
BCAT1 Hotell og
IKZF1
positive CRC tilfeller (kvadrant b), utelat tre CRC uteliggere. Broken diagonale linjer indikerer 95% KI rekkevidde. Den beregnede R kvadrat verdi vises. Massen (ng) av metylert
BCAT1 plakater (B) og
IKZF1 product: (C) DNA ble beregnet og plottet som massen av metylering per ml plasma trukket fra 144 kontroll tilfeller, 4 trinn I, 28 trinn II, 23 trinn III, 8 Stage IV (8 CRC saker med ukjent iscenesettelse utelatt). Gjennomsnittlig og median masse nivåer i de fem fenotypiske klassene angitt nedenfor grafene. Mann-Whitney t-test utført på medianverdier, ***: p-verdi 0.05, ns. Ikke-signifikant, sammenlignet med 144 friske kontroll tilfeller
Den estimerte gjennomsnittlige massen av (A)
BCAT1 Hotell og (B)
IKZF1
DNA i hver av de tre eksemplarer analysene som inneholder DNA isolert fra tilsvarende 0,5 ml plasma fra friske kontroller (svarte linjer,
BCAT1
: n = 5,
IKZF1
: n = 2 * ), tidlig stadium kreft (blå linjer, Stage I + II,
BCAT1
: n = 19,
IKZF1
: n = 17) og sent stadium kreft (røde linjer, Stage III + IV
BCAT1
: n = 22,
IKZF1
: n = 26) ble brukt til å beregne de empiriske sannsynlighetstetthetsplott, utelat «nei signal resultater (stiplede linjer). Heltrukne linjer: Populasjonsanordning (μ) og standardavvik (σ) ble beregnet ved å anta en normalfordeling for hver av de tre fenotypiske klassifiseringer. * Fem av de syv positive
IKZF1
kontroll tilfeller hadde Ct signaler i løpet av de siste 5 sykluser av PCR, derfor ingen masse estimering. (C) Kumulativ sannsynlighet for en plasmaprøve med
BCAT1
eller
IKZF1
DNA metylering nivåer lik eller større enn 20-, 50- eller 100pg metylert DNA fra en pasient med den angitte fenotypiske klassifisering; masse terskler ble bestemt som arealet under kurven (heltrukne linjer på panelene A og B) for ln (PG) verdier som er større enn 3, 3,9 og 4,6, respektivt (se stiplede vertikale linjer og piler) i Panelene A og B. Likelihood forholdstall i forhold til friske kontroller i parentes.
Diskusjoner
Vi har tidligere rapportert utviklingen av to bisulfitt konvertering og metylering spesifikk PCR-analyser brukes til å oppdage tykktarms neoplastisk bestemt metylering i genloci
BCAT1 Hotell og
IKZF1 product: [9]. Vi optimalisert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
metylering qPCR analyser for påvisning av metylering forhold så lavt som 0,1%, som slike lave nivåer av tumor-avledet DNA har blitt rapportert i plasmaprøver fra pasienter med tidlig stadium CRC [4,15]. I dette case-control studie viser vi at metylert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA oppdages oftere i CRC tilfeller (65% og 68%, henholdsvis) enn i koloskopi-bekreftede friske kontroller ( 4% og 5%, respektivt), og at de to DNA-metylering markører er komplementær (kombinert positivitet på 77% og 7,6% i CRC og friske kontroller, henholdsvis).
til sammen 41/74 kreft tilfeller var positivt for både metylert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA sammenlignet med bare 1/144 kontroll). Kombinere resultatene fra de to analysene resulterte i en diskriminerende nøyaktighet på 0,8469 som ble bedre enn både analysen alene (
BCAT1
analysen: 0,807,
IKZF1
analysen: 0,8135), Fig 3. Vurderer enten-eller to-gen-analysen, ble flere CRC tilfeller detekteres, med en korrekt segregering av 57/74 (77%) og bare 11/144 (7,6%) friske kontroller blir feilklassifisert. Disse to-genet data gir overbevisende, enkle bevis for at flere biomarkører kan forbedre følsomheten uten store kompromisser av diagnoseverktøy i form av lavere spesifisitet.
Påvisning av denaturert
BCAT1 Hotell og
IKZF1
DNA i blodet ikke er avhengig av alder eller kjønn på emnet, eller mengden av gjenvunnet bisulfitt omdannet cfDNA. En signifikant forhold bare observert klinisk fenotype. Både hyppigheten av deteksjon og mengden av metylert
BCAT1 Hotell og /eller
IKZF1
DNA slippes ut i blodet økte med kreft stadium. Sistnevnte var statistisk signifikant i trinn II, III og IV krefttyper, med en høyere metylering masse observert sammenlignet med nivået målt i de få positive friske kontrollpersoner (figur 4). Lignende observasjoner er også kjent for godt studert
SEPT9
metylering analyse [16,17]. Ved montering modeller for kreft klassifisering (kontroller, tidlig eller sent kreft), viser vi potensialet for bruk av nivået på metylert
BCAT1 Hotell og /eller
IKZF1
DNA i blodet for å anslå sannsynligheten for et positivt resultat som skyldes tilstedeværelse av kreft (figur 5). Tatt sammen, dataene støtter en enkel modell der evnen til å oppdage vev-avledede DNA-markører i sirkulasjonssystemet er en funksjon av den grad av invasjon av lesjon [18].
BCAT1
og
IKZF1
er begge involvert i tumorvekst og invasivitet [19,20]. En hypermethylated
BCAT1
locus er påvist i flere sykdommer, inkludert CRC [21,22] og avvikende epigenetisk regulering fører til en ratio skifte i tre hoved
BCAT1
mRNA transkripter ulike bare i første ekson, som havner alternative uoversatt regioner [20]. Hvordan BCAT1 isoformene påvirker celleproliferasjon er ukjent, men det er spekulert i at dysfunksjonelle produksjon av forgrenede aminosyrer kan påvirke syntesen av makromolekyler er nødvendig for celledeling, kanskje på det G1-til-S-cellesykluskontrollpunktet [23].
transkripsjonsfaktor,
IKZF1
, regulerer en rekke biologiske hendelser og dens rolle i lymphopoiesis og leukemi neoplasi har blitt grundig studert. Et nettverk av epigenetiske og transkripsjonsfaktorer regulerer
IKZF1
genaktivitet [24] og nye data antyder at
IKZF1
er også avgjørende for riktig regulering av spredning og differensiering av celler av ikke-hematopoietisk opprinnelse, inkludert kolon [25]. Med Nurd kompleks som hoved samspill partner [26], regulerer Ikaros den transkripsjonelle aktivitet av et lite sett av gener [23,27], inkludert
notch1 product: [28]. Notch signalveien er kritisk for mange celle-til-celle-vekselvirkninger, inkludert dannelsen av invadopodia [29].
SEPT9
er en negativ regulator av pseudopodia formasjon [30], som er en viktig hendelse som initierer cellespredning og fremdrift i omgivelser vev og stroma (nylig gjennomgått av [31]). Dermed tap av
SEPT9
uttrykk kan spille en aktiv rolle i tumorinvasjon, der metastatiske tumorceller gjennom dårlig forstått mekanismene migrere til karsystemet [trettito]. Vi spekulere i om
IKZF1
er kanskje et oppstrøms regulator av
SEPT9
aktivitet.
Notch pathway spiller en avgjørende rolle i selvfornyende prosessen med kolon krypten stamceller og sin produksjon av prolifererende og transitt forsterkende udifferensierte celler stamfedre, som beveger seg opp krypten og inn i villus hvor de videre, differensiere [33,34]. Vi spekulere om tap av
IKZF1
aktivitet på grunn av hypermethylation, fører til konstitutivt aktiv Notch-signalering som inhiberer differensiering av krypten stamceller og resulterer i en stor økning i udifferensiert forbigående forsterknings-celler som tidligere beskrevet [35-37].
Den økte positivitet observert i stadium i-IV kreft innebærer at påvisning av tumor avledet denaturert DNA-markører i blodet kan avhenge i stor grad av vaskularisering av tykktarms neoplastisk vev og økt invasjon generelt [18,38]. Hvis det stemmer, så en standardisert sensitivitet for påvisning av tumor avledet markører i omløp vil bli påvirket av brøkdel av stadium I kreft, som de fleste av stadium I kreft er usannsynlig å ha noen lymfatisk eller venøse kar invasjonen [18]. Som sådan, blodbaserte analyser er lite sannsynlig å påvise en signifikant andel av tidlig stadium kreft som kan oppdages av koloskopi. Dette kan forklare den lave følsomhet observert i en fersk prospektiv evaluering av
SEPT9
i 7900 asymptomatiske deltakerne der kun 48% av 53 CRC tilfeller (inkludert tjueto trinn I kreft) og 11% av adenomer ble oppdaget [17]. Vår egen datasettet kun tatt fire trinn I kreft, og mens to (50%) av disse ble oppdaget, prøvenumrene er i dag for lav til å konkludere om metylert
BCAT1 Twitter /
IKZF1
test vil gi god deteksjon av trinn i kreft. Inkludering av blodkar relaterte variabler (vaskulær invasjon, vaskulær overlevelse evne og tumor angiogenese) ser ut til å øke lagdeling av kreftpasienter [39].
