Abstract
leverkreft (HCC) er en utbredt sykdom over hele verden, og de fleste av HCC-relaterte dødsfall forekommer på grunn av lokal invasjon og fjernmetastaser. Cancer stamceller (cscs) er en liten undergruppe av kreftceller som har blitt antatt å være ansvarlig for metastatisk sykdom. Nylig har vi og andre identifiserte en CSC befolkning fra menneske HCC cellelinjer og xenografttumorer preget av deres uttrykk for CD133. Men de nøyaktige molekylære mekanismer som CD133
+ kreft stamceller lignende celler megle HCC metastaser har ikke blitt tilstrekkelig analysert. Her har vi sortert HCC celler ved hjelp CD133 som en kreftstamcelle (CSC) markør av magnetisk cellesortering (MACS) og viste at CD133
+ HCC celler ikke bare har større trekkfugl og invasiv kapasitet
i vitro
men er også utstyrt med forbedret metastatisk kapasitet
in vivo Hotell og i menneskelige HCC prøver sammenlignet med CD133
– HCC celler. Genuttrykk analyse av CD133
+ og CD133
– cellene i HCC linjen SMMC-7721 avslørte at G-protein-koblet reseptor 87 (GPR87) er sterkt uttrykt i CD133
+ HCC celler. I denne studien utforsket vi rollen GPR87 i reguleringen av CD133 uttrykk. Vi viste at overekspresjon av GPR87 oppregulert CD133 uttrykk, fremmet CSC-forbundet trekkende og invasive egenskapene
in vitro
, og økt startfasen
in vivo
. Motsatt stanse av GPR87 uttrykk reduserte nivåer av CD133 uttrykk. Konklusjon: GPR87 fremmer vekst og metastasering av CD133
+ kreft stilk-lignende celler, og våre funn kan avsløre nye mål for HCC forebygging eller behandling
Citation. Yan M, Li H, Zhu M, Zhao F, Zhang L, Chen T, et al. (2013) G protein-koblet reseptor 87 (GPR87) fremmer vekst og metastasering av CD133
+ Cancer Stem-lignende celler i leverkreft. PLoS ONE 8 (4): e61056. doi: 10,1371 /journal.pone.0061056
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 19 desember, 2012; Godkjent: 05.03.2013; Publisert: 10 april 2013
Copyright: © 2013 Yan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Key Program for grunnforskning of China (973) (2009CB521803), Natural Science Foundation National of China (81272438), National Key Sci-Tech spesielt prosjekt of China (2013ZX10002-11), Program for Shanghai Subject Chief Science (A) (09XD1403600) og ledende akademiske disiplin prosjekt Shanghai Municipal Education Committee (J50208). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er en av de vanligste kreft hos mennesker, og de fleste av HCC-relaterte dødsfall forekommer på grunn av lokal invasjon og fjernmetastaser [1]. Til tross for betydelige fremskritt, de fleste terapeutiske tilnærminger mislykkes i å eliminere alle tumorceller, og de gjenværende cancerceller ofte resultere i tumor tilbakefall og metastasering. Økende bevis har vist at kreftstamceller (cscs) kan være ansvarlig for motstand mot konvensjonell terapi og metastatisk sykdom [2], [3], [4], [5]. Imidlertid er de molekylære mekanismer for metastasering ikke er tilstrekkelig forstått.
CD133, en 5-transmembran-glykoprotein, er en viktig celleoverflateprotein som har blitt identifisert som en kreft stamcelle markør i ulike faste tumorer [6], [7], [8], inkludert leverkreft [5], [9], [10]. Vår tidligere studie først identifisert og bekreftet eksistensen av en liten undergruppe av CD133
+ HCC celler i HCC cellelinjer som viste økt clonogenicity
in vitro Hotell og potent tumorigenicity
in vivo product: [11 ]. Andre grupper har også vist at CD133
+ HCC celler besitter kreft stamcelle-lignende egenskaper, inkludert selvfornyelse, differensiering,
in vivo
startfasen og kjemoterapi motstand [12], [13], [ ,,,0],14], [15]. Men lite er kjent om rollen CD133
+ HCC celler i metastase.
G protein-koblet reseptor 87 (GPR87), også kjent som GPR95, er en celleoverflaten GPR som er overuttrykt i ulike kreftformer og spiller en avgjørende rolle i tumorcelleoverlevelse [16], [17]. Selv om mye bevis tyder på at GPR spiller viktige roller i regulering av cellemorfologi, polaritet og migrasjon [18], [19], [20], er det få rapporter om funksjonen av GPR87. Bare to rapporter har vist at GPR87 knockdown sensibiliserte kreftceller til DNA-skader indusert veksthemming via forbedret p53 stabilisering og aktivering [16], [21].
I denne studien, isolert vi en CD133
+ CSC-lignende undergruppe fra menneskelige HCC cellelinjer og viste at CD133
+ HCC celler vises trekkende og invasive egenskapene
in vitro Hotell og besatt metastatisk potensial
in vivo
. Videre utforsket vi rolle GPR87 i regulering av ekspresjonen av CD133, som i sin tur fremmet vekst og metastase av kreft stilk-lignende celler i HCC.
Materialer og metoder
Cell Culture
de Hep3B, SNU475 og PLS /PRF /5 HCC cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). Den SMMC-7721 cellelinjen ble hentet fra Cell Bank ved Institutt for biokjemi og cellebiologi, Kina Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Mhcc-97L linjen ble gitt av Liver Cancer Institute of Zhongshan Hospital, Fudan University (Shanghai, Kina). HCC-LY5 cellelinje ble etablert i vårt laboratorium ved isolering fra et HCC prøve fra en pasient som hadde gjennomgått leverkreft reseksjon i Liver Cancer Institute of Zhongshan Hospital, Fudan University (Shanghai, Kina). Alle cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Sigma-Aldrich, USA) inneholdende 10% varme-inaktivert FBS (BioWest, Frankrike) supplert med 100 IU /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, USA), og cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO
2.
Cell Isolation av Magnet Aktivert Cell Sorting (MACS)
cellene ble merket med primær CD133 /1-antistoff (mus lgG1, Miltenyi Biotec, Tyskland), og den CD133
+ og CD133
– celler ble deretter magnetisk isolert ved anvendelse av EasySep PE Selection Kit (StemCell Technologies, Canada) ifølge produsentens instruksjoner. Renheten av de sorterte celler ble evaluert ved Western blot. Trypanblått farging ble brukt til å vurdere sortert celle levedyktighet, og mer enn 90% levedyktighet ble ansett akseptabelt for nedstrøms eksperimenter.
Lentivirus Produksjon og Cell Transduksjon
GPR87 ORF sekvensen ble PCR-forsterket ved å bruke spesifikke primere (forover: 5′- TCGACGCGTATGGGGTTCAACTTGACGCTTG-3 «, omvendt: 5′- TTCCATATGGGCAAACATTACACGCAGACAA-3′) og klonet inn i pWPXL lentiviral ekspresjonsvektoren (Addgene, MA) ved å erstatte de GFP-fragmentet. Den CD133 cDNA-klon (Myc-DDK-merket ORF klone av Homo sapiens prominin 1 (PROM1), transkripsjon variant en som transfeksjon-klar DNA NM_006017.1) med full lengde ORF sekvensen ble kjøpt fra Origene (OriGene Technologies, Inc. Rockville) , som ble klonet inn i pWPXL lentiviral ekspresjonsvektoren (Addgene, MA) ved å erstatte de GFP-fragmentet. De pLVTHM-shGPR87 og pLVTHM-SHNC vektorer ble konstruert ved å sette inn glødet oligoer (GPR87: 5»- CCGGUGCUUUAUCUCAUUATT-3 «eller 5′-GGACCUUGGUACUUCAAGUTT-3′, NC: 5»- TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 «) inn i lentiviral pLVTHM vektor beskrevet på Addgene nettstedet.
viral emballasje ble utført i HEK 293T celler etter co-transfeksjon av pWPXL-GPR87 eller pLVTHM-shGPR87 vektor med psPAX2 emballasje plasmid og pMD2.G konvolutten plasmid (Addgene, MA) under anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Canada). Virusene ble høstet 72 timer etter transfeksjon, og de virale titere ble bestemt. Målceller (1 × 10
5), inkludert SMMC-7721, HCC-LY5, mhcc-97L, PLC /PRF /5 og Hep3B celler, ble smittet med 1 × 10
6 rekombinante lentivirus førende enheter i tilstedeværelsen av 6 mg /ml polybrene (Sigma-Aldrich, USA).
Immunhistokjemisk (IHC) Farging av menneske HCC vev
To hundre trettiseks menneskelig HCC vevsprøver ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk behandling på Guangxi Cancer Institute (Nanning, Kina), den Qidong Liver Cancer Institute (Qidong, Kina) eller First Affiliated Hospital of Zhejiang University (Hangzhou, Kina). De 236 HCC pasienter inkludert 190 menn og 46 kvinner (gjennomsnittsalder: 50,9 år, som strekker seg fra 21 til 83 år). Alle prosedyrer ble utført under konsensus avtaler og i samsvar med Kina Ethical Review Committee. Alle vevsprøver ble fiksert i 4% fosfatbufret nøytral formalin i minst 72 timer og rutinemessig innstøpt i parafin. Den microarray ble konstruert som tidligere beskrevet [22].
parafininnstøpte vev matriseseksjoner (5 mikrometer i tykkelse) ble fremstilt, og immunkonjugatene ble påvist ved immunfluorescens i henhold til de prosedyrer som er beskrevet tidligere [11]. For de optimale antistoff fortynninger ble produsentenes anbefalte konsentrasjoner ansatt. Resultatene ble visualisert og fotografert ved hjelp av en Axioskop 2 mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) med en DP70 CCD system (Olympus, Japan).
Sanntids Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Canada) og revers transkribert ved hjelp av PrimeScript ™ RT Reagent Kit (Perfect real Time) (Takara Bioteknologi, Japan). Den sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR) ble deretter utført som beskrevet tidligere [22]. Uttrykket nivåer ble normalisert mot de av intern referanse genet glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH).
Western Blot
cellelyse, prøveopparbeidelse, SDS-PAGE separasjon og electrotransferation til nitrocellulosemembraner ble utført ved anvendelse av standardprotokoller. Immunoblotting ble utført ved anvendelse av mus anti-CD133 /1 lgG1 (Miltenyi Biotec) og visualisert ved anvendelse SuperSignal West Femto maksimal følsomhet substrat (Pierce). β-actin ble reprobed som en lasting kontroll.
In Vivo
Analyse av tumorvekst og metastase
Alle dyreforsøk protokollene som brukes i denne studien ble godkjent av Shanghai Medical Experimental Animal Care kommisjonen på Shanghai Jiaotong University (godkjenning ID. ShCI-12-023). Seks til åtte uker gamle medfødt immunmangel nonobese diabetiker /alvorlig kombinert immun-mangel (NOD /SCID) hannmus ble tilfeldig delt inn i grupper og holdes under standardbetingelser i henhold til institusjonens retningslinjer.
For ortotopisk inokulering, 8 mm tversgående innsnitt ble gjort i den øvre del av magen under bedøvelse. Ti tusen CD133
+ eller CD133
– celler sortert fra SMMC-7721 celler ble suspendert i 50 ul serumfritt DMEM /Matrigel (01:01) og injisert i venstre leverlapp av mus ved hjelp av en mikrosprøyte. Svulstdannelse ble overvåket starter en uke etter vaksinasjonen.
in vivo
luciferase signal ble visualisert og målt ved hjelp av en
in vivo
bildesystem (LB983 NC320, Berthold Technologies GmbH . Co KG, Tyskland). Etter 12 uker ble alle musene avlivet, og tumormasser og inokulert prøver murine leveren vev ble dissekert og mikroskopisk undersøkt.
For å etablere en tumor-homing dyremodell, NOD /SCID mus ble først lavaged med 20 mg /kg 2-acetaminofluorene (2-AAF) eller 0,2% DMSO i en uke. Deretter 2/3 av venstre leverlapp ble kirurgisk reseksjon, og 10000 CD133
+ -celler eller CD133
– celler som ble nylig isolert fra SMMC-7721 cellelinje ved MACS ble injisert inn i milten. Milten ble resected 5 minutter etter injeksjon, og lavaged med 2-AAF eller DMSO fortsatte opp til 9 uker. Ved slutten av den niende uke, ble alle musene avlivet, xenograft tumordannelse og metastaser ble observert og lever og lunge vev ble dissekert og underkastet mikroskopisk undersøkelse [23], [24], [25].
statistisk analyse
statistisk Package of Social Sciences (versjon 18.0) (SPSS) ble brukt for statistisk analyse. Den uavhengige t-test eller ANOVA ble brukt til å sammenligne kontinuerlige variabler mellom gruppene, mens χ2 analyse ble brukt for sammenligninger av dikotome variabler.
P
verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Stjernene ble brukt til å representere statistisk signifikans av
P
verdier i noen tall, f.eks * P≤0.05, ** p≤0.01.
Resultater
CD133
+ HCC Cells Vis Høy invasiv og metastatisk potensial
In Vitro
cscs er kjent for å utvise forbedret trekkfugl og invasiv potensial. For ytterligere å undersøke metastatisk potensial for CD133
+ HCC celler
in vitro
, vi sortert SMMC-7721, SNU475, PLC /PRF /5 og primære menneskelige HCC-LY5 HCC celler basert på CD133 uttrykk ved MACS . Den CD133 ekspresjon av de sorterte cellene ble bekreftet ved Western blot (figur 1A), og de CSC-relaterte karakteristika for de isolerte celler ble analysert. Interessant, selv om CD133
+ og CD133
– celler sortert fra de SMMC-7721 og HCC-LY5 cellelinjer viste ingen signifikante forskjeller i vekst (figur 1B), den CD133
+ celler migrert og invaderte til i større grad enn CD133
– cellene i
in vitro
transwell migrasjon og matrigel invasjon analyser (figur 1C, D), noe som indikerer at CD133
+ celler er svært trekkfugl og invasiv. For å teste deres proliferativ potensial, vi sammenlignet sine kolonidannelse evner ved spredning og myke agar kolonidannelse analyser. Resultatene viste at CD133
+ celler var i stand til å initiere større og mer tallrike kolonier enn de tilsvarende CD133
– celler (figur S1, S2), noe som indikerer at CD133
+ celler utviser forbedret vekst
in vitro
. Foruten at vi også testet den selvfornyelse kapasiteten sortert CD133 celler ved spheroid formasjon analysen. I den første generasjon, CD133
+ celler var i stand til å generere større og flere kuler enn den tilsvarende CD133
– celler
in vitro
. I den andre generasjonen, hadde CD133
+ celler opprettholdt sin primære karakter (figur S3). Resultatene viste at CD133
+ cellene vise aktiv selvfornyelse kapasitet
in vitro
i grunnskolen og passage kulturer.
(A) Isolering av CD133
+ HCC celler sortert ved MACS og påvisning av CD133 uttrykk i SMMC-7721, HCC-LY5, SNU475, og PLC /PRF /5 celler ved Western blot. (B) Vekstkurver av den sorterte CD133
+ og CD133
– SMMC-7721 og HCC-LY5 celler ble oppnådd ved CCK-8-analyse. (C) Transwell migrasjon analysen av CD133
+ og CD133
– celler sortert fra SMMC-7721 og HCC-LY5 cellelinjer. (D) Transwell matrigel invasjon analysen av CD133
+ og CD133
-. Celler sortert fra de SMMC-7721 og HCC-LY5 cellelinjer
CD133
+ HCC Cells Manifest Meget Metastatisk Kjennetegn
in Vivo
Vår tidligere studie viste at CD133
+ HCC celler var utpreget tumorigent i en xenograft modell [11]. For å vurdere metastatisk potensial for CD133
+ HCC celler videre, vi etablert et orthotopic dyr transplantasjon modell. Resultatene viste at 10000 CD133
+ SMMC-7721-celler var tilstrekkelig til å indusere tumordannelse i 5/5 (100%) og intrahepatisk metastase i 2/5 (40%) NOD /SCID-mus etter 3 måneder, mens en ekvivalent antall CD133
– celler bare indusert tumordannelse i 3/5 (60%) mus og ikke induserer metastase (figur 2A, B, C). Hematoxylin-eosin (HE) farging avslørt lignende histologiske karakteristika i ortotopiske svulst transplantasjoner (figur 2D). I tillegg til ytterligere vurdere
in vivo
svulst celle homing kapasitet, som regnes som en metastatisk karakteristisk for cscs, en dyremodell av tumorceller homing ble etablert i NOD /SCID-mus. Resultatene viste at 9/9 NOD /SCID-mus inokulert med 10.000 CD133
+ HCC celler utviklet svulster og metastaser, mens færre tumorer ble funnet i leveren hos NOD /SCID-mus som ble behandlet med et tilsvarende antall CD133
– celler. Interessant, tumorer generert av CD133
+ celler vokste og dannet tumormasse på stedet av den resekterte leverlapp, noe som indikerer at CD133
+ HCC celler er svært mobil og oppviser et tumormålsøkende kapasitet (figur 2E , F), som ble bekreftet ved histopatologisk undersøkelse (figur 2G, H). Resultatene er presentert ovenfor fast indikerte at CD133
+ celler besatt en høy kapasitet for metastase
in vivo
i HCC.
(A) Representant
in vivo
bioluminesens avbildning av tumormetastaser i NOD /SCID mus etter orthotopic transplantasjon med det isolerte CD133
+ eller CD133
– SMMC-7721 celler (bildet som vises er representative for gruppen orthotopically transplantert med 10.000 celler) (n = 5 hver gruppe ). (B) Representative eksempler på NOD /SCID-mus orthotopically transplantert med CD133
+ eller CD133
– celler isolert fra SMMC-7721 HCC cellelinje. (C) ANTALL mus manifesterer seg tumorgenisitet og levermetastaser av CD133
+ SMMC-7721 celler i ortotopiske transplanterte analyser er vist i tabellen. (D) HE farging av høstes svulster bekreftet en primær HCC fenotype. (E) Representant
in vivo
bioluminescence avbildning av tumormetastaser i NOD /SCID-mus i en tumor-homing dyremodell transplantert med CD133
+ eller CD133
– celler isolert fra SMMC-7721 cellelinje (n = 9 hver gruppe). (F) Representative eksempler på levertumordannelse og metastase i 2-AAF /PHX dyremodell transplantert med CD133
+ eller CD133
– celler isolert fra den SMMC-7721 HCC cellelinje. (G) HE farging av levervev seksjoner, en svulst masse fra CD133
+ HCC celler i to-AAF /PHX dyremodell ble vist. (H) ANTALL mus manifestere levermetastaser av CD133
+ eller CD133
-. SMMC-7721 celler i tumor-homing dyremodell er vist i baren gragh
CD133
+ HCC Cells Vis Unik Gene Expression profiler
for å studere den molekylære mekanismen bak metastaser i menneskelig leverkreft, sammenlignet vi de globale genuttrykk profiler av CD133
+ HCC celler og deres CD133
– kolleger isolert fra SMMC-7721 celler ved hjelp av Affymetrix GeneChip® human Genome U133 Plus 2.0 Array. Vi identifiserte 454 vanlige differensielt uttrykte gener som viste en fold endring på mer enn 1,5. Av disse 454 genene, 312 var oppregulert og 142 ble nedregulert. De identifiserte genene ble ytterligere underkastet bioinformatiske analyse. Funksjonene til de differensielt uttrykte gener ble forbundet med celle adhesjon, migrasjon, cytoskjelettet, kjemotaktisk bevegelse og metastaser (tabell S1, S2). Blant de gener som ble forskjellig uttrykt mellom CD133
+ og CD133
– populasjoner, GPR87 ble funnet å være oppregulert med ca 8 ganger i CD133
+ celler sammenlignet med CD133
– celler. For å klargjøre hvilken rolle GPR87 i tumorvekst og metastaser av CD133
+ HCC celler, må vi først undersøkte uttrykk for GPR87 i sortert HCC cellelinjer og primære humane HCC celler ved QRT-PCR og Western blot. Vi fant at uttrykket nivåer av GPR87 i CD133
+ HCC-cellelinjer var høyere enn i deres CD133
– motparter (figur 3A, C). Vi testet deretter kapasiteten på forskjellige HCC cellelinjer og primære humane celler til å uttrykke GPR87. GPR87 ble påvist i HCC cellelinjer og primære humane HCC celler ved hjelp av Western blot-analyse, selv om i forskjellige mengder (figur 3B). For bedre å forstå funksjonen av GPR87 i HCC metastaser, må vi først etablert to stabile cellelinjer ectopically uttrykker GPR87, SMMC-7721-lenti-GPR87 og HCC-LY5-lenti-GPR87, ved hjelp av et lentivirus vektor. Vi deretter undersøkt CD133 uttrykk og CSC-relaterte egenskaper i disse stabile cellelinjer. Vi fant at overekspresjon av GPR87 i SMMC-7721 og HCC-LY5-celler resulterte i en økning i mRNA og proteinnivåene av CD133 (figur 3D, E). For bedre å forstå sammenhengen mellom CD133 og GPR87 uttrykk i HCC vev, ble immunhistokjemisk farging utført. CD133 og GPR87 uttrykk ble funnet i vevsprøver, ble uttrykket av CD133 korrelert med uttrykk for GPR87 i HCC vev (R = 0,168, P 0,05) (figur 3F, tabell S3).
(A) relative mRNA uttrykk nivåer av GPR87 og CD133 ble bestemt ved kvantitativ polymerase chain reaction i CD133
+ og CD133
– populasjoner sortert fra SMMC-7721, HCC-LY5 og mhcc-97L cellelinjer. (B) Western blot av GPR87 i HCC cellelinjer og primære humane celler. (C) Western blot av GPR87 i CD133
+ og CD133
– populasjoner sortert fra SMMC-7721, HCC-LY5, SNU475 og PLS /RFP /5 celler. (D) Protein uttrykk nivåer av GPR87 og CD133 ble bestemt ved Western blot analyse i SMMC-7721-lenti-GPR87 og HCC-LY5-lenti-GPR87 celler. (E) Den relative mRNA-ekspresjon av GPR87 og CD133 ble bestemt ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon i SMMC-7721-lenti-GPR87 og HCC-LY5-lenti-GPR87-celler. (F) Tabellen viser sammenhengen mellom CD133 og GPR87 uttrykk i HCC vev.
Overuttrykte GPR87 Up-regulerer CD133 uttrykk og CSC-relaterte egenskaper
For å bestemme effekten av GPR87 på celleproliferasjon, analyserte vi rollen som GPR87 i kolonidannelse. Som vist i figur 4A, overekspresjon av GPR87 i SMMC-7721 og HCC-LY5 celler økte kolonidannelse kapasitet sammenlignet med de tilsvarende tom vektor-infiserte celler (p 0,05). For å undersøke om overekspresjon av GPR87 kan også fremme tumorvekst og metastase
in vivo
, vi orthotopically vaksinert 2 × 10
6 SMMC-7721-lenti-GPR87 eller SMMC-7721-lenti-kontrollceller inn venstre leverlapp NOD /SCID-mus med en mikro. Brutto undersøkelse viste at 6/6 mus orthotopically inokulert med SMMC-7721-lenti-GPR87 celler utviklet svulster etter 6 uker, mens svulst utvikling ble bare påvist i 3/6 mus behandlet med et tilsvarende antall SMMC-7721-lenti-kontrollceller (Figur 4B). I tillegg, gjennomsnittlig tumorstørrelse i mus inokulert med SMMC-7721-lenti-GPR87-celler var 1,6 ganger større enn i mus inokulert med SMMC-7721-lenti-pWPXL celler.
In vitro
Transwell migrasjon og matrigel invasjon analyser viste at SMMC-7721-lenti-GPR87 og HCC-LY5-lenti-GPR87 celler migrert og invaderte i større grad enn de tomme vektor-infiserte celler (P 0,05 ) (figur 4C, D). Disse funnene tyder på at GPR87 kan opp-regulere CD133 uttrykk og fremme metastaser
in vitro Hotell og vekst
in vivo
. Selv CD133 protein nivåer i HCC vev uten intrahepatisk metastase ikke var korrelert med GPR87 uttrykk (R = 0,120, P 0,05) (tabell S4, S5), de CD133 protein nivåer i HCC vev med intrahepatisk metastase positivt korrelert med GPR87 uttrykk (R = 0,267, P 0,05) (figur 4E, F;. tabell 1), noe som tyder på at CD133 kan være oppregulert av uttrykket av GPR87 i metastatisk HCC
(A) Representative eksempler på spredningsanalyser å undersøke effekten av GPR87 overekspresjon i SMMC-7721 og HCC-LY5 celler. (B) De grove trekk ved tumorbærende NOD /SCID-mus orthotopically transplantert med 2 x 10
6 SMMC-7721-lenti-GPR87 og SMMC-7721-lenti- pWPXL celler etter 6 uker (n = 6 hver gruppe ). (C) Transwell migrasjon analysen i SMMC-7721 og HCC-LY5 celler som overuttrykker GPR87. (D) Transwell matrigel invasjon analysen i SMMC-7721 og HCC-LY5 celler som overuttrykker GPR87. (E) Immunhistokjemisk farging av GPR87 og CD133 i HCC vev med intrahepatisk metastasering. (F) Tabellen viser sammenhengen mellom CD133 og GPR87 uttrykk i HCC vev med intrahepatisk metastaser.
stanse av GPR87 hemmer CD133 uttrykk og CSC-relaterte egenskaper
Å undersøke den funksjonelle rolle av GPR87 i CD133
+ HCC celler, inhiberte vi ekspresjonen av GPR87 i PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 og Huh-7 celler ved hjelp av siRNA transfeksjon. Flowcytometrisk analyse viste at ved å stanse all GPR87 reduserte nivåer av CD133
+ celler uttrykk fra 31,4% til 24,1% og 26,7% i PLC /PRF /5 celler, fra 51,3% til 13,4% og 18,5% i Hep3B celler, fra 2,2% til 1,5% og 1,0% i SNU475 celler, men ingen forandring ble funnet i Huh-7 celler (figur 5).
In vitro
, ved å stanse all GPR87 i PLS /PRF /5 og Hep3B celler resulterte i en nedgang i mRNA og protein uttrykk for CD133 (figur S4). Videre GPR87 shRNA resulterte i redusert cellevekst (P 0,05) (figur S5). Vi testet også muligheten av celler til å invadere, migrere kapasitet etter GPR87 knockdown.
In vitro
Transwell migrasjon og matrigel invasjon analyser viste at det var en nedgang i PLS /PRF /5-shGPR87 celler enn de tomme vektor-infiserte celler (P 0,05) (figur S6). Disse dataene antyder at GPR87 spiller en viktig rolle i å regulere CD133 uttrykk.
flowcytometrisk analyse av nivåene av CD133 uttrykk i GPR87 siRNA-behandlede celler, inkludert PLC /PRF /5, Hep3B, SNU475 og Huh- 7 cellelinjer.
GPR87 medierer uttrykk av CD133 i HCC cellelinjer
som eksperimenter vist ovenfor, vi hadde bevist at knockdown av GPR87 kunne hemme uttrykket av CD133 og
in vitro
sprer seg, mens overekspresjon av GPR87 kunne fremme uttrykk for CD133 og øke tumormetastaser i HCC. For ytterligere å undersøke korrelasjonen av GPR87 og CD133 uttrykk, vi etablert stabile CD133 overekspresjon cellelinjer, SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 og mhcc-97L-lenti-CD133, ved hjelp av et lentivirus vektor, deretter undersøkt GPR87 uttrykk. Resultatene viste tydelig at overekspresjon av CD133 var ikke i stand til å opp-regulerer uttrykket av GPR87 ved QRT-PCR (figur 6A, B) og western blotting (figur 6C).
(A) Relativ mRNA uttrykk for CD133 i SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 og mhcc-97L-lenti-CD133 celler. (B) Relativ mRNA uttrykk for GPR87 i SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 og mhcc-97L-lenti-CD133 celler. (C) Western blot av GPR87 og CD133 i SMMC-7721-lenti-CD133, HCC-LY5-lenti-CD133 og mhcc-97L-lenti-CD133 celler.
Diskusjoner
Kreft er en systemisk sykdom, og metastase står for over 90% av dødelighet hos kreftpasienter [26]. I HCC, er metastase en av de mest verdifulle prognostiske faktorer og betydelig påvirker pasientens utfall [27]. Nylig har kreft stamceller (cscs) blitt identifisert som en subpopulasjon av kreftceller som er ansvarlige for tumorgenese, terapeutisk motstand, gjentakelse og metastase [28], [29], [30], [31]. Men den molekylære mekanisme av CSC metastase er fortsatt uklar. Videre utforsking av denne mekanismen kan ikke bare gi ny innsikt i HCC men også identifisere en nyttig molekylære mål for effektiv behandling av HCC.
Nylig har vi og andre har identifisert en CSC befolkningen i leverkreft preget av uttrykket av CD133. Men de detaljerte metastatiske egenskaper ved HCC celler som uttrykker CD133 fortsatt uklare. I denne studien, viser vi at CD133
+ HCC celler besitter høy invasiv og metastatisk potensial
in vitro
. I motsetning til sine CD133
– kolleger, 10000 CD133
+ SMMC-7721 celler var tilstrekkelig til å indusere orthotopic tumordannelse og intrahepatisk metastaser i NOD /SCID mus etter 3 måneder. I tillegg har vi vist at 10000 CD133
+ celler var tilstrekkelig til å indusere eksperimentell metastase ved spleenic inokulering i et tumormålsøkende dyremodell, noe som indikerer at CD133
+ -celler har tumor-homing kapasitet
in vivo
.
Nylig har økt uttrykk av CD133 blitt observert i kreftstamceller av en rekke menneskelige og mus kreft. Emerging bevis har vist at CD133 ekspresjon kan reguleres ved flere faktorer, innbefattet transformerende vekstfaktor beta 1 [32], BMP4 [33], mikroRNA-150 [2] og interferon-alfa [4]. Imidlertid har ingen naturlig ligand for CD133 ennå ikke identifisert, og lite er kjent om dens funksjon. I denne studien sammenlignet vi de globale genuttrykk profiler av CD133
+ HCC cscs og deres CD133
– kolleger isolert fra SMMC-7721 celler ved hjelp Genechip analyse og fant at uttrykket av GPR87 i CD133
+ HCC cellelinjer ble økt i forhold til at det i deres CD133
– kolleger. Dette funnet indikerer at det kan være en sammenheng mellom GPR87 og CD133 i ferd med metastaser i HCC. Imidlertid har ingen bevis bekreftet sammenhengen mellom GPR87 og CD133. Her demonstrerer vi for første gang at ved å stanse all GPR87 reduserte CD133 uttrykk nivåer. Overekspresjon av GPR87 betydelig forbedret migrasjon og invasjon av HCC celler, økt sin kolonidannelse kapasitet
in vitro Hotell og fremmet tumordannelse og vekst
in vivo
. Disse resultatene tyder på at GPR87 har en avgjørende rolle i modulerende uttrykk for CD133 og bidrar til vekst og metastasering av HCC celler.
Den molekylære mekanismen underliggende metastaser i HCC cscs krever videre studier. Vårt videre arbeid vil fokusere på å belyse mekanismen bak den GPR87-mediert regulering av CD133 i HCC cscs og definere molekylære terapeutiske mål på HCC cscs.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Colony dannelsen analysen av CD133
+/- HCC celler ved 2D kultur. Representative eksempler på spredningsanalyser av CD133
+ og CD133
– celler isolert fra SMMC-7721 og HCC-LY5 celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0061056.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Colony dannelsen analysen av CD133
+/- HCC celler i myk agar. Representative eksempler på spredningsanalyser av CD133
+ og CD133
– celler isolert fra SMMC-7721 og HCC-LY5 celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0061056.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
spheroid dannelsen analysen av CD133
+/- HCC celler
in vitro
. Representative eksempler på sfæroide formasjons analyser av CD133
+ og CD133
– celler isolert fra SMMC-7721 og HCC-LY5 celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0061056.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
