Abstract
Kreft er et stort folkehelseproblem over hele verden. I USA alene, er en i fire dødsfall på grunn av kreft og for 2013 totalt 1,660,290 nye krefttilfeller og 580,350 kreftrelaterte dødsfall anslått. Omfattende profilering av flere cancer genomer har åpenbart en meget kompleks genetisk landskap der et stort antall endrede gener, varierende fra tumor til tumor, påvirke kjerne biologiske reaksjonsveier og prosesser. Dette har implikasjoner for terapeutisk målretting av signale nettverk i utviklingen av behandlinger for spesifikke kreftformer. Den NFkB transkripsjonsfaktor er konstitutivt aktiv i en rekke hematologisk og faste tumorer, og flere signalveier er implisert i kreft er sannsynligvis forbundet med NFKB aktivering. En kritisk formidler av NFkB aktivitet er TGFB-aktivert kinase 1 (TAK1). Her identifiserer vi TAK1 som en roman samspill protein og målet for fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) tyrosin kinase aktivitet. Vi viser videre at aktiverende mutasjoner i FGFR3 assosiert med både multiple myelomer og kreft i blære kan modulere ekspresjon av gener som regulerer NFkB signalisering, og fremme både NFkB transkripsjonen aktivitet og celle-adhesjon på en måte som er avhengig av TAK1 ekspresjon i begge kreftcelletyper. Våre funn tyder på TAK1 som et potensielt terapeutisk mål for FGFR3-assosiert kreft, og andre kreftformer der TAK1 bidrar til konstituerende NFkB aktivering
Citation. Salazar L, Kashiwada T, Krejci P, Meyer AN, Casale M, Hallowell M, et al. (2014) fibroblast vekstfaktor reseptor 3 samhandler med og aktiverer TGFB-aktivert kinase en tyrosinfosforylering og NFkB signale i multippelt myelom og blærekreft. PLoS ONE 9 (1): e86470. doi: 10,1371 /journal.pone.0086470
Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences sentrum, USA
mottatt: 19 august 2013; Godkjent: 09.12.2013; Publisert: 23 januar 2014
Copyright: © 2014 Salazar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av multippelt myelom Research Foundation, Chao Family Comprehensive Cancer Center på UCI, Elsa U. Pardee Foundation, Kunnskapsdepartementet, ungdoms- og sportssjef i den tsjekkiske republikk (KONTAKT LH12004), tsjekkisk Science Foundation (P305 /11/0752). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en kompleks sykdom som følge av oppkjøpet av somatiske mutasjoner som dysregulate signalveier som er sentrale for celleproliferasjon og overlevelse, angiogenese og metastasering. Feilregulering av FGFR3 signal har vært innblandet i flere krefttyper, spesielt urothelial cellekreft (UC) og multippel myelom (MM). Uroteliale cellekreft utgjør mer enn 90% av blærekreft, som har et verdensomspennende forekomsten av over 350 000 nye årlige diagnoser og rangerer som den tredje vanligste kreftformen hos menn og den tiende mest vanlig hos kvinner i USA [1]. Overekspresjon eller aktivering mutasjon av FGFR3 er den hyppigste genetiske endringer i UC (Anmeldt i [2]). Myelomatose, en kreft av terminalt differensierte B-celler, er den nest vanligste hematologisk kreft med en American Cancer Society anslag over 22,350 nye tilfeller i 2013. Blant de tilfeller av MM med dårligst prognose er de 15% med t (4; 14) trans, som retter seg mot både FGFR3 og MMSET (Anmeldt i [3] – [5]). Nyere undersøkelser tyder på at denne trans kan være hoved klonen ved diagnose eller omvendt, bare observert ved tidspunktet for tilbakefall [6]. Men den underliggende mekanismen aggressivitet av t (4; 14) myelom er fortsatt uklart, og det relative bidraget fra FGFR3 og MMSET som mulige onkogener er kontroversielt, som 25% av t (4; 14) svulster mangler FGFR3 uttrykk. Oppkjøpet av FGFR3 aktiverende mutasjoner (5-10% av t (4; 14) tilfeller) med sykdomsprogresjon indikerer en rolle for FGFR3 MM patogenesen, og tidlige studier demonstrere onkogene potensialet aktivert mutant FGFR3 [4]. Det ble også mer nylig vist at villtype FGFR3, slik det er uttrykt i de fleste FGFR3-positive t (4; 14) tumorer, kan bidra til en B-celle onkogenese [7]. Videre er en mengde prekliniske data viser effektiviteten av reseptor-tyrosin-kinase-inhibitorer og nøytraliserende antistoff mot MM-celler som uttrykker FGFR3-aktiverende mutasjoner og villtype-reseptor (oversikt i [3] – [5]). Tilsvarende kan hemming av FGFR3 indusere cellesyklus arrest og /eller apoptose i UC [8], [9] både
in vitro Hotell og
in vivo
, som gir bekreftelse på at FGFR3 og nedstrøms signalveier representerer potensielt relevante terapeutiske mål for behandling av FGFR3-assosierte kreftformer.
FGFR3 er en av fire tyrosin-kinase-reseptorer som medierer effektene av FGF på diverse cellulære prosesser, inkludert proliferasjon, differensiering og migrering. Reseptoraktivering utløser signaltransduksjonsveiene innblandet i onkogenese, herunder Ras /ERK /MAPK, PLCγ /PKC, PI3K, og STAT trasé [10]. Nyere bevis indikerer at FGF-reseptor signal kan også aktivere NFkB [11], [12], er avvikende aktivert som ofte observeres i human kreft [13], [14] og tett korrelerer med kreftmerkene [15]. En viktig mellomprodukt i NFkB signalering, TGFfi-aktivert kinase 1 (TAK1), funksjoner nedstrøms av flere signalveier, regulerer celleoverlevelse, differensiering og betennelsesreaksjoner [16], og står som et sentralt IKK-kinase av den kanoniske NFkB veien [ ,,,0],17]. Kjemisk og genetisk hemming av TAK1 fremmer apoptose i hudkreft [18] og en undergruppe av tykktarm kreft [19], samt avtagende chemoresistance i bryst og tykktarm kreft celler [20] og chemoresistance og NFkB aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler i kultur [ ,,,0],21]. Videre undertrykkelse av TAK1 signale reduserer NFkB aktivering i menneske hodet og nakke plateepitelkarsinom cellelinjer [22], ovarian carcinoma celler [23], og brystkreftcellelinjer [24], og blokkerer brystkreft celle adhesjon, invasjon og metastasering in vitro [25]. TAK1 er ikke undersøkt i sammenheng med MM eller blærekreft; men det er nedstrøms mål, NFkB, har dukket opp som en av de mest potente driverne av tumorigenesis i MM, med så mange som 82% av MM prøver uttrykker signatur aktiverings molekyler [26], [27]. I samsvar med denne nøkkelen onkogene rolle, flere legemidler som er effektive mot MM, inkludert bortezomib, thalidomid og lenalidomid, blokk aktivering av NFkB (anmeldt i [28]). I UC, undertrykkelse av NFkB aktivitet forsterker de apoptotiske virkninger av kjemoterapeutika og cytokiner [29], [30].
Ved hjelp av en kombinasjon av gjær to-hybrid og microarray genetisk screening kombinert med systemer pathway analyse identifiserer vi TAK1 som en roman Interactor og målet for FGFR3 tyrosin kinase aktivitet. Vi viser videre en rolle for TAK1 som en positiv regulator av NFkB-aktivitet nedstrøms av FGFR3 i både multippel myelom og urothelial karsinom, to typer kreft med demonstreres FGFR3 engasjement [10], [31], med modulerende effekter på celle-adhesjon.
Metoder
Cell Kultur og Transfeksjon
FGFR3-negative (RPMI-8226) og villtype (LP1) human MM cellelinjer ble hentet fra den tyske samlingen av mikroorganismer og cellekulturer [DSMZ; Braunschweig, Tyskland]; FGFR3 mutant MM celler (KMS-11; Y373C) stammer fra en MM pasient og etablerte i Kawasaki Medical School [32], ble sjenerøst gitt av Dr. P Leif Bergsagel. Mutant FGFR3 blærekreft cellelinje, MGHU3 (Y375C), en slags gave fra Dr. Margaret Knowles (University of Leeds, Leeds, UK), ble avledet fra en klasse en svulst [33]. MM og UC-celler ble holdt i RPMI 1640 (Hyclone, Thermo Scientific, Rockford, IL) og HeLa og HEK293-celler (ATCC) i DMEM (Hyclone), begge media supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). Transient transfeksjon av HeLa og HEK293 celler ble oppnådd ved hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Grand Island, NY) i henhold til produsentens protokoll og MM og UC transfekterte linjer ved hjelp av Neon system (Life Technologies). Etter produsentens prosedyre, 1 × 10
6 UC eller 2 × 10
6 MM celler ble suspendert i 100 ul suspensjon inneholdende 5 mikrogram siRNA (Dharmacon) eller plasmid og pulset under program 3 for UC og program 15 ( KMS-11) eller 20 (RPMI-8226) for MM celler.
antistoffer og reagenser
FGFR3 antistoff (B-9, C-15) og FGFR1 /2/4-antistoffer var fra Santa Cruz Bioteknologi, Inc. (Santa Cruz, California). Antistoffer mot TAK1, ERK, fosfo-ERK, fosfo-tyrosin (4G10), p65 og p84 var fra Millipore (Billerica, Massachusetts), som var normal kanin IgG. Rekombinant humant FGF1 ble hentet fra R Abnova, Taipei City, Taiwan) som et substrat. Det rekombinante aktiv FGFR3 intracellulære domenet (397-End, SignalChem, Richmond, CA) ble brukt på 300 ng per reaksjon
Microarray Prosedyrer og analyse
Celler ble transfektert med 5 mikrogram ikke-målsøkende. eller TAK1-spesifikke siRNA og fikk komme seg over natten. Neste dag, forble celler ubehandlet eller mottatt 100 nM PD173074 i 48 timer før RNA isolering. Hver behandling ble fremstilt som triplikate prøver. Total RNA ble behandlet som anbefalt av Affymetrix, Inc. korthet RNA ble isolert ved hjelp TRIzol (Life Technologies) og passerte gjennom RNeasy spin kolonner (Qiagen, Valencia, CA) for videre rydde opp. UCI DNA microarray kjernen Facility deretter kvantifisert total RNA av Nanodrop (Thermo Scientific) og testet for renhet ved hjelp av Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Ambion WT uttrykket kit (Life Technologies) ble anvendt for å fremstille RNA prøver for hel transkriptomet microarray analyse. To ug av det merkede, fragmenterte enkelt-trådet cDNA ble deretter hybridisert til probe setter på et menneskelig AffymetrixGeneChip 1.0ST array. Arrays ble skannet med Genechip Scanner 3000 7 G og kommandokonsollen Software v. 3.2.3. Resultatene er tilgjengelig gjennom Gene Expression Omnibus (GEO) repository (tiltredelse antall GSE52452)
Data ble importert til Partek Genomics Suite versjon 6.6 programvare med følgende operasjoner som gjøres for å forberede data for statistisk analyse. 1) RMA Bakgrunn Korreksjon, 2) quantile Normalisering, 3) Logg base 2 transformasjon, og 4) oppsummering av Probe sett ved hjelp av gjennomsnittsverdi. Statistisk analyse besto av enveis ANOVA med en enkelt kategorisk variabel, og genet listene ble generert for de gener med fold-endring magnitude 2 og p-verdi med en falsk funnrate (FDR). 0,05
Gene listene ble deretter importert til Oppfinnsomhet Systems Pathway Analysis (IPA) programvare, som har funksjoner for å generere genet nettverk, sortering gener i ulike funksjonelle og andre kategorier, og for overliggende genene på kjente signalveier, farging av ganger endring eller noen annen verdi.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble isolert fra MGHU3 og KMS-11 celler ved hjelp TRIzol (Life Technologies) og passerte gjennom RNeasy spin kolonner (Qiagen) for ytterligere rydde opp. Random-primet cDNA syntese ble utført på en mikrogram total RNA bruker Superscript III RT Kit (Life Technologies). Alle primerpar ble intron-spenner og en nei RT kontroll ble inkludert. Primerpar var som følger: Actin reversere AGGTGTGGTGCCAGATTTTC og videre GGCATGGGTCAGAAGGATT, GAPDH reversere GCCAGTGGACTCCACGAC og frem CAACTACATGGTTTACATG, DFNA5
reversere
CAGGTTCAGCTTGACCTTCC og
fremover
ACCAATTTCCGAGTCCAGTG, GSTA1 reversere CCGTGCATTGAAGTAGTGGA og frem ACGGTGACAGCGTTTAACAA, PSCA reversere GTTCTTCTTGCCCACGTAGT og frem CAGGTGAGCAACGAGGAC, BAMBI reversere GAAGTCAGCTCCTGCACCTT og videre TGCACGATGTTCTCTCTCCT, TNFAIP3 reversere CGCTGTTTTCCTGCCATTTC og videre GATAGAAATCCCCGTCCAAGG, SGK1 reversere TGTCAGCAGTCTGGAAAGAGAAGT og videre CGGAATGTTCTGTTGAAGAATGTG.
NFkB Luciferase Assay
Celler ble transfektert med 5 mikrogram ikke-målretting eller TAK1 -spesifikke sirnas. Tjuefire timer senere ble cellene transfektert med NF-kB-Luc og PRL-TK kontroll
Renilla
i forholdet 3:01 og fikk lov til å komme seg i 24 timer. Hvor angitt, ble cellene samtidig transfektert med de indikerte FGFR3 plasmider. Cellene ble deretter serumsultede over natten, etterfulgt av en 8-timers behandling med 40 ng /ml FGF1. Luciferase-aktivitet ble detektert ved bruk av en dual-luciferase reporter-analyse (Promega: Madison, WI). Forskjeller i NFkB aktivitet følgende TAK1 støydempere under hver behandling tilstand ble statistisk analysert ved hjelp av en uparet tosidige t-test.
Cell Fraksjone
MGHU3 celler ble transfektert med 5 mikrogram ikke-målretting eller TAK1 -spesifikke sirnas. Førti-åtte timer senere ble cellene serumsultede over natten, deretter behandlet med 40 ng /ml FGF1 for 0, 5 eller 60 minutter. Cellene ble samlet inn så fraksjonert ved hjelp av en protokoll tilpasset fra [41].
celleadhesjonsanalyse
celler ble transfektert med 5 mikrogram ikke-målretting eller TAK1 spesifikke siRNA og lov til å komme seg over natten. Den neste dag, forble ubehandlet celler eller mottatt 50 nM PD173074 i 48 timer før utplating av adhesjonsanalysen. Celler behandlet med FGF1 var serum-sultet natten over og behandlet med ligand 1 time før pletteringen og under hele analysen. Adhesjons-analyser ble utført 72 timer etter transfeksjon. Kort sagt ble seks og nitti-brønners plater belagt over natten ved 4 ° C med 1 ug /ml kollagen IV, blokkert med 1% BSA i 1 time ved 37 ° C, og vasket to ganger med PBS og en gang med serumfritt medium. Celler ble samlet opp og sådd ut ved 5 x 10
4 på de på forhånd belagte plater i nærvær av behandlingen er angitt. Celler ble tillatt å holde seg i 3 timer ved 37 ° C, ble brønnene vasket 3 ganger med PBS for å fjerne ikke-adherente celler, og man følger bestemt etter 4 timers inkubasjon med Calcein-AM (Life Technologies) ved å måle fluorescensintensiteten ved Ex /Em 490 /520 nm. Statistisk analyse av forskjeller i mobilnettet vedheft følgende TAK1 støydempere under hver behandling betingelse ble utført ved hjelp av en uparet tosidige t-test.
Resultater
FGFR3 samhandler med TAK1
identifisering av protein interaksjoner kan gi viktig informasjon om spesifikke signalveier og identifisere nye potensielle terapeutiske mål. I MM, den spesifikke rollen ectopically uttrykt FGFR3 i en undergruppe av tilfellene fortsatt kontroversielt, mens i blærekreft, FGFR3 har nylig blitt brukt som en viktig drivkraft for spredning [42]. Vi tok en systematisk tilnærming til å få en bedre forståelse av FGFR3 signalering i forbundet kreft gjennom identifisering av nye FGFR3 protein interaksjoner med en gjær to hybrid (Y2H) analyse. Det cytoplasmatiske domene av humant FGFR3 (aminosyrer 399-806), inneholdende villtype-sekvensen eller den sterkt aktiverende K650E mutasjon, ble anvendt som agn for å screene et primært humant cDNA-bibliotek kondrocytt (fig. 1A) som beskrevet [37]. Dette biblioteket ble valgt som FGFR3 er sterkt uttrykt i kondrocytter, og den sterkt aktiverende K650E mutasjon, til stede i en undergruppe av både MM og UC [43], er til stede i det intracellulære tyrosinkinase domene. Potensielle interaksjoner ble identifisert ved filteret heis β-galaktosidase-assay, sekvensert, og på nytt testet for interaksjon i gjær. Blant de interaksjoner identifisert var signal transduksjon proteiner, inkludert P85 regulatorisk subenhet av PI3-kinase [37], og TAK1. Gjæren bytte plasmid besto av de C-terminale 138 aminosyrer av TAK1 (aminosyrer 441-579) indikerer at denne regionen av TAK1 er involvert i binding FGFR3. Vi har videre fastslått ved hjelp av Y2H FGFR3 domenekonstruksjoner (fig. 1A) som den region som omfatter den andre halvdel av tyrosinkinasedomene av FGFR3, som inneholder aktiverings løkke av reseptoren og C-terminal tail of FGFR3 (aminosyrer 589-806) er tilstrekkelig for de FGFR3-TAK1 interaksjon. For å bekrefte FGFR3-TAK1 interaksjon i pattedyrceller og, spesielt, FGFR3-assosiert cancercellelinjer, humane FGFR3 konstruksjoner, deriblant villtype, kinase-død og konstitutivt aktive (K650E) sekvenser, ble transient uttrykt i HeLa-celler. TAK1 co-immunopresipitert med alle FGFR3 sekvenser testet; som viser at FGFR3 og TAK1 samhandle i pattedyrceller, og at reseptoraktivering ikke er nødvendig (figur 1B). Endogen FGFR3 i to t (4; 14) MM cellelinjer, LP-1 (vekt) og KMS-11 (Y373C) [44], [45], også interaksjon med TAK1 ved ko-immunutfelling (figur 1C). Som vi observerte FGFR3 nivåene var betydelig lavere i MGHU3 enn MM linjer, FGFR3
WT ble overexpressed for tilstrekkelig påvisning av en TAK1-FGFR3 samhandling i MGHU3 (figur 1D). Merk at MGHU3 UC cellene bære samme FGFR3 mutasjon som KMS-11 mm celler. En FGFR3-TAK1 interaksjon ble også vurdert i RT-112 UC celler som uttrykker en avkortet villtype FGFR3 (aminosyrer 1-758) i fusjon med trans syre kveilet spiral 3 (TACC3) sekvenser (rester 433-838) [46 ]. Vi var i stand til å overbevisende detektere interaksjonen i denne linje, noe som ytterligere støtter betydningen av FGFR3 C-terminale sekvenser i samspillet med TAK1 (data ikke vist). Til slutt har vi også benyttet massespektrometri for å karakterisere proteiner utvinnes i TAK1 immunutfelninger. Etter ekspresjon av både aktivert FGFR3-K650E og TAK1 i HEK293-celler, TAK1 immunopresipitatene ble analysert ved hjelp av immobilisert metall affinitetskromatografi /nano-væskekromatografi /elektrospray ionisering-massespektrometri (IMAC /nano-LC /ESI-MS) [38], [39 ]. I tre uavhengige utvalg, i tillegg til betydelig dekning av TAKI som forventet, FGFR3-deriverte peptider som representerer 48% dekning samlet ble entydig identifisert, som presentert i tabell 1. Sammen er disse resultatene gir bevis for en roman samspill mellom FGFR3 og TAK1 som gjør ikke krever aktivering av reseptoren. Det er presedens for dette med FRS2 adapter, som samhandler med FGF-reseptorer konstitutivt, men aktiveres bare nedstrøms signal (ERK /MAPK) ved reseptor aktivering [47]. Vi viser at FGFR1, to og fire forbigående uttrykt i HEK293 celler videre, også samhandle med TAK1 (figur 1E), noe som tyder på at samhandlingen er bredt relevant for FGF reseptor signalisering.
FGFR3 kan Tyrosin phosphorylate TAK1
in vitro
TAK1 aktivering krever Ser /Thr fosforylering på flere rester i aktivering loop (anmeldt i [48], [49]). Selv om tyrosinfosforylering av TAK1 ikke tidligere er blitt rapportert, FGFR3 fungerer som en tyrosinkinase; Derfor vurderte vi muligheten for at FGFR3 kanskje tyrosin phosphorylate TAK1. Faktisk fant vi at TAK1 ble tyrosin fosforylert i HEK293 celler forbigående uttrykker konstitutivt aktiv FGFR3 (K650E), men ikke kinase-døde reseptor (K508M), noe som indikerer at aktivert FGFR3 kan enten direkte eller indirekte tyrosin phosphorylate TAK1 (figur 2A). TAK1 tyrosin-fosforylering ble videre observert i et cellefritt assay-kinase ved anvendelse av rekombinant TAK1 og kinase-aktive intracellulære domenet av FGFR3, noe som indikerer at TAK1 kan være et direkte mål for FGFR3 tyrosin-kinase-aktivitet (figur 2B).
(A) HEK293 celler transfektert med FGFR3
K508M eller FGFR3
K650E. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene lysert og TAK1 immunopresipitert fra 1 mg total lysat. Immunutfelninger ble løst ved SDS-PAGE, strøket, og analysert med 4G10 antistoff. Pil viser TAK1. Representative for seks eksperimenter. (B) Et cellefritt kinase-analyse ble utført ved anvendelse av rekombinant human TAK1 har et substrat for rekombinant human FGFR3 (tyrosinkinase-domene). Tyrosin-fosforylering ble visualisert ved immunoblotting med 4G10 antistoff. Representant for fire eksperimenter.
Gene Expression Analysis Identifiserer NFkB som signal Hub for FGFR3 og TAK1 Integration
TAK1 er en viktig formidler av signalkaskader som fører til aktivering av NFkB og AP -1 transkripsjonsfaktorer, hvor hver modulerer ekspresjonen av gener som er involvert i onkogenese og apoptose (gjennomgått i [16], [50]). For å begynne å undersøke integrering av TAK1 og FGFR3 signalering i kreftceller, utførte vi et sammenlignende mikroarray analyse av genekspresjon i MGHU3 blærecancercellelinje som uttrykker FGFR3 Y375C aktiverende mutasjon og oppviser sterke responser til FGF-reseptor-spesifikke PD173074 inhibitor som vurdert av ERK-fosforylering [9]. For å identifisere gener som er avhengig av både FGFR3 og TAK1 signaler, ble MGHU3-celler transfektert med ikke-målretting eller TAK1-spesifikke siRNA, og hvert delsett behandlet videre med PD173074, eller bærerkontroll. En måte ANOVA med ganger endring magnitude 2 og p-verdi med FDR 0,05 ble brukt til å generere genet lister. TAK1 siRNA versus ikke-targeting siRNA prøvene ga 39 gen endringer som gjenspeiler TAK1 spesifikke gener i nærvær av FGFR3 signalering. TAK1 siRNA pluss PD173074 versus ikke-targeting siRNA pluss PD173074 prøver ga 105 genet endringer som gjenspeiler TAK1 spesifikke gener i fravær av FGFR3 signalering. For å skjelne endringer som er avhengig av både FGFR3 og TAK1, gener som viser statistisk signifikante gen endringer som følger av TAK1 knockdown bare i nærvær av FGFR3 aliserte, men ikke i dets fravær ble valgt. Overlappende gener fra settet av 105 TAK1 gen forandringer i fravær av FGFR3 signale ble fjernet fra de 39 TAK1 genet endringer i nærvær av FGFR3 aktivitet. De 13 unike gener som forble som vesentlig endret i disse forholdene representerer gener som reflekterer både TAK1 og FGFR3 signale (tabell 2).
Vi valgte 6 gener fra listen over 13 for validering basert på deres relevans i kreft, og fant at de observerte forandringene var reproduserbar av qPCR, både i MGHU3 og KMS-11 MM linje behandlet med TAK1 knockdown og /eller FGF-reseptor-inhibering, som beskrevet ovenfor for microarray analyse (tabell 2). Det eneste unntaket er GSTA1, som har meget lave nivåer av ekspresjon i mm celler. Til slutt, input av en liste over de 13 gener inn oppfinnsomhet Systems Pathway analyseverktøyet (IPA) resulterte i et enkelt gen-nettverk (nettverks ballen 40) med en større knutepunkt rundt NFkB (figur 3). Disse resultatene tyder på en kritisk skjæringspunktet mellom FGFR3 og TAK1 signale som kan påvirke NFkB aktivering og dermed kreft patogenesen i FGFR3-assosiert kreft. En annen hub fokusert rundt PI3K er i tråd med våre tidligere resultater som viser et samspill mellom FGFR3 og P85 regulatorisk subenhet av PI3K [37].
13 unike FGFR3 og TAK1 avhengige gener (tabell 1) ble evaluert av oppfinnsomhet pathway Analysis (IPA) programvare, som produserer et enkelt nettverk (nettverks score på 40) som inneholder knutepunkter på NFkB og PI3K. IPA molekylære former inkluderer: kompleks /gruppe (NFkB, PI3K), cytokin /vekstfaktor (IKBKG, SGK1), enzym (ACSL1, GSTA1, MGAT4A, PDXP, TNFAIP3, UBC), ion-kanal (SCNNIG), transcriptional regulator (TEAD1, VGLL1), transporter (SLC6A8, SLC15A1, SLC15A2, SLC38A3) og andre (ARRB1, BAMBI, DFNA5, FSH, GST klasse A, HDGFRP2, Ins1, Insulin, MT2A, PKC (s), PSCA, RPAIN, TRIM31, ZFAND5) . IPA Relasjoner: heltrukne linjer indikerer direkte interaksjon; stiplede linjene indikerer indirekte interaksjon; fylte piler indikerer «virker på»; åpne piler indikerer «translocates til»; – | indikerer «hemmer» og – | ▸ indikerer «opptrer på og hemmer. Grønn /rød indikerer gener ned /oppregulert i microarray (tabell 1).
Aktivert FGFR3 Positively Regulerer NFkB aktivitet gjennom TAK1
Aktivering av NFkB bidrar til MM patogenesen, styrke vekst, overlevelse, og metastase (oversikt i [28]), og også fremmer overlevelse av blærecancerceller [29], [30]. Basert på den potensielle betydning av NFkB-aktivitet og genekspresjon profilering resultat som implisere NFkB signalering som et mål for den FGFR3 og TAK1 interaksjon, evaluerte vi den kombinerte bidrag FGFR3 og TAK1 til NFkB-aktivitet i kreftceller ved anvendelse av en NFkB-luciferase reporter-analyse. Som vist i innledende vurdering av MM linjer (figur 4A), uttrykk for konstitutivt aktive FGFR3 mutanter dramatisk økt NFkB transkripsjonen aktivitet. For å avgjøre om TAK1 er nødvendig for NFkB aktivering av FGFR3, ble siRNA knockdown av TAK1 evaluert i MM og UC linjer som uttrykker endogen FGFR3. I alle linjer, enten som uttrykker villtype eller mutant FGFR3, vi observert betydelig redusert NFKB aktivering følgende knockdown av TAK1 (figur 4 B, C). Tilsetning av ligand forsterkes denne virkning på MGHU3 celler, sannsynligvis ved å aktivere andre FGF-reseptorer [42]. Som et siste test av NFKB aktivering, ble nukleær lokalisering av den aktive p65-subenheten av NFkB evaluert. MGHU3 celler ble testet og viste en økning i kjernefysisk p65 på FGF1 ligand behandling, og nivåene av kjernefysisk p65 ble redusert på TAK1 knockdown, noe som er konsistent med NFkB luciferasepreparater data (Figur 4D). Spesielt, er TAK1 ikke nødvendig for de store FGFR3-responsive MAPK signalveien, som dokumentert av manglende evne TAK1 knockdown å endre ERK fosforylering av FGFR3 (figur 4E).
