Abstract
Bakgrunn
Glykogen syntasekinase 3 beta (GSK3p) er sentralt involvert i ulike cellulære prosesser, herunder spredning og apoptose. Denne studien hadde som mål å undersøke påvirkning av GSK3p uttrykk på prognosen for human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) og effekter av GSK3p hemming i NSCLC cellelinjer.
Metoder
Immunhistokjemisk og Western blot analyser ble anvendt for å evaluere GSK3P ekspresjonsnivået i humane NSCLC vev. Lentiviral RNA interferens ble utført for å hemme ekspresjonen av GSK3P i A549, H292, H1299 og SK-MES-1-cellelinjer. Celle overlevelse, ble apoptose og motilitet evalueres
in vivo Hotell og
in vitro
.
Resultater
Nivåene av GSK3p var større hos NSCLC vev (n = 211) enn hos kontroll vev (n = 194) (
P
0,001). Den 5-års oppfølging analyse viste at positiv GSK3p uttrykk var indikasjon på dårlig prognose (
P
= 0,006). Videre knockdown av GSK3P i NSCLC-cellelinjer trykkes celleproliferasjon, arrestert tumorceller i G0 /G1 fase, apoptose og celle redusert motilitet. En xenograft modell viste at deregulering av GSK3P dempes tumorgenese, som bekreftet ved redusert celleproliferasjon basert på Ki-67 og betydelig øket apoptotisk celledød. Inhiberingen av GSK3P hadde inkonsistente virkninger på ekspresjonen av β-catenin, avhengig av hvilken celletype undersøkt.
Konklusjon
Aberrant ekspresjon av GSK3P tjener som en markør uavhengig av dårlig prognose for NSCLC. Inhiberingen av GSK3P undertrykket tumordannelse ved å dempe celleproliferasjon, økt apoptose og cellebegrensende motilitet. Disse resultatene identifisere GSK3p som en svulst promoter og en potensiell terapeutisk mål i NSCLC
Citation. Zeng J, Liu D, Qiu Z, Huang Y, Chen B, Wang L, et al. (2014) GSK3p Overuttrykte Indikerer dårlig prognose og dens Hemming Reduserer celleproliferasjon og Survival of ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 9 (3): e91231. doi: 10,1371 /journal.pone.0091231
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 11 september 2013; Godkjent: 10 februar 2014; Publisert: 11 mars 2014
Copyright: © 2014 Zeng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Science Foundation Nature of China (81201851 til Dan liu og 81641028 til Weimin Li). Nettstedet til Natur Science Foundation of China National er https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft har vært den ledende årsak til verden kreftrelaterte dødsfall i flere tiår [1]. I Kina har antall lunge krefttilfeller og dødsfall relatert til lungekreft øker med økende sigarett misbruk og forurensning [2]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som hovedsakelig omfatter adenokarsinom og plateepitelkarsinom, står for nesten 85% av lungekrefttilfellene. Selv om nye terapeutiske tilnærminger har blitt innført, er de fleste pasientene fortsatt diagnostisert på avanserte stadier, og 5-års overlevelse er fortsatt mindre enn 15% [1]. For å forbedre resultatet og livskvalitet for pasienter med NSCLC, har mange nyere studier fokusert på å finne nye terapeutiske mål og identifisere biomarkører for å lette individualisert behandling [3].
Glykogen syntasekinase 3 beta (GSK3p) er en multifunksjonelle serin /treonin proteinkinase som opprinnelig ble isolert fra kaninskjelettmuskel [4]. Under hvilebetingelser, er GSK3P konstitutivt aktiv på grunn av tyrosin-fosforylering 216, og det fosforylerer og inhiberer en mangfoldig gruppe av pro-onkogene underlag, som β-catenin, cyclin D1, c-Jun, c-Myc og CREB. I sin tur, fosforylering av serin-9 inaktiverer GSK3P [5] – [7]. Basert på disse funksjonene, er GSK3P en potensiell tumor suppressor, og inaktivering av GSK3P har blitt rapportert i mange kreftceller [8], [9]. Imidlertid har mange undersøkelser vist at GSK3P kan positivt regulere proliferasjon og apoptose av tumorceller [10] – [18]. I tillegg har studier vist at inhibering av GSK3p-demper overlevelse og proliferasjon, og induserer apoptose i forskjellige typer kreft, for eksempel kreft i bukspyttkjertelen [11], kolorektal kreft [12], [15] og blærekreft [18]. Imidlertid er forskjellig rolle GSK3P i forskjellige krefttyper [19], og den nøyaktige rolle av GSK3P i NSCLC er fortsatt uklar.
I denne studien vi utforsket ekspresjonen av GSK3P i humane NSCLC-vev og dets prognostisk betydning. I H292, H1299, SK MES-1-og A549 NSCLC-cellelinjer, ble GSK3p-ekspresjon inhibert ved liten hårnål RNA (shRNA) overføres ved lentiviral vektor. Stabile knockdown cellelinjer ble verifisert og brukes i videre forskning. Tumorgenese, proliferasjon, apoptose og cellemigrering ble også vurdert både
in vivo
og
in vitro
, og resultatene viste at avvikende ekspresjon av GSK3P tjente som en selvstendig indikator på dårlig prognose for NSCLC. Videre er inhiberingen av GSK3P av RNA-støy dempes tumorigenesis ved å dempe celleproliferasjon, økt apoptose og undertrykke celle invasjon. Sammen utgjør disse funnene identifisere GSK3p som en svulst promoter og en potensiell terapeutisk mål for NSCLC.
Materialer og metoder
1. Pasienter og vev oppsamlings
Kirurgisk resekterte NSCLC vev (n = 211) og prøver av normal lunge hosliggende til tumor vev (n = 194) ble oppnådd fra West Kina Hospital, Sichuan University. Ingen av pasientene hadde blitt behandlet med en hvilken som helst preoperativ kjemoterapi eller radioterapi. Oppfølging informasjon var tilgjengelig for 160 tilfeller. De patologiske etapper ble bestemt i henhold til International Union Against Cancer (UICC) tumor-node-metastaser (TNM) klassifiseringssystem for ondartede svulster. For ytterligere å utforske, ble omfanget av differensiering og histologisk typen bestemmes ifølge Verdens helseorganisasjon klassifisering for NSCLC. Etter kirurgisk reseksjon, alle pasientene fikk standardbehandling i henhold til de 2004 NCCN Clinical Practice retningslinjer i Oncology for NSCLC. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient, og Institutional Review Board godkjenning av denne studien ble hentet fra West Kina Hospital, Sichuan University.
2. Stabil genet stanse ved hjelp av små interfererende RNA formidlet av lentiviral vektor
Den menneskelige lunge NSCLC cellelinjer A549, H292, H1299 og SK-MES-1, som ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC), ble dyrket i henhold til de ATCC protokoller
Sekvenser (GAAGAAAGATGAGGTCTAT) rettet mot GSK3p (GenBank tiltredelse: NM_002093). som ble laget ved hjelp av BLOCK-iT RNA interferens (RNAi) Designer (Invitrogen, Carlsbad, California) ble valgt. En sekvens som ikke er relatert til den GSK3p-genet (TTCTCCGAACGTGTCACGT) er utformet som en negativ kontroll (NC) [20]. Den pGCSIL-GFP lentiviral vektor ble kjøpt fra GeneChem og NeuronBiotech Corp (Shanghai, Kina). Grønt fluorescerende protein (GFP) ble anvendt som markør for å observere og sortere de transfekterte tumorceller med fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Virkningene av RNA-interferens ble bestemt ved RT-PCR (ved 5
th dager etter transfeksjon) og Western blotting (ved 7
th dager etter transfeksjon). Deretter ble NSCLC cellelinjer med stabil og vedvarende GSK3p genet slå ned innhentet for videre
in vivo Kjøpe og
in vitro
studier. Cellene infisert med lentivirus som leverte sekvensen målretting gsk3 ble navngitt som slå ned gruppen (KD gruppe). Tilsvarende ble celler som inneholder lentivirus-leverte NC sekvensen navngitt som NC gruppe; og disse tumorceller har ikke infisert med lentivirus ble anvendt som en normal kontroll og navngitt som kontrollgruppen (CON gruppe).
3. Tumorigenesis i xenopodet mus
Nude mus (BALB /c-nu /nu, n = 6 for hver gruppe, like mange menn og kvinner, 6-8 uker gamle) ble levert av Forsøksdyr Center of Sichuan Universitet. Musene ble huset i laminære strømnings skap under spesifikke patogenfrie forhold og matet ad libitum. Alle studier med mus ble gjennomført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr. Godkjenning for denne studien ble gitt av Institutional Animal Care og behandling Committee of Sichuan University.
Etter behandling med ulike virus, eksponentielt voksende A549 celler ble subkutant injisert i ryggen av Balb /c nakne mus (1 × 10
6 /ml hver gang). De tumorvolumer ble bestemt etter 3 dager i henhold til den følgende formel: tumorvolum (mm
3) = d
2 x D x 0,52. Fire uker etter tumor-implantering ble musene avlivet smertefritt. Deres organer ble undersøkt for grov tegn på anatomiske forandringer.
4. Celleproliferasjon analyser
Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Rockville, USA) ble brukt for å vurdere celleproliferasjon i henhold til produsentens protokoll. Tumorceller (2 x 10
3 per brønn) ble sådd ut i 96-brønners kulturplater og behandlet med 10% FBS og inkubert ved 37 ° C. Den optiske tetthet ved 450 nm ble målt ved 24, 48, 72, 96 og 120 timer etter transfeksjon virus. Dataene som vises er representative for 3 uavhengige forsøk og er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik
5. Cellesyklusanalyse
sytti-to timer etter transfeksjon, ble cellesyklus data innhentet ved å analysere av PI-farget celler ved hjelp av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) med en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA ). For hver prøve, minst 3 × 10
5 celler ble talt opp, og dataene ble analysert med BD Cellquest programvare. Dataene som vises er representative for 3 uavhengige forsøk og er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik
6. Apoptose analyse
Kreftceller (ca. 5 × 10
5) ble farget med 5 mL av Annexin V-APC og 7AAD (KeyGen, Nanjing, Kina) ved romtemperatur og deretter analysert ved flowcytometri innen 1 h. Den Annexin V (+) /7AAD (-). Cellene ble betraktet som apoptotiske celler
TUNEL-metoden (In Situ celledød Detection Kit AP, Roche, Sveits) ble anvendt for å bestemme nivået av apoptose i xenograft tumorvev. Apoptotiske celler ble påvist ved å bruke alkalisk fosfatase og farget i rødt. For hver tumor ble apoptotiske celler i 5 tilfeldige høy effekt felt telles, og hastigheten av apoptose ble beregnet med følgende formel:
Apoptose hastighet = antall av apoptotiske celler /totalt antall tumor celler tellet x 100 %.
7. RNA-ekstraksjon og real-time PCR
De primere for menneskelig GSK3p var 5′-ATTTCCAGGGGATAGTGGTGT-3 «(fornuft) og 5′-TCCTGACGAATCCTTAGTCCAAG-3′ (antisense); og de for GAPDH var 5»-CCATCACCATCTTCCAGG-3 «(sense) og 5′- ATGAGTCCTTCCACGATAC -3» (antisens). De primere og prober ble kjøpt fra GeneChem, Shanghai, Kina. De mRNA uttrykk nivåene ble kvantifisert i tre eksemplarer av real-time RT-PCR ved hjelp av en 2720 termosykler (Applied Biosystems, Foster City, California). De relative nivåene av mål-transkripter ble kvantifisert ved bruk av to (-Delta Delta-Ct) metoden [21] og normalisert til nivået av menneskelige GAPDH-transkripter.
8. Cell invasjonen assay
Cell Invasion Assay Kit (ECM550, Chemicon, California, USA) ble brukt for å vurdere celle invasivitet. Etter transfeksjon virus, en alikvot av den fremstilte cellesuspensjonen (300 pl, 1,0 x 10
6 celler /ml) ble tilsatt til hver øvre innsatsen. Etter 48 timers inkubering, ble innsatsene dyppet i fargeløsning i 20 minutter for å farge de invaderende celler på membranen. Deretter ble de invaderende cellene i 5 tilfeldige utsikt mikroskop telles. Dataene som vises er representative for 3 uavhengige forsøk og er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik
9. Western blotting-analyse
Totalt proteiner ble hentet fra NSCLC tumorvev og transfektert dyrkede celler og deretter betegnes med en protein utvinning kit (keygen, Nanjing, Kina) og BCA Protein Assay Reagent (Thermo vitenskapelig, Rockford, USA) . Proteinene ble separert ved SDS-PAGE og visualisert ved immunoblotting med antistoffer som er spesifikke for GSK3p (# 9315, fortynnet 1: 400) og β-catenin (# 9582, fortynnet 1: 200) (Cell Signaling Technology, Beverly, USA). Etter eksponering for en kjemiluminescerende HRP-substrat (Millipore, Billerica, USA), ble målet proteiner oppdaget ved hjelp av et ChemiDoc XRS system (Bio-Rad, Philadelphia, USA), og bildene ble analysert med Gel-Pro Analyzer 4.0 programvare (Media Kybernetikk ).
10. Immunhistokjemisk analyse
GSK3P i NSCLC-tumorvev og de tilstøtende normale vev ble immunhistokjemisk farget som beskrevet i vår tidligere studier [22] – [24]. Semikvantitativ evaluering av delene ble utført ved 2 patologer på en blindet måte. Den negative kontroll for farging ble gjennomført uten primært antistoff. Både fraksjon og intensiteten av De immuntumorceller ble vurdert. Fraksjonen poengsum ble beregnet som gjennomsnittet av 5 tilfeldig utvalgte høy effekt felt vurderes ved lysmikroskopi som følger: 0, ingen farget målceller (tumor, bronkial eller alveolære celler); 1, 20% av celler farget; 2, 20~50% av celler farget; og 3, over 50% av cellene farget. Intensiteten resultatet ble definert som følger: 0, ingen merkbar farging av målcellene; 1, knapt påvisbar farging i cytoplasma og /eller kjernen av målcellene; 2, lett synlig brune flekker; og 3, mørk brune flekker. Fraksjonen og intensitetspoeng ble multiplisert for å gi en total poengsum mellom 0 og 9. Poeng mellom to og ni ble ansett som positivt uttrykk. Immunhistokjemiske analyser ble også utført på histologiske snitt av parafininnstøpte xenograft tumorer.
Farging av den proliferative markør Ki-67 ble utført for å vurdere veksten av xenograft tumorer. Ki-67 antistoffet (# MA1-80199, fortynnet 1: 100) ble hentet fra Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA. Ki-67-merkeindeksen (Ki-67 LI) ble beregnet i henhold til følgende formel:
Ki-67 LI = antall Ki-67 positive celler /totalt antall tumor celler tellet x 100%
11. Statistisk analyse
SPSS 17.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) ble brukt for alle dataanalyse. De immunhistokjemi resultater og deres foreninger med kliniske kjennetegn ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. Spearmans rank test ble brukt til å analysere sammenhengen mellom protein fenotyper. Kaplan-Meier metoden ble brukt til å analysere univariat overlevelse, og sammenligninger av overlevelse distribusjoner blant grupper ble utført ved hjelp av log-rank test. Den prognostiske betydningen av GSK3p uttrykk med hensyn til andre patologiske variabler ble vurdert ved hjelp av multivariat Cox regresjonsanalyse. De kvantitative data er uttrykt som middelverdi ± S.D. Den statistiske signifikans av forskjeller mellom gruppene ble bestemt ved en-veis ANOVA, etterfulgt av Fishers plsd post-hoc test. Alle
P
verdiene 2-tailed, og verdiene av
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
1. GSK3P blir oppregulert i NSCLC-tumorvev
Representative bilder av immunhistokjemisk farging for GSK3P i NSCLC-vev og de tilsvarende normale vev er vist i figur 1A. GSK3P var tydelig til uttrykk i NSCLC (n = 211), hovedsakelig i cytoplasma av tumorceller. Sammenligninger av GSK3P proteinnivåer mellom tumor og normalt lungevev er vist i tabell 1. Resultatene viste at GSK3p-nivået var signifikant økt i NSCLC-vev, sammenlignet med de normale lungevev (
P
0,001). Western blotting-analyser bekreftet også at ekspresjonsnivået av GSK3P i tumorer var høyere enn i deres normale motstykker. (
P
= 0,04, figur 1B).
(A) Typisk IHC flekker bilder av menneskelig NSCLC tumor og normalt lungevev (forstørrelse × 200). (B) Western blotting analyser bekreftet at i parvise normal /tumorvev fra NSCLC kreftpasienter, høyere ekspresjonsnivåer av GSK3P i tumorer ble funnet, sammenlignet med deres normale motstykker. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger, og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. *
P
0,001. (C) Fosforylert glykogen syntase (PGS), et substrat av GSK3P, ble påvist i disse NSCLC cellelinjer, med unntak av H292.
Som et substrat av GSK3P, protein uttrykk for fosforylert glykogen syntase (PGS) ble anvendt for å indikere aktiviteten av GSK3p. I disse fire cellelinjer, bortsett fra i H292 PGS, ble påvist (Fig 1 C), som foreslo høy aktivitet av GSK3p i menneskelig lungekreft.
2. Positiv uttrykk for GSK3P er assosiert med dårlig prognose for NSCLC
Pasienter med fullstendig klinisk informasjon (160 saker, 39 kvinner og 121 menn, 61.19 ± 10,53 år) ble rekruttert til overlevelsesanalyse. Median alder var 60,00 år (range, 29 til 83 år). De kliniske egenskaper og overlevelse analyseresultatene er oppsummert i Tabell 2 og Figur 2. 5-års overlevelse for hele gruppen var 49,07%, og median oppfølgingstid var 58,00 måneder (range, 0 til 77,67 måneder).
(A) i hele gruppen pasienter med positiv GSK3p uttrykk hatt kortere overlevelse ganger,
P
= 0,006. Figur 2B-D viser overlevelsesanalyse for undergruppene. (B) I nedre differensiering gruppen, pasienter med positiv GSK3p uttrykk hadde signifikant kortere overlevelse ganger,
P
= 0,013. (C) I T1 + T2 subgruppe pasienter med positiv GSK3p uttrykk hadde signifikant kortere overlevelse ganger,
P
= 0,003. (D) I N0 + N1 subgruppe pasienter med positiv GSK3p uttrykk hadde signifikant kortere overlevelse ganger,
P
= 0,010. (E) Pasienter i M0 undergruppe med positiv GSK3p uttrykk hadde signifikant kortere overlevelse ganger,
P
= 0,008. Kaplan-Meier kurver for de undersøkte proteiner ble brukt til å sammenligne den positive (
stiplede linjer
) og negative fenotyper (
heltrukne linjer
).
univariat analyse ble utført for å beregne forholdet mellom kliniske karakteristika og GSK3p uttrykk. Som vist i tabell 2, NSCLC pasienter med forskjellige kliniske karakteristika, slik som kjønn, alder, histologisk type og tumor-metastase-node (TNM) trinn, viste tilsvarende nivåer av GSK3p. Den prognostiske betydningen av positiv GSK3P uttrykk i ulike undergrupper ble vurdert ved hjelp av log rank test. I hele gruppen, pasienter med positiv GSK3p uttrykk hatt kortere overlevelse ganger (
P
= 0,006, figur 2A). Resultatene viste også at mannlige kjønn, alder og plateepitelkreft (SCC) med positiv GSK3p uttrykk var assosiert med dårligere prognose (
P
= 0,019,
P
= 0,020 og
P
= 0,002, henholdsvis). I tillegg NSCLC pasienter med dårlig differensierte svulster eller i de relativt tidlig stadium undergrupper (T1 + T2, N0 + N1 og M0) med positiv GSK3p uttrykk hadde signifikant kortere overlevelse ganger (
P
= 0,013,
P
= 0,003,
P
= 0,010 og
P
= 0,008, henholdsvis. vist i figur 2B-E)
Videre multivariat Cox regresjonsanalyse viste at i denne gruppen, tumorstørrelse, lymfeknute invasjonen og GSK3p uttrykk var uavhengige prediktorer for NSCLC prognose. Disse resultatene antydet at GSK3p spiller en viktig rolle i NSCLC tumorigenesis og bedt om videre analyse.
3. GSK3p positivt regulerer tumor celleproliferasjon og overlevelse i NSCLC
En lentiviral vektor ble brukt til å overføre designet shRNAs rettet mot GSK3p inn disse 4 NSCLC cellelinjer til stadig på taushet sitt uttrykk. Virkningene av RNA-interferens ble bestemt ved RT-PCR (5 dager etter transfeksjon) og Western blotting (7 dager etter transfeksjon). Disse resultatene viste at RNA og proteinnivåene av GSK3P i tumorceller fra alle 4 cellelinjer som ble undersøkt var betydelig redusert, som vist i figur 3A-B (all
P
0,001). Videre xenoimplantater vev isolert fra nakne mus ble immunhistokjemisk farget, og resultatene bekreftet vedvarende stabile reduksjonen i GSK3p-nivåer etter RNA-interferens (figur 3C). Resultatene indikerte at GSK3p var effektivt og stabilt slått ned av shRNA i alle 4 NSCLC cellelinjer.
(A) GSK3p-spesifikke shRNAs ble transfektert inn NSCLC celler med lentiviral vektor, og cellene ble høstet og tellet 5 dager etter transfeksjon. Real-time PCR indikerte at innblanding av shRNA effektivt slått ned mRNA uttrykk for GSK3P i NSCLC celler. (B) Cellene ble høstet og tellet 7 dager etter transfeksjon. Western blot viser effektiviteten av protein lyddemping av shRNA. (C) Etter behandling med den GSK3p shRNA (KD gruppe), den negative kontroll shRNA (NC gruppe) eller normalt saltvann (CON gruppe), de A549-celler (1 x 10
6 /ml) ble injisert i ryggen av nakne mus. Fire uker senere, xenograft tumorer ble isolert og immunhistokjemisk farget. Resultatene bekreftet den vedvarende reduserte nivåer av GSK3P i KD gruppen sammenlignet med kontrollgruppene. Piler indikerer positiv farging i cytoplasma av tumorceller (forstørrelse x 400). Forsøkene ble gjentatt 3 ganger, og dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
P
. 0,001
CCK-8-analysen viste at knockdown av GSK3p klart undertrykt levedyktigheten til alle 4 cellelinjer (alle
P
0,001, figur 4A). I
in vivo
studie med xenograft mus, svulster i KD gruppen vokste betydelig saktere og hadde lavere tumorvolumer i hele 4-ukers periode (
P
= 0,001, 4B ). Ved slutten av observasjonsperioden, vektene av xenotransplantater i KD gruppen var mye lavere enn for kontrollgruppene (
P
= 0,001, figur 4C). I tillegg ble Ki-67 LI av xenografter dramatisk redusert i KD-gruppen sammenlignet med de av NC og CON grupper (38.98% vs 75,14% vs. 73,84%,
P
0,001, Figur 4D), som indikerte at nedregulering av GSK3P hemmes celleproliferering
in vivo
. Disse resultatene tyder på at GSK3P positivt regulerer vekst og tumorigenesis av NSCLC-celler, og vi neste søkt å løse hvordan disse effektene ble formidlet.
(A) CCK-8 testen viste at inhiberingen av GSK3P trykkes proliferasjonen av NSCLC cellelinjer
in vitro
. *
P
0,001. (B)
In vivo product:: Som beskrevet i figur 3C, ble de xenograft-modeller utviklet i nakne mus. Hver gruppe besto av 6 dyr. Tumorer ble observert hver 3. dag i 4 uker. De xenograft tumorer i mus i KD gruppen vokste betydelig langsommere (som bestemt ved tumorvolumet) i løpet av hele observasjonsperioden. *
P
0,001. (C) sammenligning av de isolerte xenograft tumorer. Bildet viser at svulster isolert fra KD gruppen var mindre og lettere enn tumorene fra kontrollgruppen. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, n = 6. *
P
0,001. (D) Representative bilde av Ki-67 IHC av en tumor xenograft sett under et mikroskop. For å beregne Ki-67 LI ble cellene med brune-farget kjerner anses positiv, noe som indikerer aktiv spredning (forstørrelse × 400). Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, *
P
0,001. (E) cellesyklusanalyse ved 72 timer etter transfeksjon. Resultatene tyder på at inhibisjon av GSK3P resulterte i G1 /S arrest i A549 og SK-MES-1 celler og endret andelene av cellepopulasjonen i ulike faser av cellesyklusen. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra 3 uavhengige eksperimenter utført in triplo. *
P
0,001. (F) av flowcytometri, de apoptotiske analyseresultatene indikerer at hemming av GSK3p betydelig økt apoptotisk frekvensen av NSCLC-celler (med unntak av A549 celler)
in vitro
. *
P
0,001, ▴
P
0,05. (G) Resultatene av TUNEL assay for xenografttumorer foreslått at inhibering av GSK3p økte apoptotiske hastighet på A549-celler
in vivo plakater (forstørrelse x 400). Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, *
P
0,001. (H) Transwell-analyser viser at inhiberingen av GSK3P
in vitro
betydelig redusert invasivitet av NSCLC-celler. Dataene er uttrykt som middel ± S.D. *
P
. 0,001
Etter å ha utført cellesyklus analyse av flowcytometri, fant vi at hemming av GSK3p økt antall celler i G0 /G1 fase og redusert antall celler i S-fasen i A549 (
P
= 0,003 og
P
0,001) og SK-MES-1 celler (
P
= 0,002,
P
= 0,022) (figur 4E). I H1299 og H292-celler, GSK3p knockdown resulterte i en trend mot en økning i G0 /G1 befolkningen, men forskjellene var ikke statistisk signifikans (i H1299-celler,
P
= 0,056, og i H292-celler,
P
= 0,216).
in vitro
, foreslo celle apoptose analysen at de apoptotiske priser i KD gruppen var sterkt høyere enn i kontrollgruppene, med unntak av A549 cellelinje (H292, H1299 og SK-MES-en, alt
P
0,001, A549,
P
= 0,461, figur 4F). For de xenograft mus, den TUNEL-analysen viste at den apoptotiske satsen i KD-gruppen (3,06% ± 1,24%) var mye høyere enn for de andre gruppene (NC gruppe, 0,11% ± 0,04%, og CON gruppe, 0,46% ± 0,23%) (
P
0,001). Som vist på figur 4G, ble apoptotiske celler farget rød og krympet. Sammen tyder disse resultater på at inhibering av GSK3p-indusert NSCLC celle apoptose.
4. Inhibering av GSK3P reduserer invasivitet av NSCLC-celler
For å telle de migrerte cellene
in vitro
, transwell analyse ved bruk av NSCLC-celler, ble gjentatt 3 ganger, og resultatene er vist i figur 4H. For alle 4 cellelinjer, KD gruppen viste signifikant færre invasive celler (alle
P
0,001), som foreslo at hemming av GSK3p sterkt undertrykt invasive av NSCLC celler. I xenograft mus ble ingen metastaser funnet på brutto inspeksjon og palpasjon. I tillegg lysmikroskopi analyse viste ingen tegn til metastaser i de faste og farget organer.
5.β-catenin uttrykk etter hemming av GSK3p
Som vist i figur 5, uttrykket nivået av β-catenin ble betydelig økt i KD gruppen av plateepitelkreft linje SK-MES (
P
0,001). Videre knockdown av GSK3p sterkt undertrykt uttrykk for β-catenin i H1299 celler (
P
0,001), men ikke i H292 (
P
= 0,108) eller A549-celler (
P
= 0,185).
(A) Typiske båndene i western blot-analysen viste at protein nivåer p-catenin ble regulert i en celletype spesifikk måte etter at inhibering av GSK3p. (B) Kvantitativ analyse av β-catenin ekspresjon. Forsøket ble gjentatt 3 ganger, og dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. *
P
. 0,001
Diskusjoner
GSK3p ble opprinnelig identifisert som en viktig regulatorisk enzym av glykogen metabolisme [4], [7]. Siden da har dette proteinet er funnet å være en viktig regulator av celleoverlevelse og apoptose, som forbinder denne multifunksjonelle kinase til kreft [25], [26]. Nylig har en rekke studier vist at GSK3P kan positivt regulere proliferasjon og apoptose av tumorceller [10] – [18], selv om den nøyaktige rolle av GSK3P i lungekreft er ukjent. Derfor er denne studien utforsket prognostisk betydning av GSK3P og dens funksjon i NSCLC.
Først ble det observert at overekspresjon av GSK3P i NSCLC-vev ved sammenligning av NSCLC-vev med tilstøtende normalt vev, og dette avvikende oppbygging av GSK3P i NSCLC-celler som var forbundet med en kortere overlevelsestid og identifisert som en ny risikofaktor for dårlig prognose. Selv om lite oppmerksomhet har blitt betalt til uttrykk av GSK3p i lungekreft, tyder på at overekspresjon av p-GSK3p kan tjene som en markør for dårligere prognose i lungekreft [27]. Fordi p-GSK3P er den inaktive form av GSK3P, overekspresjon av p-GSK3P er ikke nødvendigvis tilsvarer tapet av GSK3P, særlig når det totale proteinnivå er også sterkt oppregulert. I vår studie høye uttrykk for PGS, som er en indikator på GSK3p-aktivitet, ble påvist i de fleste av NSCLC-cellelinjer, noe som indikerer at GSK3P er meget aktiv i NSCLC-celler. Derfor vår studie antydet at overekspresjon av total GSK3P ble over-aktivert og overdro dårlig prognose hos NSCLC pasienter. Lignende resultater har blitt rapportert for blærekreft [18]. Derfor kan GSK3p overekspresjon tjene som en biomarkør for å forbedre tidlig diagnose, pasientens valg og fastsettelse av prognosen.
I tillegg stilles våre IHC Resultatene viste at GSK3p er lokalisert hovedsakelig i cytoplasma i pasient- og xenograft tumor vev. Omvendt, flere studier vist at GSK3P var akkumulert i kjernen i bukspyttkjertelen [11], renale [28] og blærekreft [18]. I disse tumorvev, kan atom GSK3P spille en rolle i NF-kB-formidlet kreftcelleoverlevelse; imidlertid, etter knockdown av GSK3P, NF-kB uttrykk nivåer i de forskjellige NSCLC-cellelinjer fra vår undersøkelse var inkonsekvent, noe som indikerer at GSK3P kan mediere kreftcelleoverlevelse uavhengig av NFkB uttrykket (data ikke vist). Derfor er subcellulære lokalisering av GSK3P kompleks og tett relatert til dets molekylære mekanisme. Videre studier på subcellulære lokalisering rollen GSK3P må gjennomføres.
Det neste viktige spørsmålet er hvordan man skal forklare dyp innflytelse av GSK3p på prognosen av NSCLC pasient. Denne studien forsøkt å undersøke de grunnleggende molekylære mekanismene for GSK3p
in vitro Hotell og
in vivo
. Det har vært godt etablert at GSK3p spiller en sentral rolle i reguleringen av apoptose [26]. For eksempel GSK3p knockout eller litium behandling forsterker apoptose i hepatocytter [29], og en økt forekomst av apoptose etter hemming av GSK3p har blitt rapportert i prostata kreft [30], bukspyttkjertelkreft [11], leukemi [13], gliom ,»For example, GSK3β knockout or lithium treatment potentiates apoptosis in hepatocytes [29], and an increased rate of apoptosis following the inhibition of GSK3β has been reported in prostate cancer [30], pancreatic cancer [11], leukemia [13], glioma ,,,0
