Abstract
Bezielle er en botanisk ekstrakt som har selektiv anti-tumor aktivitet, og har vist en lovende effekt i de tidlige fasene av klinisk testing. Bezielle hemmer mitokondriell respirasjon og induserer reaktive oksygenarter (ROS) i mitokondriene av tumorceller, men ikke i ikke-transformerte celler. Genereringen av høy ROS i tumorceller fører til tunge DNA-skade og hyper-aktivering av PARP, fulgt av inhibering av glykolyse. Bezielle hører derfor til en gruppe av stoffer som er rettet mot tumorcelle mitokondriene, men dets cytotoksisitet innebærer hemming av både cellulære veier energiproduserende. Vi fant at den cytotoksiske aktivitet av den Bezielle ekstrakt
in vitro
ko-renset med en definert fraksjon som inneholder flere flavonoider. Vi har isolert flere av disse Bezielle flavonoider, og undersøkt deres mulige rolle i den selektive anti-tumor cytotoksisiteten av Bezielle. Våre resultater understøtter hypotesen om at et stort Scutellaria flavonoid, scutellarein, besitter mange, om ikke alle av de biologisk relevante egenskapene av den samlede ekstrakt. Som Bezielle, scutellarein indusert økende nivåer av ROS mitokondriell opprinnelse, progressiv DNA-skader, protein oksidasjon, nedbrytning av redusert glutation og ATP, og undertrykkelse av både OXPHOS og glykolyse. Som Bezielle, scutellarein var selektivt cytotoksisk mot kreftceller. Carthamidin, en flavonone funnet i Bezielle, også indusert DNA skade og oksidativt celledød. To kjente plante flavonoider, apigenin og luteolin, hadde begrenset og ikke selektiv cytotoksisitet som ikke er avhengige av sine pro-oksiderende aktiviteter. Vi tilbyr også bevis for at cytotoksisitet av scutellarein ble økt når andre Bezielle flavonoider, ikke nødvendigvis svært cytotoksiske eller selektive på egen hånd, var til stede. Dette indikerer at aktiviteten av total Bezielle ekstrakt kan avhenge av en kombinasjon av flere ulike forbindelser til stede i det
Citation. Chen V, Staub RE, Baggett S, Chimmani R, Tagliaferri M, Cohen jeg, et al . (2012) Identifisering og analyse av de aktive fytokjemikalier fra Anti-Cancer Botanisk Pakk Bezielle. PLoS ONE 7 (1): e30107. doi: 10,1371 /journal.pone.0030107
Redaktør: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Canada
mottatt: 21 juli 2011; Godkjent: 12 desember 2011; Publisert: 17 januar 2012
Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet helt av BioNovo, Inc. Funder spilt en rolle i beslutningen om å forske Bezielle som en anti-kreft agent, men hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser: forfatterne erklærer en økonomisk konkurrerende interesse. Forfatterne erkjenner at de er betalte ansatte og aksjonærer i BioNovo, Inc, og at denne studien, i sin helhet, ble støttet av midler fra BioNovo. Bezielle (BZL101) er Bionovo proprietære botaniske stoffet kandidat (FDA-IND: 59521) for behandling av metastatisk brystkreft. Bionovo s United States patent nr 7700136 omfatter en fremgangsmåte for behandling av brystkreft ved bruk av en ekstrakt av Scutellaria Barbata. Dette patentet omfatter også bruk av Bionovo proprietære BezielleR formulering som en monoterapi for behandling av brystkreft. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Bezielle (BZL101) er en vandig ekstrakt av luftig deler av gras Scutellaria barbata lenge brukt for behandling av feber og kreft i tradisjonell kinesisk medisin. Bezielle er selektivt cytotoksisk til kreftceller mens sparsom normale og ikke-transformerte celler
in vitro product: [1]. Bezielle ekstrakt hadde viste en lovende anti-kreft-aktivitet i begynnelsen av klinisk testing [2], [3], men ytterligere klinisk utvikling av Bezielle skulle fremskyndes ved den kjemiske identifikasjon av forbindelsen (e) i Bezielle som er direkte ansvarlig for sin anti -cancer aktivitet. Denne strategien er det styrende prinsippet for anti-kreft forskning utført ved BioNovo som mål å bringe til praktisering av vestlig medisin noen av urte kunnskap akkumulert i tradisjonell kinesisk medisin. Målet er å bygge bro mellom plantebasert tradisjonell medisin og sammensatte-basert vestlig medisin som, av nødvendighet, innebærer identifisering av de aktive fytokjemikalier i den totale urteekstrakter. I denne artikkelen beskriver vi identifisering og analyse av aktive fytokjemikalier (r) i Bezielle. Aktivitet-guidet fraksjonering av Bezielle førte til identifisering av en distinkt fraksjon som var selektivt cytotoksisk
in vitro
. Ytterligere kjemisk analyse av denne fraksjonen viste at den inneholder en rekke beslektede forbindelser som tilhører en familie av flavonoider. Flavonoider er fytokjemikalier som finnes i et bredt utvalg av planter, inkludert de som er vanlig i normal diett. Flavonoider, generelt, anses å ha anti-inflammatorisk, anti-oksidanter og kreft-forebyggende egenskaper (anmeldt blant annet i [4], [5], [6]).
Den medfølgende papir i denne problemet, og resultatene er publisert tidligere [1] viser at Bezielle dreper tumorceller via induksjon av reaktive oksygenarter (ROS), skade DNA, kollaps av redoks-status og metabolsk undertrykkelse, som innebærer hemming av både mitokondriell respirasjon og glykolyse, samt uttømming i det mitokondrielle reservekapasitet. Alle disse aktivitetene Bezielle er avskaffet i tumorceller med deaktivert mitokondrielle respirasjonen. Vi har derfor undersøkt Bezielle-avledet flavonoider for aktiviteter karakteristisk for Bezielle. Nærmere bestemt ble fire store Bezielle flavonoider identifisert via aktivitetsstyrt isolasjon analysert for (a) selektiv cytotoksisitet til kreftceller; (B) evne til å indusere progressivt økende nivåer av ROS; (C) avhengighet av ROS induksjon og cytotoksisitet i nærvær av respirerende mitokondriene; (D) frembringelse av DNA-skade; (E) effekter på cellulær redoks-status; (F) metabolsk undertrykking.
Vi rapporterer at enkelte flavonoider, langt fra å ha anti-oksiderende egenskaper, induserer ROS og DNA-skade fortrinnsvis i tumorceller. Spesielt scutellarein var selektivt cytotoksisk til tumorceller, men ikke i ikke-transformerte celler. Scutellarein indusert progressivt høyere nivåer av ROS og DNA-skade i en tidsavhengig måte, i likhet med total Bezielle. Scutellarein også indusert metabolsk undertrykking, hemmer både OXPHOS og glykolyse. Sistnevnte aktiviteter scutellarein samt sin cytotoksisitet ble forsterket da det ble kombinert med andre flavonoider som i seg selv ikke er svært cytotoksiske og ikke indusere DNA-skade.
Materialer og metoder
Aktivitets Guidet isolering av anti-kreft forbindelser fra Bezielle
Te-lignende ekstrakter av
Scutellaria barbata
for aktiviteten styrt isolasjon ble fremstilt ved å tilsette vann i bakken, tørket urt (10:1, volum : masse), deretter bringe blandingen til en byll. Urte Løsningen fikk småkoke i 45-60 minutter ved omtrent 70 ° C, deretter sugefiltrert (Whatman en papirfilter) for å gi det rå te. Et like stort volum aceton ble tilsatt til ekstraktet for å skape et bunnfall. Aceton: vann oppløsningen ble filtrert med sug (Whatman en papirfilter) og deretter konsentrert ved roterende fordampning
i vakuum
for å fjerne aceton og ytterligere redusere det vandige volum med 60-70%. Den konsentrerte te ble igjen filtrert (0,45 um).
Det konsentrerte ekstrakt ble utsatt for åpen kolonnekromatografi over Diaion HP-20-harpiks (Supelco, Bellefonte, PA). Prøven ble applisert på kolonnen i 20% metanol i vann og eluert med 20%, 50%, 75% og 100% metanol (tre kolonnevolumer for hvert trinn). Fraksjonene ble testet for cytotoksisitet ved bruk av CCK8 analyse, og for DNA-ødeleggende aktivitet ved anvendelse Comet assay. Begge aktiviteter ble funnet å være assosiert med metanol fraksjonene 75% og 100%.
Aktive fraksjoner fra HP-20-kolonne ble kombinert, konsentrert og utsatt for åpen kolonnekromatografi over Sephadex LH20 harpiks (Sigma-Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI). Prøven ble lastet på 01:01 metanol-vann og eluert i fire trinn ved 50%, 60%, 75% og 100% metanol i vann. Cytotoksisitet analysedata kommet frem til at den største aktivitet var i fraksjoner som ble eluert fra kolonnen i 75-100% metanol. En fraksjon lignende i sammensetning og aktivitet ble også fremstilt ved fordeling Bezielle med etylacetat (figur 1).
Denne fraksjon ble isolert som beskrevet i Eksperimentelle prosedyrer. Strukturer av noen av forbindelsene som ble ytterligere analysert er vist.
Preparativ HPLC ble utført på de aktive fraksjonene som ble gjenvunnet fra LH20 søyle eller tilsvarende etylacetat skillevegg av Bezielle. Preparativ HPLC anvendes en lineær gradient fra 10% til 60% acetonitril i 0,1% vandig trifluoreddiksyre i løpet av 30 min på en Phenomenex Luna C18 (2) kolonne (150 x 21.1 mm, 5 um) ved en strømningshastighet på 20 ml /min. Flere forbindelser ble renset ved preparativ HPLC, og deres strukturer ble belyst. Scutellarein, luteolin og apigenin ble identifisert basert på LC /MS og NMR sammenligning med kommersielle referansestandarder. Isoscutellarein og carthamidin ble identifisert basert på LC /MS, 1D og 2D NMR og sammenligning med litteraturdata. Apigenin og luteolin ble kjøpt fra Indofine Chemical Company, Inc. (Hillsborough, NJ). Scutellarein ble kjøpt fra Apin Chemical Company (Abingdon, Oxfordshire UK). Scutellarein, isoscutellarein og carthamidin ble også syntetisert ved BioNovo. Data for strukturoppklaring av forbindelser og syntetiske prosedyrer kan bli funnet i Methods S1.
Reagenser og antistoffer
Alle reagenser og hemmere ble kjøpt fra Sigma. Fluorescent indikatorer på ROS, mitokondrie superoxide og nitrogenoksid, CM-H
2DCFDA, MitoSox og CM-H
2DAFDA og var fra Molecular Probes /Invitrogen. Antistoffer mot nitrotyrosine var fra Millipore, antistoff mot PAR var fra Becton-Dickinson.
Cell kultur og behandlinger
Alle cellelinjer ble hentet fra ATCC, og formert i RPMI med 10% FCS ( MDAMB231), DME med 10% FCS (Hs578T, SKBR3) og DME /F12 med 5% FCS og kosttilskudd (MCF10A og 184A1). Mediet for MCF10A og 184A1 også inneholdt 50 ug /ml hypofyse-ekstrakt, 10 ug /ml insulin, 0,5 ug /ml hydrokortison og 0,02 ug /ml EGF (Sigma). Alle medier var pyruvat-fri. Celler ble behandlet med BZL101 ved en konsentrasjon på 250 ug /ml (tørr vekt pr volum), eller med vann (merket som «ubehandlet» gjennom papiret). Flavonoider ble oppløst i DMSO, og kontrollkulturer ble behandlet med DMSO alene.
Målinger av celle-levedyktighet, mitokondrie potensial, ATP og GSH
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved bruk av CCK-8 kit (Dojindo) . Mitokondriell transmembranpotensial (ΔΨM) i levende celler ble analysert ved anvendelse av potensialsensitive kationiske fargestoff JC-1 (Molecular Probes) ved å inkubere cellene med 2 uM JC-1 i 30 minutter. Cellene ble vasket, og rød fluorescens (indikativ for sunn mitokondrier) samt grønn fluorescens (et tegn på mitokondrier med lav ΔΨM) ble bestemt på FACScan. ATP-nivåer ble kvantifisert ved hjelp av ATP Bioluminesens analysesett HS II (Roche Applied Science). For bestemmelse av innholdet av redusert glutation, ble celler i 96 brønners plater ble inkubert i medium inneholdende 8 jiM monobromobimane (MBB). På forskjellige tidspunkter etter tilsetning av MBB fluorescens ble avlest på en plateavleser med filtre satt til eksitasjon på 360 nm og emisjon på 460 nM.
Analyse av protein oksydative modifikasjoner
Carbonyl modifisering av proteiner i celler behandlet med Bezielle og flavonoider ble kvantifisert ved hjelp av FlowSellect Oksidativt stress kit fra Millipore. Settet inneholder 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNP), kjemiske som kovalent binder seg til karbonylgruppe modifikasjon på proteiner. Etter derivatisering av karbonylgrupper, er DNP bundet proteinene detektert med et FITC-konjugert anti-DPN-antistoff.
Western blot-analyse
Hele cellelysatene ble underkastet elektroforese på SDS-PAGE og overført til nitrocellulose membraner. Membranene ble blottet med antistoffer i anbefalte konsentrasjoner over natten ved 4 ° C og de bundne primære antistoffer ble påvist ved anvendelse av peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer. Blottene ble utviklet ved hjelp av SuperSignal forbedret chemiluminescence kit (Pierce) og avbildes på Kodak Imager ISR2000.
Comet Assay
Alkaline komet analysene ble utført ved hjelp av Comet assay kit fra Trevigen i henhold til produsentens instruksjoner. Etter elektroforese kjernene ble farget med SYBR grønn og sett under et fluorescens mikroskop. Prosenter av celler med kometer ble kvantifisert ved en observatør blindet til identiteten til lysbildene. Oliven hale øyeblikk, definert som produktet av prosent DNA i halen og forskyvning mellom posisjonen av de midlere sentrene av masse i de hoder og haler, ble bestemt for minst 40 celler per prøve. Celler ble fotografert og analysert med TriTek CometScore bildeanalyse programvare.
Metabolsk analyser med Seahorse XF96 ekstracellulær Flux Analyzer
Celler ble belagt over natten på XF96 PET 96 brønners plater ved eksperimentelt forhåndsbestemte numre (10 × 10
3 celler per brønn for MDAMB231 og 12 × 10
3 celler per brønn for MCF10A). Metabolsk flukser ble analysert på Seahorse XF96 analysator i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [7]. De basale ECAR verdier (i km /h /min), PPR (i pmolH + /min) og OCR verdier (i pmol O
2 /min) ble målt i 4 sykluser. Etter måling av basalnivåer, ble mitokondriell uncoupler FCCP 1 uM automatisk injisert inn i eksperimentelle brønnene for bestemmelse av den maksimale mitokondriell respirasjon, eller reservekapasitet. Etter en syklus av målinger inhibitor for mitokondriell kompleks III antimycin A på 5 uM ble injisert i de eksperimentelle brønnene, og en annen målesyklus ble utført. Hvert eksperimentelt punkt var i gjennomsnitt 6 til 10 replikerte brønner, og Forsøkene ble gjentatt minst 4 ganger. Normalisering av ECAR ble PPR OCR verdier oppnådd i XF96 analyser utført ved hjelp av kvantifisering av cellulær DNA med CyQuant analyse (Promega) på eksperimentelle plater. Alle XF96 Dataene er uttrykt som ECAR eller OCR verdier normalisert til DNA-innhold, eller som prosent av aktiviteter i forhold til disse, målt i det samme eksperimentet i celler holdt i komplett medium (etter normalisering av alle datasett).
resultater
isolering og rensing av aktive fraksjoner og forbindelser fra Bezielle trekke
Den aktivitets guidet isolering av aktive fraksjoner og forbindelser i de aktive fraksjonene er beskrevet i materialer og metoder. En fraksjon med høy og selektiv cytotoksisk aktivitet ble isolert (figur 1). Denne fraksjonen, i likhet med totalt Bezielle ekstrakt, var svært cytotoksisk mot brystcancercellelinjer MDAMB231 og SKBR3 men ga ikke signifikant celledød i den udødelig ikke-transformerte cellelinje MCF10A eller primære humane fibroblaster IMR90 (ikke vist). Som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter ble forbindelsene i brøkdel av høyanriket for cytotoksisk aktivitet identifiseres som flavonoider. Flere av dem ble renset til homogenitet, identifisert som beskrevet i Methods S1 og analysert i cellulære analyser.
Cytotoksisk aktivitet av utvalgte Bezielle flavonoider
Først cytotoksisiteten av flere flavonoider isolert fra Bezielle ble testet med brystkreftlinjer MDAMB231 og ikke-transformert brystcellelinje MCF10A. Figur 2A viser cytotoksisitet av de to nært beslektede flavoner apigenin (A) og luteolin (L) som er i utstrakt karakterisert i den publiserte litteratur, med de fleste rapporter som beskriver anti-oksiderende egenskaper av disse forbindelser. Åpenbart disse flavones hadde et begrenset cytotoksisitet i MDAMB231 celler og en noe høyere aktivitet mot MCF10A celler, som er akkurat det motsatte av selektivitet sett med Bezielle. I tillegg døse responsen av MCF10A og MDAMB231 celler til A og L var forholdsvis flat over hele konsentrasjonsområdet fra 5 til 20 pg /ml (figur 2A), noe som indikerer en mangel på dose-respons. Disse resultatene antyder at hverken apigenin eller luteolin individuelt bidrar betydelig til den selektive cytotoksiske aktivitet av Bezielle.
A. Cytotoksisk aktivitet av apigenin (A), luteolin (L) og Bezielle i brystkreftceller MDAMB231 og ikke-transformerte bryst epitelcellelinje MCF10A. Cellene ble behandlet i 24 timer før analyse med konsentrasjonene av flavonoider indikert til høyre av listene (5, 10 og 20 ug /ml), eller med Bezielle (BZL) ved 250 ug /ml. B. Cytotoksiske aktiviteter scutellarein (S), isoscutellarein (IS) og carthamidin (C), som i A. Alle resultater er gjennomsnitt ± S.E. (N = 4).
Figur 2B viser induksjon av celledød av de nært beslektede flavoner scutellarein (S) og isoscutellarein (IS) såvel som den flavonone carthamidin (C). Scutellarein hadde en begrenset effekt på levedyktigheten til MCF10A celler, men var svært cytotoksisk mot MDAMB231 (og andre kreftcellelinjer, ikke vist) på en doseavhengig måte (figur 2B). Isoscutellarein var betydelig mindre cytotoksisk til MDAMB231 celler enn scutellarein, og ikke drepe MCF10A celler, som indikerer en begrenset, men selektiv cytotoksisitet. Carthamidin var mer aktiv mot MDAMB231 celler enn MCF10A-celler ved de to lavere konsentrasjoner. Imidlertid celledød i kulturer behandlet med 20 ug /ml carthamidin var meget sterk og tydelig allerede ved 4 til 5 timer etter begynnelsen av behandlingen, noe som indikerer en alvorlig toksisitet av carthamidin ved høyere konsentrasjon.
to ekstra brystkreftcellelinjer, Hs578T og SKBR3 viste det samme mønster av sensitivitet overfor flavonoider som MDAMB231 (figur S1 og ikke vist). Vi har også testet annen udødeliggjort ikke-transformerte cellelinje avledet fra brystepitel, 184A1 og MCF12A, som responderte på behandling med tilsvarende flavonoider til MCF10A (ikke vist).
Disse resultater identifiserer scutellarein som den mest cytotoksiske og, viktigst, selektivt cytotoksisk, Bezielle flavonoid ut av forbindelsene analysert her. Isoscutellarein viste selektivitet mot kreftceller, men ble ikke undersøkt videre på grunn av dens marginale cytotoksisitet. Carthamidin var også selektiv mot kreftceller ved lavere konsentrasjoner, mens apigenin og luteolin var ikke i det hele tatt selektiv.
Generering av ROS etter Bezielle flavonoider
Prosessen med Bezielle indusert død i kreftceller er initiert ved generering av høye nivåer av ROS. Videre, øker nivået av ROS både peroksyd type og mitokondrielle superoksid fremkalt ved Bezielle sterkt over tid i tumorceller, men ikke i MCF10A-celler (Chen et al., Submitted). Vi har derfor undersøkt om enkelte flavonoider fra Bezielle generere ROS og superoksid i kreftceller, men ikke i ikke-transformerte celler, og hvis induksjon av ROS øker over tid sett med Bezielle. Nivåer av peroksyd-typen ROS (detekterbare med H
2DCFDA) ble undersøkt i behandlede celler til forskjellige tider, og to av tidspunktene er vist i figur 3A. To forskjellige funksjoner er klar: a) alle flavonoider indusere mye høyere nivåer av peroxide typen ROS i MDAMB231 enn i MCF10A celler, og b) bare scutellarein viser en tidsavhengig økning i nivåene av ROS, ligner Bezielle. Induksjonen av peroksyd-typen ROS ved apigenin, luteolin og carthamidin ikke øke over tid, men forble enten uforandret, eller ble noe redusert, selv om opprinnelig apigenin indusert høyeste nivåer av ROS. Den økende nivåer av DNA-ødeleggende peroksidtype ROS indusert av scutellarein på en tidsavhengig måte som ytterligere understøtter muligheten for at scutellarein er involvert i den selektive anti-tumor cytotoksisiteten av Bezielle.
A. Induksjon av peroksidtype ROS av flavonoider i MDAMB231 og MCF10A celler. Cellene ble behandlet i 30 minutter eller 6 timer med de angitte flavonoider på 10 mikrogram /ml og analysert for grønn fluorescens (FL1) på en FACScan etter lasting med H
2DCF-DA. Resultatene er vist som gangers økning av FL1 observert i ubehandlede celler analysert i samme eksperimentene (FL1 nivåer i ubehandlede celler er merket med prikket linje). B. Induksjon av mitokondriell superoksid ved Bezielle flavonoider. Etter behandling som i A, ble cellene lastet med MitoSox Red og analysert for innhold av rød fluorescens (FL2). Resultatene er presentert på samme måte som i A, og er gjennomsnitt ± S.E. fra tre til fem forsøk C. Survival of MDAMB231 celler behandlet med flavonoider ved 10 ug /ml i 24 timer i fravær eller nærvær av 10 mM pyruvat eller NAC. Resultatene er gjennomsnitt ± S.E. (N = 3). Signifikante forskjeller (** P 0,01, * P 0,05) mellom celler behandlet med flavonoider eller Bezielle alene eller i nærvær av antioksidanter er e vises. D. Samme som i C, med MCF10A celler.
Induksjon av mitokondriell superoksyd undersøkt ved bruk av indikatoren MitoSox Red viste at flavonoider utløse en tidsavhengig økning i mitokondriell superoksyd i MDAMB231 celler (figur 3B). Økningen var svært signifikant (minst 5 ganger) i tre flavonoider, men ikke for carthamidin, som viste bare en økning på 30% etter 6 timer. Overraskende, apigenin og luteolin, som var mindre cytotoksiske i MDAMB231 celler, indusert de høyeste nivåene av mitokondrie superoksid som ble ytterligere økt i en tidsavhengig måte (figur 3B). Dette var i motsetning til mangelen på økning i nivåene av peroksyd-typen ROS over tid i celler behandlet med disse flavonoider (figur 3A). Scutellarein, i likhet med Bezielle, hadde en beskjeden effekt på mitokondrie superoksyd i begynnelsen av inkubasjonen, men økte nivåene av superoksid omtrent syv ganger etter 6 timer (figur 3B).
Induksjon av ROS ved Bezielle er avgjørende for dets cytotoksisitet, som ble opphevet i nærvær av oksiderende fjernende midler slik som N-acetylcystein (NAC) og pyruvat [1]. Vi har undersøkt om NAC eller pyruvat kan hemme celledød indusert av private flavonoider. Både pyruvat og NAC individuelt hemmet celledød indusert av carthamidin og scutellarein i MDAMB231 celler (Figur 3C), noe som tyder på at disse forbindelsene indusere celledød gjennom oksidativt stress, som ligner på Bezielle. Imidlertid kan hverken pyruvat eller NAC beskytte MDAMB231 cellene fra den begrensede celledød induksjon ved apigenin og luteolin (figur 3C), noe som indikerer at døden fremkalt av disse forbindelsene var ikke et resultat av den oksidative skader.
Lignende eksperimenter var utført med MCF10A-celler som er noe mer følsomme for å drepe ved apigenin og luteolin. Som med MDAMB231 celler, var det minimal beskyttelse av pyruvat og NAC fra døden indusert av apigenin og luteolin, men en god beskyttelse ble observert med scutellarein og Bezielle-behandlede celler (Figur 3D). Forsøkene med NAC og pyruvat ble også utført med en høyere konsentrasjon av flavonoider (20 ug /ml), og ved denne konsentrasjonen celler ble også beskyttet mot å drepe ved carthamidin og scutellarein, men ikke apigenin og luteolin (ikke vist). Disse resultatene indikerer sterkt at scutellarein og carthamidin indusere celledød via mekanismer som involverer oksidativt stress, mens Apigenin og luteolin, selv om de lokke fram mobil ROS, indusere begrenset celledød som ikke er oksidativt i naturen.
Scutellarein induserer hovedsakelig mitokondrielle ROS det er avgjørende for dets cytotoksisitet
Bezielle induserer ROS hovedsakelig i mitokondriene, fordi behandling av Rho-0 variant av MDAMB231 som mangler åndedrett-kompetente mitokondriene, klarte ikke å indusere enten mitokondriell superoksyd eller peroksyd-typen ROS. Enda viktigere, MDAMB231 Rho-0-cellene er bemerkelsesverdig motstandsdyktig mot Bezielle indusert død (Chen et al., Submitted). Derfor undersøkte vi om fravær av pustende mitokondrier påvirker ROS induksjon av private flavonoider. Figur 4A viser at induksjon av mitokondrie superoksid av alle flavonoider er veldig sterkt svekket i MDAMB231Rho-0 celler. Spesielt superoksid generasjon av scutellarein og carthamidin ble fullstendig hemmet. Tilsvarende induksjon av DCF-DA påviselig peroksidtype ROS av carthamidin, scutellarein og Bezielle var også nesten fullstendig hemmet. Dette tyder sterkt på at mitokondriene er den viktigste kilden til ROS indusert av disse flavonoider Men apigenin og luteolin fortsatt induserte betydelige nivåer av DCF-DA påviselig ROS i Rho-0 celler. Dette indikerer at apigenin og luteolin kunne målrette mobil ROS kilder enn mitokondriene.
A. MDAMB231 og MDAMB231Rho-0-celler ble behandlet med flavonoider i 6 timer, og nivåer av ROS og mitokondrielle superoksyd ble kvantifisert som i figur 2. Resultatene er gjennomsnitt ± S.E. (N = 3). B. MDAMB231 Rho-0 celler og MDAMB231 celler ble behandlet med Bezielle, scutellarein eller apigenin i 24 timer, og prosenter av overlevende celle kvantifiseres. Dataene er gjennomsnitt av tre forsøk. C. spredning av mitokondrie transmembrane potensial ved flavonoider. Celler ble behandlet i 2 timer, lastet med potensiell følsomt fargestoff JC-1 og analysert ved strømningscytometri. FL2 fluorescens er redusert i celler med senket ΔΨM; FL2 av ubehandlede celler ble tilordnet et nivå på 100%. Alle behandlinger resulterte i statistisk signifikant spredning av ΔΨM sammenlignet med kontrollceller. Signifikante forskjeller ble også observert mellom celler behandlet med scutellarein og andre grupper, og er indikert (** P 0,01, * P 0,05). D. Påvisning av karbonylerte proteiner i celler behandlet med de angitte flavonoider eller Bezielle i 4 timer. Etter behandling ble cellene fiksert, behandlet med DNP, vasket og inkubert med et FITC-konjugert antistoff mot DNP, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Alle resultater er gjennomsnitt ± S.E. (N = 3). Signifikante forskjeller (** P 0,01, * P 0,05) sammenlignet med ubehandlet er vist
Vi, og andre har vist at det er mye brukt NOX inhibitor DPI har en sterk hemmende effekt på mitokondrie åndedrett.. DPI sterkt hemmer Bezielle indusert ROS generasjon og celledød (Chen et al., Submitted). Vi har undersøkt om DPI er i stand til å dempe ROS induksjon av flavonoider, og observerte en uttalt hemming av ROS, svært lik den som ble observert i Rho-0 celler (Figur S2). Hemming av åndedrett i Rho-0-cellene og i cellene akutt behandlet med DPI hadde derfor svært like hemmende effekt på induksjon av mitokondriell ROS av flavonoider (Figur S2).
Vi neste undersøkt om hemming av mitokondriell respirasjon beskytter celler fra flavonoid-indusert død. Scutellarein, lik Bezielle (Chen et al., Submitted), klarte ikke å indusere celledød i Rho-0-celler (Figur 4B). Men celledød induksjon av apigenin (figur 4B) og luteolin (ikke vist) ble ikke påvirket av mangel på funksjonelle mitokondriene.
Disse resultatene tyder sterkt på at apigenin og luteolin er ikke sannsynlig å bidra til oksidative kapasitet av Bezielle. Selv om begge flavones indusert høye nivåer av mitokondrie superoksid, verken behandling med antioksidanter eller invalidiserende mitokondriell respirasjon påvirket deres begrenset cytotoksisitet. Derfor kan det hende at bidraget fra apigenin og luteolin til cytotoksisitet av Bezielle ikke involverer ROS. I kontrast, ble cytotoksisitet av scutellarein og carthamidin sterkt hemmet enten ved behandling med ROS åtseldyr eller i Rho-0 celler, lik Bezielle.
Flavonoider framprovosere reduksjon i mitokondrie transmembrane potensialet
Vi har tidligere vist at Bezielle induserer en sterk spredning av mitokondriemembranpotensialet (ΔΨM) i tumorceller [3]. Vi undersøkte derfor de potensielle effektene av flavonoider på ΔΨM. Som vist i figur 4C, av de fire flavonoider testet, scutellarein indusert den sterkeste tap av ΔΨM, mens carthamidin var ikke spesielt aktiv, i forståelse med lave nivåer av mitokondrielle ROS det fremkaller. Apigenin og luteolin indusert spredning av ΔΨM; Det var imidlertid ikke så dramatisk som tap indusert av enten scutellarein eller Bezielle. Vi undersøkte også om spredning av mitokondrie transmembrane potensial ved flavonoider kan bli svekket av antioksidanter. Figur S3 viser at NAC delvis forhindret tap av ΔΨM indusert av scutellarein men ikke ved apigenin (og luteolin, ikke vist). Pyruvat hadde en tilsvarende innvirkning (ikke vist). Sammen med resultatene som er beskrevet ovenfor, er dette en sterk indikasjon på at scutellarein (og Bezielle) induserer direkte oksidativ skade i mitokondriene av tumorceller. Apigenin og luteolin kanskje framprovosere cellulære responser som involverer mitokondriene, men kan ikke være avhengig av en direkte oksidativ skade mitokondriene.
Induksjon av protein oksidasjon
Oksidativt stress induserer skade andre enn DNA biomolekyler. Vi har undersøkt om Bezielle og dets flavonoider indusere en felles oksidativ modifisering av proteiner, karbonyleringen. Figur 4D viser at Bezielle og scutellarein betydelig økt celleinnholdet karbonylerte proteiner, og en liten økning ble observert med apigenin. Carthamidin og luteolin induserte ikke oksidativ skade på cellulære proteiner. Dannelse av protein karbonylering av Bezielle og scutellarein gir en ekstra bekreftelse på hypotesen om at scutellarein er den viktigste cytotoksisk middel i Bezielle.
Induksjon av DNA-skade av flavonoider fra Bezielle
Bezielle induserer oksidativ DNA skade som er kritisk for dens evne til selektivt å drepe kreftceller [1]. Vi har undersøkt hvilke av enkelt Bezielle flavonoider indusere DNA-skade. MDAMB231 celler ble behandlet med flavonoider og kvantifisert for to parametere av DNA-skade ved hjelp av Comet assay: prosent av celler med skadet DNA, og den oliven øyeblikk (den sistnevnte reflekterer graden av DNA-skade per celle). Flavonoider ble testet i Comet assay ved å bruke konsentrasjoner fra 5 til 20 ug /ml og inkubasjonstider fra 30 minutter til 6 timer. Selv ved den høyeste konsentrasjonen testet, 20 ug /ml, apigenin og luteolin induserte ikke DNA-skade kan påvises i Comet assay (ikke vist).
Scutellarein og carthamidin induserte betydelig DNA-skade ved konsentrasjoner på 5 ug /ml og over. Isoscutellarein også induserte DNA-skade, men bare ved høyere konsentrasjoner (ikke vist). Figur 5A viser at prosentandelen av celler som danner kometer i nærvær av scutellarein ble gradvis økt over tid.
