Abstract
Aberrant aktivering og mutasjonsstatus av proteiner i phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /Akt /mammalian target av rapamycin (mTOR) og mitogen aktivert proteinkinase (MAPK) signalveier har vært knyttet til tumorgenese i forskjellige tumorer inkludert urothelial karsinom (UC). Imidlertid, anti-tumorterapi med lavmolekylære inhibitorer mot mTOR viste seg å være mindre vellykket enn forventet. Vi karakteriserte molekylære mekanisme av denne veien i urothelial karsinom ved å interferere med ulike molekylære komponenter ved hjelp av små kjemiske inhibitorer og siRNA teknologi og analysert virkninger på molekylaktiveringsstatusen, cellevekst, proliferasjon og apoptose. I et flertall av testede cellelinjer ble observert konstitutiv aktivering av PI3K. Manipulering av mTOR eller Akt uttrykk eller aktivitet bare regulert fosforylering av S6K1 men ikke 4E-BP1. I stedet gir vi bevis for en alternativ mTOR selvstendig men PI3K avhengig regulering av 4E-BP1. Bare samtidig hemmer utskillelsen av både S6K1 og 4E-BP1 trykt cellevekst effektivt. Crosstalk mellom PI3K og MAPK signalveien medieres via PI3K og indirekte ved S6K1 aktivitet. Hemming av MEK1 /2 resultater i aktiveringen av Akt men ikke mTOR /S6K1 eller 4E-BP1. Våre data tyder på at 4E-BP1 er en potensiell ny målmolekyl og stratifisering markør for anti kreftbehandling i UC og støtte behandlingen av en multi-targeting tilnærming mot PI3K, mTORC1 /2 og MAPK
Citation. Nawroth R, Stellwagen F, Schulz WA, Stoehr R, Hartmann A, Krause BJ, et al. (2011) S6K1 og 4E-BP1 Er Uavhengig regulert og kontroll Cellular Vekst i blærekreft. PLoS ONE 6 (11): e27509. doi: 10,1371 /journal.pone.0027509
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 03.08.2011; Godkjent: 18 oktober 2011; Publisert: 15.11.2011
Copyright: © 2011 Nawroth et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av Siegfried Gruber Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den femte vanligste kreftformen på verdensbasis med anslagsvis 357.000 nye tilfeller og 145.000 dødsfall i 2010 [1]. Urothelial karsinom (UC) som representerer 90% av alle blæretumorer er en heterogen enhet som består av papillærtumorer og faste invasive karsinomer som krever radikal behandling når de har kommet inn i det muskulære laget av blæren. Hvis ubehandlet, vil om lag 85% av pasientene med invasiv blære svulst dør av sykdommen progresjon innen to år fra diagnose [2]. Radikal cystektomi med bekken lymfeknute disseksjon er standard vare for muskel-invasiv blærekreft. Med denne tilnærmingen 5-års progresjonsfri overlevelse sjansene for 65-68% kan oppnås på tvers av alle kreft stadier [3], [4]. Til tross for fremskritt i cisplatin-basert kjemoterapi for pasienter med metastatisk sykdom, er median samlet 5-års overlevelse tid begrenset til 14-15 måneder [5]. Således nye terapeutiske tilnærminger er svært ønskelig. Bedre kunnskap om avvikende aktivering av cellesignalveier som er involvert i tumordannelse i blæren kan gi passende molekylære mål for nye terapier [6], [7], [8]. En slik reaksjonsvei er den PI3K /Akt /mTOR-signalreaksjonsveien som har vært knyttet til tumorgenese i mange vev [9], [10].
normalt, ved aktivering av tyrosin-reseptor-kinaser eller ras-proteiner PI3K konverterer phosphatidylinositol- 4,5-bisfosfat (PIP
2) inn phosphatidylinsositol-3,4,5-trisphosphate (PIP
3). Denne reaksjonen kan reverseres ved PI3K antagonist PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10). PIP
3 satte PDK1 (protein avhengig kinase 1) til cellemembranen hvor det binder og fosforylerer Akt ved aminosyrerest T308. Akt er ansett som den mest kritiske signalnode i denne reaksjonsvei regulere forskjellige substrater som påvirker cellulære prosesser som er involvert i kontrollen av cellevekst og overlevelse [11]. Akt signal konvergerer gjennom tuberous sklerose proteiner 1/2 (TSC1 /2) og den lille GTPase rheb på mTOR, et serin /treonin kinase som danner to distinkte proteinkomplekser med enten raptor (regulatorisk-assosiert protein av mTOR) noe som ga mTORC1 eller rictor (rapamycin ufølsom følgesvenn av mTOR) givende mTORC2 [10]. mTORC2 kan aktiveres av PI3K direkte og fosforylerer Akt ved S473, som sammen med fosforylering ved T308 resulterer i full aktivering av Akt [12], [13]. Akt fosforylert ved S473 har vært assosiert med dårlig prognose i mange kreftformer, inkludert de i bukspyttkjertel, lever, prostata og bryst [13]. De best definerte substrater av mTORC1 er de kinaser p70S6K1 (S6K1) og eIF4E-bindende protein 1 (4E-BP1), som begge er viktige for kontroll av protein translasjonsinitiering [14], [15], [16]. Defosforylert 4E-BP1 kan binde seg til den elF4E proteinkomplekset for å hindre at hetten avhengig oversettelse og spiller en viktig rolle i mediering signale hendelser av PI3K og MAPK reaksjonsveien i tumorer [15]. Fosforylert S6K1 kreves for oversettelse av 5 «terminal oligopyrimidine (øverst) mRNA. Defosforylering av S6K1 resulterer i en tilbakekoblingssløyfe som fører til oppregulering av reseptor-tyrosin-kinaser eller insulinreseptoren substrat-proteiner (IRS), som deretter aktiverer PI3K og også den MAPK signalveien [17], [18]. Krysstale mellom PI3K og MAPK signaleringsnett forekommer også i form av RAS og ERK1 /2, aktivere PI3K og i tillegg mTORC1 gjennom TSC1 /2 [19], [20], [21], [22].
mTORC1 kan selektivt inhiberes av rapamycin, et makrolid antibiotikum, som i et kompleks med den cytosolprotein FKBP12 inhiberer mTORC1 og ved høyere konsentrasjoner også mTORC2 [23], [24]. Nye mTOR-hemmere i klinisk bruk som everolimus (RAD001) eller temsirolimus (CCI-779) er derivater av rapamycin. Administreres som anti-svulst narkotika, responsraten hos pasienter avvike fra 0-30% avhengig av svulsten [25]. Det er mistanke om at den store begrensningen i klinisk anvendelse av mTOR-hemmere resultater fra mTORC1-S6K1-PI3K feedback loop. Dette resulterte i utviklingen av inhibitorer som retter seg mot begge, PI3K og mTOR, som NVP-BEZ235 et imidazo [4,5-c] kinolinderivat [24].
I UC, genetiske endringer i PI3K veien er vanlig og forekommer hovedsakelig i PIK3CA, PTEN, Akt eller TSC1 /2 [26]. PTEN slettinger og mutasjoner samt redusert protein uttrykk er funnet spesielt på høyere kreftstadier og karakterer. Fosforylert S6K1 er en uavhengig prediktor for sykdomsspesifikk overlevelse [27], [28]. I prekliniske studier med UC-cellelinjer, PI3K hemming av LY294002 oppviste avhengig av den anvendte cellelinjen minimal til 40% reduksjon av proliferative effekter og blokkerte celle invasjon [29], [30], [31]. Rekonstituering av PTEN undertrykket tumorvekst og genetisk stanse av Akt resulterte i økt radiosensitiviteten av tumorceller [27], [32]. Den potensielle anvendelse av rapamycinderivater i UC terapi ble støttet ved deres evne til å redusere cellenes levedyktighet i forskjellige blærecancercellelinjer utvunnet og i en musemodell for progressiv blærekreft hvori p53 og PTEN slettes i blæren urothelium [9], [33], [34], [35], [36]. Til tross for slike lovende prekliniske observasjoner, foreløpige resultater fra en enkelt-arm, fase II studie med everolimus som monoterapi viste bare beskjeden antitumor aktivitet hos pasienter med metastatisk UC [37]. Data om funksjonell rolle og molekylære mekanismen av PI3K /Akt /mTOR og MAPK signalveier i UC er svært begrenset til dato og kan ikke forklare kliniske resultater. Således, karakterisert vi den molekylære mekanisme av PI3K /AKT /mTOR-signalreaksjonsveien og dets tverr regulering med MAPK-reaksjonsveien in vitro i cellelinjer som bærer mutasjoner typiske for UC. Funksjonelle konsekvenser på cellesignale arrangementer og cellevekst ble studert etter farmakologisk eller genetisk innblanding med ulike molekylære komponenter av denne veien via små molekyl hemmere eller siRNA /shRNA oligonukleotider. Våre funn gir ny innsikt i den molekylære nettverk av signalveier undersøkt som resulterer i en begrunnelse for nye behandlingsstrategier og foreslår kandidat proteiner for molekylær stratifisering for pasienter som lider av metastatisk UC.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
cellelinjer RT4, HT1376, 647V, 486P, J82, 253J, EJ28, T24 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) og RT112 (tysk Innsamling av mikroorganismer og celle~~POS=TRUNC) ble holdt ved 37 ° C i RPMI 1640 eller DMEM supplementert med 10% FCS i en fuktig atmosfære inneholdende 5% eller 7,5% CO
2. NVP-BEZ235 og RAD001 ble vennlig levert av Novartis Pharma. U0126 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology og LY294002 fra Promega. Stamløsninger ble fremstilt i DMSO. Arbeidsløsninger ble nylaget i cellekulturmedium ved avbildet konsentrasjoner.
konstruerer, transfeksjon og infeksjon
siRNA oligonukleotider mot 4E-BP1, S6K1 og kontroll ble designet av og kjøpt fra Qiagen GmbH og Akt 1, -2, -3 stealth siRNA oligonukleotider fra Invitrogen. Forbigående transfections ble utført ved hjelp av X-treme genet transfeksjon eller lipofectamin reagent (Roche Diagnostics, Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner, ved hjelp av to mikrogram /siRNA /6-brønnen. For trippel transfeksjon adenovirus mTOR shRNA og kontroll shRNA ble kjøpt fra SIRION Biotech. 1,5 x 10
5-celler ble sådd ut på 6-brønners plater en dag før infeksjon og adenovirus partikler ble tilsatt ved en multiplisitet for infeksjon på 30. Undertrykkelse av protein-ekspresjon ble analysert ved hjelp av immunoblot 2-6 dager etter transfeksjon eller infeksjon.
Immunoblotting og antistoffer
Cellene ble lysert i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, protease-inhibitor cocktail (Roche Diagnostics ), fosfatase-inhibitor Mix (Serva) i 20 min på is. Uoppløselig materiale ble pelletert ved sentrifugering i 30 minutter ved 4 ° C, ble 30 000 g. protein~~POS=TRUNC konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP kvantifisert med BCA ™ proteinanalyse (Pierce). Like mengder protein var . kastet SDS-PAGE på 7,5 til 12% polyakrylamidgeler og overført til PVDF membran (Zefa) for immunoblotting, de antistoffer som brukes inkludert: Akt (C67E7), akt1, akt2, akt3, Phospho-Akt (Ser473), Phospho-Akt (Thr308), GSK3p, Phospho-GSK3p (Ser9), mTOR, Phospho-mTOR (Ser2448), 4E-BP1, Phospho-4E-BP1 (Thr37 /46), S6K1, Phospho-S6K1 (Thr389), S6RP, fosfo S6RP, P44 /42 MAPK, Phospho-P44 /42 MAPK, c-Raf, Phospho-c-Raf (Ser338) (Cell Melde Technologies). Sekundære HRPO konjugerte antistoffer ble kjøpt fra Dianova. Immunoblotting ble utført som beskrevet tidligere eller endret i henhold til produsentens anbefaling [38]. ECL-reaksjonen ble visualisert ved hjelp av Hyper ECL autoradiografi filmer (GE Healthcare). For kvantifisering ble chemiluminescence signal analysert via ChemiDoc ™ XRS og Antall one® programvare fra Bio-Rad Laboratories, Inc.
Cell vekst
For å evaluere cellevekst, celler ble sådd i 1000 celler /96-brønners og behandlet som beskrevet. Etter høsting ble cellene farget med trypane blå og levende celler ble talt i en Neubauer kammer.
Celleproliferering
Celleproliferering ble målt 24 timer etter behandling av celler med RAD001, NVP-BEZ235 og U0126 eller 48-72 timer etter transfeksjon /infeksjon med siRNAs /shRNAs. Bromdeoksyuridin (BrdU) inkorporering for påvisning av nylig syntetisert DNA og 7-amino-actinomycin D (7-AAD) farging for påvisning av dobbeltkjedet DNA ble utført ved anvendelse av en APC BrdU Flow Kit (BD Biosciences) av pulserende celler i to timer ifølge produsentens protokoll fulgt av strømningscytometri-analyse.
Apoptose assay
Apoptose ble påvist ved å måle aktiviteten av caspase 3/7 hjelp av caspase-Glo 3/7 assay fra Promega GmbH, ifølge produsentens protokoll.
Celleviabilitet
Celler ble behandlet med RAD001, NVP-BEZ235 og U0126 i 96-brønners plater. Ved 36 timer ble cellene inkubert i 3 timer med XTT. Den enzymatiske reaksjon ble analysert ved 450 og 650 nm i en ELISA-leser.
Statistisk analyse
Student T-test ble anvendt for å sammenligne de midler i forskjellige grupper. Statistiske beregninger ble gjort ved hjelp av Microsoft Office Excel.
Resultater
Expression og aktivering status for PI3K /Akt /mTOR sti i urothelial kreft cellelinjer
Vi analyserte uttrykk og aktivering status av molekylære nøkkelkomponenter i PI3K bane i et panel av 9 UC avledede cellelinjer. Cellene ble høstet og lysert for proteinanalyse i et subsammenflytende stadium. Uttrykk av Akt, mTOR, S6K1, S6RP, 4E-BP1 og PTEN ble påvist i alle cellelinjer (figur 1A). Fosforylering av Akt på T308 og S473 og mTOR, 4E-BP1, S6K1 og S6RP ble observert i 7 av 9 cellelinjer. Ingen aktivering av Akt kunne påvises i RT4 og 647V celler. I disse to cellelinjene mTOR, S6K1 og S6RP fosforylering ble betydelig redusert, mens 4E-BP1 var fortsatt fosforylert i RT4 celler. Således er de fleste av de undersøkte cellelinjer oppviste et konstitutivt aktivert PI3K /Akt /mTOR-signalreaksjonsveien. Uttrykk av PTEN hindrer ikke denne aktiveringen under vekstforhold undersøkt. For ytterligere eksperimenter vi bestemte oss for å jobbe med de to UC cellelinjer RT112 (overekspresjon FGFR3) og T24 (onkogene H-Ras, homozygot PTEN mutasjon), begge stiller ofte funnet genomisk endringer i blærekreft [39], [40], [41 ]
A:. for protein-analyse ble celler lysert i RIPA buffer påført på SDS-PAGE og overført til PVDF-membran. Fosforylering og ekspresjon status av proteiner ble analysert i immunoblot. B, C: Cellelinjer ble behandlet i 1 time med de indikerte konsentrasjoner av RAD001 og NVP-BEZ235. Kontrollen (0) inneholdt like konsentrasjoner av DMSO som i prøver med kjemiske forbindelser. En representant resultat fra 3 uavhengige forsøk er vist. D: Den inhibitoriske konsentrasjon på 50% (IC50) ble bestemt for målproteiner av PI3K og mTORC1. Chemiluminescence signaler ble kvantifisert ved hjelp av ChemiDoc bildesystem (BioRad Laboratories) og normalisert til protein uttrykk nivå. Gjennomsnittsverdiene fra tre eller flere uavhengige forsøk er vist
RAD001 /CCI-779 og NVP-BEZ235 blokk PI3K og mTOR nedstrøms mål på en doseavhengig måte -. MTORC1 uavhengig regulering av 4E-BP1
for å karakterisere den funksjonelle relevansen av denne veien i UC vi brukte rapamycinderivater RAD001 og CCI-779 og PI3K-hemmer NVP-BEZ235. Siden effekten av CCI-779 og RAD001 behandling var identiske vi bare skildre RAD001 resultater. Først ble dose-responsanalyser utført for å vurdere aktiviteten av RAD001 og NVP-BEZ235 1 t etter cellulær behandling. Aktiviteten av forbindelsene ble karakterisert ved fosforylering mønster av S6K1 /S6RP /4E-BP1 for begge stoffer, og i tillegg for Akt ved bruk av NVP-BEZ235. Signalintensiteter ble målt ved kjemiluminescens et bildebehandlingssystem og hemmende konsentrasjoner på 50% (IC50) for fosforylering nivå normalisert til proteinnivået ble beregnet (figur 1 B, D). RAD001 hemmet fosforylering av S6K1 og S6RP men ikke fra 4E-BP1 (figur 1B). Ved å eksponere cellene til NVP-BEZ235, inhibering av S6K1 /S6RP ble observert ved lavere IC50-konsentrasjoner enn de som er nødvendige for inhibering av Akt-fosforylering ved T308 /S473 (figur 1C, D). 4E-BP1 fosforylering ble sterkt redusert ved konsentrasjoner som korrelerte med de nødvendige for Akt hemming. Dermed hemming av mTORC1 av rapamycinderivater regulert bare S6K1 /S6RP fosforylering mens hemming av PI3K og mTORC1 /2 hemmet både S6K1 og 4E-BP1 /S6RP fosforylering. T24 celler reagerte på lignende konsentrasjon til RAD001 behandling som RT112 men 3 ganger så følsom for NVP-BEZ235 behandling.
Langtidsbehandling med RAD001 og NVP-BEZ235 resultater i S6K1 mediert hyperaktive av PI3K /Akt
det er blitt beskrevet at S6K1 aktivering resulterer i en negativ tilbakekoblingssløyfe som regulerer ikke bare PI3K-aktivitet som sannsynligvis er ansvarlig for den begrensede suksess for rapamycinderivater i klinisk anvendelse [17]. Således adressert vi virkningen av forbindelsene som anvendes i denne tilbakekoblingssløyfe. Vi brukte tre forskjellige konsentrasjoner av RAD001 og NVP-BEZ235 som resulterte i omtrent 50% til 100% inhibering av deres molekylære mål og analysert effekter på PI3K-signalreaksjonsveien aktivering over en periode på 72 timer. RAD001 behandling resulterte i S6K1 defosforylering og indusert hyperfosforylering av Akt på T308 og S473 i en konsentrasjonsavhengig måte gjennom hele observasjonsperioden (1-72 t) i RT112 celler mens i T24 celler Akt hyperaktive ble indusert bare 24-72 timer etter behandling (Figur 1B /C, 2A, data for 72 h ikke vist). Aktiveringsstatusen til den Akt nedstrøms mål GSK3p-β korrelert med graden av fosforylering Akt i begge cellelinjer (figur 2A). 4E-BP1 fosforylering eller proteinnivå ble ikke påvirket av RAD001 behandling. Ved bruk av NVP-BEZ235 den innledende defosforylering av Akt 1 time etter behandling reversert etter 24 timer og til og med konsentrasjoner 100 ganger over IC50 var ikke tilstrekkelig til å forhindre fosforylering på T308 og bare delvis på S473 (figur 2B). Svarende til aktiveringsstatusen til Akt, ble det observert fosforylering av Akt substratet GSK3p-β. Spesielt, gjentatt behandling med nylagde NVP-BEZ235 en time før høsting av cellene ikke hindre dette hyperaktive av Akt (data ikke vist). Fosforylering av 4E-BP1 forble undertrykt gjennom hele observasjonsperioden (figur 2C)
A, B. Effekt av RAD001 eller NVP-BEZ235 behandling over 24 timer på fosforylering nivå av Akt, S6K1, 4E-BP1 og gsk3 -β i RT112 og T24 celler. Helcellelysater ble påført SDS-PAGE og blottet på PVDF-membraner, etterfulgt av immunoblot å påvise ekspresjon og fosforylering nivå av avbildet proteiner. Kontrollen (0) inneholdt samme konsentrasjon av DMSO som i prøver med kjemiske forbindelser. C: RT112 celler ble transfektert med to uavhengige S6K1 bestemt siRNA oligonukleotider og en tilfeldig siRNA oligonukleotid som kontroll (CTR siRNA). Tre dager etter transfeksjon, uttrykk og fosforylering nivå S6K1, Akt og gsk3-β ble analysert i immunoblotter.
Enten S6K1 direkte indusert PI3K /Akt aktivitet ble løst ved å stanse S6K1 uttrykk ved hjelp av to spesifikke sirnas rettet mot S6K1. To dager etter transfeksjon, western blot analyser viste en 90-96% reduksjon i S6K1 proteinnivå (figur 2C). Den nedregulering av S6K1 uttrykk korrelert med hyperfosforylering av Akt på S473 og T308 og gsk3-β, støtter den beskrevne S6K1-PI3K /Akt feedback loop.
Hemming av PI3K /mTOR men verken stanse av mTOR heller Akt uttrykk regulerer 4E-BP1 fosforylering
resultatene bedt oss om å karakterisere signal krets av PI3K, mTOR, Akt og 4E-BP1 i større detalj. I de fleste foreslåtte modellene, S6K1 og 4E-BP1 er nedstrøms mål for Akt og mTORC1 og fosforylering i de fleste rapportene er samtidig regulert [14], [15]. Våre resultater viser at bare UC celler behandlet med NVP-BEZ235 men ikke RAD001 utstilt undertrykkelse av både S6K1 og 4E-BP1 fosforylering som tyder på at 4E-BP1 er regulert annerledes enn S6K1. Siden NVP-BEZ235 er rettet mot medlemmer av PI3K protein familien, kanskje PI3K eller nedstrøms mål Akt eller mTOR være involvert i regulering 4E-BP1 fosforylering. Vi testet først om vi kunne bekrefte effekten av NVP-BEZ235 ved hjelp av grundig preget kinase inhibitor LY293002 som opprinnelig var utformet som en bestemt PI3K hemmer, men viser også aktivitet mot andre PI3K ikke-relaterte kinaser [42], [43]. S6K1 fosforylering ble redusert med en IC50 på 3 nM, mens IC50 doblet til 7 nM for å indusere en reduksjon i Akt (S473 /T308) og 4E-BP1 fosforylering, og således ligner kinetikken av NVP-BEZ235 aktivitet på Akt /4E-BP1 fosforylering (figur 3A og 1B)
A:. Dose respons analysen med celler behandlet 24 timer med PI3K inhibitor LY294002. Cellelysater ble analysert i immunoblot som viser doseavhengige effekter på ekspresjon og fosforylering nivå av Akt, S6K1 og 4E-BP1 i RT112 celler. B: stanse av mTOR uttrykk 3 dager etter infeksjon med adenovirus mTOR shRNA eller kontroll shRNA (CTR shRNA). Hele cellelysater ble analysert i immunoblotter for fosforylering og uttrykk nivå av S6K1, S6RP, Akt og 4E-BP1. C: Akt uttrykk regulerer fosforylering av S6K1 men ikke 4E-BP1. Transfektere celler med bestemte stealth siRNA oligonukleotider eller kontrollere siRNA forstummet uttrykk for alle tre isoformer av Akt. 3 dager etter transfeksjon ble cellene lysert påført på SDS-PAGE blottet på PVDF-membran og ekspresjonsnivå av Akt-isoformene og uttrykk og fosforylering nivå av 4E-BP1 og S6K1 ble analysert.
For ytterligere å undersøke denne observasjonen, brukte vi et adenovirus shRNA tilnærming til taushet mTOR protein uttrykk som skal resultere i konkrete inaktivering av begge, mTORC1 og mTORC2 protein komplekser. To dager etter smitte, analyser western blot bekreftet en 85-96% knockdown i mTOR protein nivå som holdt seg stabilt i 5 dager (Figur 3B). Knockdown resulterte i defosforylering av S6K1 og S6RP uten å påvirke protein uttrykk nivå. Bare mindre effekt på 4E-BP1 fosforylering forhold til 4E-BP1 proteinnivå ble oppdaget. Spesielt ble Akt fosforylering redusert med 40-60% på T308 og S473 rester.
Sist, påvirkning av Akt på 4E-BP1 fosforylering ble karakterisert ved hjelp sirnas rettet mot de tre forskjellige isoformer av Akt. Tre dager etter transfeksjon, kombinert slå ned på alle tre isoformer resulterte i 90% redusert proteinuttrykk av alle tre Akt isoformer (Figur 3C). Bare S6K1 fosforylering men ikke 4E-BP1 fosforylering nivå ble redusert uten å påvirke proteinnivå som indikerer at 4E-BP1 motsetning S6K1 er ikke nedstrøms Akt i de undersøkte cellelinjer.
Høring mellom PI3K og MAPK signalveien skjer på flere trinn
Gitt betydningen av PI3K og MAPK sti biologi, undersøkte vi samspillet mellom de to baner i blærekreft. Cellene ble behandlet med RAD001, NVP-BEZ235 eller med MEK1 /2-hemmer U0126 og aktiveringsstatusen til viktige proteiner i begge veier 1-72 timer etter behandling ble analysert i vestlige blotter. Hemming av mTORC1 av RAD001 indusert aktivering av ERK1 /2 fosforylering 24-72 timer etter behandling (figur 4A, øvre panel). Den samme effekten ble observert da stanse S6K1 protein uttrykk som resulterte i økt Raf1 /ERK1 /2 fosforylering (figur 4B). Imidlertid hemming av både PI3K og mTOR av NVP-BEZ235 hurtig indusert ERK1 /2 fosforylering i hele observerte tidsrom på 1-72 h (figur 4A, nedre panel). Vi konkluderer med at undertrykkelse av PI3K /Akt /mTOR-aktivitet vanligvis resulterer i aktivering av Raf /MEK /ERK-signalveien, men kinetikken i prosessen, avhenger av hvilken molekylære mål i det tidligere reaksjonsveien er sperret
A.: RT112 og T24-celler ble behandlet med RAD001 eller NVP-BEZ235 i 1 time eller 24 timer. Ekspresjon og fosforylering status av ERK1 /2 ble analysert i immunoblot på helcellelysater. B: To dager etter transfeksjon med siRNA oligonukleotider mot S6K1 eller kontroll siRNA (CTR siRNA) ble cellene lysert og fosforylering og uttrykk status av Raf og ERK1 /2 ble analysert i immunoblotter. C: Cellene ble behandlet i 24 timer med RAD001, NVP-BEZ235 og U0126 alene eller i kombinasjon, og effekter på uttrykk og fosforylering nivå av Akt, S6K1 og ERK1 /2 ble analysert i immunoblotter
. deretter analysert de biokjemiske konsekvensene når hemme både PI3K /AKT /mTOR og MAPK veien, ved hjelp RAD001, NVP-BEZ235 eller U0126 i kombinasjon eller U0126 alene. Når cellene ble behandlet med U0126 alene, ble ERK1 /2 fosforylering fullstendig opphevet mens Akt fosforylering på S473 og T308 ble oppregulert (figur 4C). Interessant, vi kunne ikke påvise noen endringer i S6K1 fosforylering. Når man kombinerer U0126 med enten RAD001 eller NVP-BEZ235 ble Akt hyperfosforylering betydelig økt sammenlignet med behandling med enten enkelt stoff i T24 celler.
PI3K /AKT /mTOR og MAPK signaliserer regulerer celleproliferasjon, levedyktighet og apoptose
Neste vi bestemt hvordan manipulering av PI3K og MAPK signale påvirkninger celleproliferasjon i UC. Først ble cellene behandlet med RAD001, NVP-BEZ235 og U0126 alene eller i kombinasjon, og celleproliferasjon ble overvåket over tid. Tre dager etter behandling, RAD001 hemmet celleproliferasjon med 62% i RT112 og 40% i T24-celler i forhold til løsningsmidlet kontroll (figur 5A). Behandling med NVP-BEZ235 fullstendig hemmet celleproliferasjon i RT112 celler og redusert det med 66% i T24-celler. U0126 behandling hemmet spredning med 70% og 76% i RT112 eller T24 celler, henholdsvis. Ved å kombinere RAD001 eller NVP-BEZ235 med U0126, ga additive effekter, med en kombinasjon av NVP-BEZ235 /U0126 å være mest effektive (figur 5A). For å karakterisere disse effektene i mer detalj, ble cellesyklusanalyse målt ved å kombinere inkorporering av BrdU og 7-AAD flekker, den apoptotisk respons ved å måle kaspase-aktivitet og levedyktighet /metabolisme av XTT-analyser. Som for cellesyklusanalyse, RAD001 behandling redusert fraksjonen av celler som gjennomgår S-fase med 11% i begge cellelinjer (figur 5B). NVP-BEZ235 redusert S-fase celler med 84% i RT112 og med 22% i T24, mens U0126 reduserte celler i S-fasen med 97% i T24, men bare med 52% i RT112 celler. Kombinasjonen av PI3K og MAPK signale inhibitorer hadde additive effekter på celleproliferasjon med kombinasjonen av NVP-BEZ235 /U0126 å være mest effektiv til å redusere antall celler i S-fase med 94-98%. Alle stoffer som induserte en økning i celler arrestert i G1 fase som korrelert til nedgangen i celler som påbegynner S-fasen, noe som indikerer at inhibering av enten spredningsveier fører til G1 arrest i UC-cellelinjer (figur 5B). Apoptose ble målt ved kaspase-aktivitet (figur 5C) [11]. Både RAD001 og NVP-BEZ235 behandling redusert caspaseaktivering i RT112 celler ved 32-45%. I T24 celler, RAD001 og NVP-BEZ235 redusert caspase aktivitet ved 43-48%. U0126 hadde ingen signifikant effekt på caspase aktivitet og økte ikke aktiviteten til RAD001 eller NVP-BEZ235 når kombinert sammen. For måling av cellenes levedyktighet, ble samme antall celler analysert ved anvendelse av en XTT-assay. Avhengig av den cellulære bakgrunn, observerte vi en reduksjon på 30-50% med RAD001 og 70-85% med NVP-BEZ235 (figur 5D). Interessant, vi kunne ikke finne additive effekter av den kombinerte hemming av PI3K /Akt /mTOR og MAPK veier. Vi konkluderer med at PI3K /mTOR og MAPK veien aktivitet i UC kontroll celle proliferasjon, apoptose og celle vitalitet og at begge veier kan delvis erstatte tap av hverandre med hensyn til spredning.
RT112 og T24-celler ble behandlet med RAD001 (5 nM), NVP-BEZ235 (100 nM for T24, 500 nM for RT112) og U0126 (25 nM) alene eller indikert kombinasjon og en DMSO-kontroll (CTR). A: For celletall ble cellene farget med trypan blå og antall levende celler ble bestemt. B: Cellesyklus analyse etter 24 timer behandling med kjemiske forbindelser etter BrdU innlemmelse i kombinasjon med 7-AAD farging. C: Måling av kaspase 3/7 aktivitet som en parameter for apoptose og D: XTT-test for påvisning av cellelevedyktigheten utført 24 timer etter behandling. Verdiene som vises, er den midlere ± standardavvik fra 3 uavhengige eksperimenter. Student t-test ble utført for statistisk analyse. (*: P 0,05)
Den samlede aktiviteten S6K1 og 4E-BP1 regulere celleproliferasjon i urothelial karsinom
Til slutt vi tok opp spørsmålet hvorfor NVP-BEZ235 påvirker cellevekst mer effektivt å enn RAD001. Vi viste at NVP-BEZ235 motsetning RAD001 påvirker begge, S6K1 og 4E-BP1 fosforylering. Derfor brukte vi enten siRNA oligonukleotider rettet mot S6K1 eller 4E-BP1 eller kombinert RAD001 med 4E-BP1 sirnas å etterligne den antatte ekstra effekten av NVP-BEZ235. To dager etter transfeksjon sirnas mot 4E-BP1 eller S6K1 redusert protein uttrykk med 80-96% (Figur 6A, 2C). Celler dempede for S6K1 eller 4E-BP1 ekspresjon oppviste vesentlig redusert celleproliferasjon med 40% (RT112) til 60% (T24) sammenlignet med kontroller (fig. 6B), noe som ga sammenlignbare effekter til de som ble observert etter behandling everolimus (figur 5A). Men kombinasjonen av 4E-BP1 siRNA og everolimus behandling redusert cellevekst med 80-85%, i samme grad som observert med NVP-BEZ235. Analyse av celleproliferasjon, viste at effekten ble igjen formidlet av cellesyklusarrest i G1 /G0 fase (data ikke vist). I sammendraget, både mTORC1 nedstrøms målet S6K1 og 4E-BP1 er til en lignende grad involvert i regulering UC celleproliferasjon ved å kontrollere cellecyklusprogresjonen fra G1 /0 til S-fasen og celleviabilitet
A:. To dager etter transfeksjon med sirnas mot 4E-BP-1, protein uttrykk i RT112 og T24 celler ble oppdaget i immunoblotter. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. B: Vekst av levende celler, forstummet for S6K1 eller 4E-BP1 uttrykk eller celler forstummet for 4E-BP1 uttrykk og inkubert med everolimus (RAD001) ble overvåket over tid. Gjennomsnittsverdier ± standardavvik er vist; statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av student t-test. (*: p 0,05)
Diskusjoner
Til tross for en bedre forståelse av blærekreft biologi innenfor de siste årene, bare mindre forbedringer i den terapeutiske behandling av denne sykdommen har blitt oppnådd i løpet av de siste to tiårene. De PI3K /Akt /mTOR og MAPK signalveier er utsatt for mutasjoner og avvikende aktivering i denne svulsten enhet, og kan gi passende mål for mer effektiv behandling [44]. Følgelig preget vi begge signalveier i forhold til aktiveringsstatusen, molekylære mekanismen og relevans for cellulær proliferasjon i UC. Vi kunne bekrefte tidligere beskrevet regulatoriske kretser som styrer aktivering av disse banene. Våre data sterkt en ny mekanisme som styrer aktivering av nedstrøms element 4E-BP1 innenfor denne signalnettverk.
