Abstract
Bakgrunn
Periostin, IFN-indusert trans protein 1 (IFITM1) og Vingeløse-type MMTV integrasjon nettstedet familie, medlem 5B (Wnt-5b) ble tidligere identifisert som invasjonen fremmet gener av hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) ved å sammenligne de genuttrykk profiler mellom foreldre og en meget inngripende klone. Vi har tidligere rapportert at Periostin og IFITM1 fremmet invasjonen av HNSCC celler. Her viste vi at Wnt-5b overekspresjon fremmet invasjonen av HNSCC celler. Dessuten, stromelysin-2 (matriksmetalloproteinase-10, MMP-10) ble identifisert som en felles opp-regulert gen mellom Periostin, IFITM1 og Wnt-5b som overuttrykker HNSCC-celler ved hjelp av mikroarray datasett. I denne studien undersøkte vi rollene til MMP-10 i invasjonen av HNSCC.
Metoder og funn
Vi har undersøkt uttrykk for MMP-10 i HNSCC tilfeller av immunhistokjemi. Høy uttrykk for MMP-10 ble ofte observert og var signifikant korrelert med invasivitet og metastase i HNSCC tilfeller. Deretter undersøkte vi rollene til MMP-10 i invasjonen av HNSCC celler
in vitro
. Ektopisk overekspresjon av MMP-10 fremmet invasjonen av HNSCC celler, og knockdown av MMP-10 trykt invasjonen av HNSCC celler. Videre MMP-10 knockdown trykt Periostin og Wnt-5b-forfremmet invasjon. Interessant, MMP-10 overekspresjon indusert redusert p38 aktivitet og MMP-10 knockdown indusert økt p38 aktivitet. I tillegg behandling med en p38 inhibitor SB203580 i HNSCC celler hemmet invasjon.
Konklusjoner
Disse resultatene tyder på at MMP-10 spiller en viktig rolle i invasjonen og metastasering av HNSCC, og at invasjon drevet av MMP-10 er delvis forbundet med p38 MAPK-hemming. Vi foreslår at MMP-10 kan brukes som en markør for prediksjon av metastaser i HNSCC
Citation. Deraz EM, Kudo Y, Yoshida M, Obayashi M, Tsunematsu T, Tani H, et al. (2011) MMP-10 /stromelysin-2 Fremmer invasjon av hode og nakke kreft. PLoS ONE 6 (10): e25438. doi: 10,1371 /journal.pone.0025438
Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 24 januar 2011; Godkjent: 05.09.2011; Publisert: 05.10.2011
Copyright: © 2011 Deraz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansiert delvis av departementet for utdanning, vitenskap og kultur i Japan tilskudd-i-aid (Y. Kudo og T. Takata) og Kurozumi Memorial Foundation grant (Y. Kudo). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er en av de mest vanlige typer av kreft hos mennesker, med en årlig forekomst av mer enn 500.000 tilfeller over hele verden [1]. Til tross for fremskritt i behandlingsstrategier, dødeligheten og svikt i behandling i HNSCC pasienter er fortsatt høy. Høy dødelighet og dårlig prognose av HNSCC er forutsagt av forekomsten av lymfeknutemetastase, som er en vanlig hendelse hos kreftpasienter [2]. HNSCC utvikles gjennom oppbygging av flere genetiske og epigenetiske forandringer i en flertrinnsprosess [3]. Forsøk på å identifisere gener som er involvert i metastase er avgjørende for tidlig prediksjon av HNSCC atferd. Prosessen med metastasering består av sekvensielle og selektive trinn omfattende proliferasjon, induksjon av angiogenese, løsgjøring, motilitet, invasjon i sirkulasjon, aggregering og overlevelse i sirkulasjonen, celle arrest i fjerne kapillærsjikt og uttredelse inn organ parenchyma [4], [5] . Identifiseringen av nye invasjon og metastase relaterte molekyler i HNSCC og den bedre forståelse av mekanismene hvorved carcinoma celler gjennomgår i løpet av trinnene med invasjon og metastasering er av grunnleggende betydning å utforme bedre terapeutiske strategier for behandling av denne sykdommen.
genuttrykk mikromatriser har dukket opp, og deres utstrakte bruken har ført til identifisering av mulige kandidat gener. Videre undersøkelser av biologiske atferd og betydelig klinisk utfall av disse genene spesielt i HNSCC er av stor interesse. Vi har tidligere etablert en HNSCC cellelinje, MSCC-1, fra lymfeknutemetastase [6]. Videre isolert vi en meget inngripende klone MSCC-Inv1 fra MSCC-1 celler ved å bruke en
in vitro
invasjon analysen enhet [7]. Da vi sammenlignet den transkripsjonelle profilen av overordnede celler (MSCC-1) og en meget inngripende klon (MSCC-Inv1) av mikromatriseanalyse for å identifisere gener som er forskjellige i deres uttrykk [8]. Flere gener ble selektivt uttrykt i meget inngripende klone. Blant disse genene, Periostin (osteoblastspesifikk faktor 2 (fasciclin jeg liker)) var den mest høyt uttrykt gen og den andre var IFITM1 (IFN-indusert trans protein 1). Faktisk viste vi at Periostin og IFITM1 fremmet invasjon både
in vitro Hotell og
in vivo product: [8], [9]. Vi identifiserte også Vingeløse-type MMTV integrasjon nettstedet familie, medlem 5B (Wnt-5b) som den tredje høyt uttrykt gen i MSCC-Inv1. Her vi bekreftet evnen til Wnt-5b for å fremme invasjonen av HNSCC-celler
in vitro.
Videre har vi identifisert matriksmetalloproteinase-10 (MMP-10) som en vanlig oppregulert gen av invasjons fremme molekyler inkludert Periostin , IFITM1 og Wnt-5b. Matriks-metalloproteinaser (MMP) representerer en familie av sink-avhengige proteinaser som er i stand til å nedbryte ECM komponenter som kollagener og proteoglykaner, og de har en rolle i normal utvikling og vevsskade i forskjellige patofysiologiske tilstander som involverer artritt, sårheling og tumorutvikling [10 ]. MMP kan klassifiseres inn i undergrupper, inkludert; kollagenaser, stromelysiner, gelatinaser, og membrantype MMP [11]. Noen medlemmer av MMP er innblandet i den invasjon og metastase i HNSCC slik som MMP-2, membrantype MMP-1 (MT1-MMP) og MMP-9 [12], [13]. Overekspresjon av disse MMP’er er blitt korrelert med invasjon, metastase og dårlig prognose. I denne studien undersøkte vi rollene til MMP-10 i invasjonen av HNSCC.
Resultater
Wnt-5b fremmer invasjonen av HNSCC
Wnt-5b er et medlem av Wnt genfamilien, en gruppe av utskilte glykoproteiner som spiller en viktig rolle i onkogenesen og i flere utviklingsmessige prosesser og utløser intracellulære responser gjennom ulike signalveier. Ved å sammenligne transkripsjons profilen til den overordnede celler og meget inngripende klone av microarray analyse, Wnt-5b var den tredje høyt uttrykt gen i den svært invasive klone etter Periostin og IFITM1. Vi først undersøkt om Wnt-5b var involvert i invasjonen av HNSCC. Jo høyere ekspresjon av Wnt-5b i meget inngripende klon i forhold til de overordnede cellene ble verifisert ved hjelp av RT-PCR (figur 1A). Vi undersøkte uttrykk for Wnt-5b mRNA i seks HNSCC cellelinjer. Wnt-5b mRNA uttrykk ble notert i nesten alle de HNSCC cellelinjene unntatt HSC4 celle (figur 1A). For å klargjøre hvilken rolle Wnt-5b i invasivitet av HNSCC, genererte vi Wnt-5b-overekspresjon celler ved transfeksjon av Wnt-5b inn HSC4 celler uten Wnt-5b uttrykk. Etter å ha fått den stabile klone av Wnt-5b-overekspresjon celler (figur 1B), ble de brukt til å kontrollere invasivitet av
in vitro
invasjon analysen. Wnt-5b overekspresjon betydelig forbedret invasjonen av HNSCC celler
in vitro plakater (figur 1B). For å bekrefte Wnt-5b-forfremmet invasjon av HNSCC celler, undersøkte vi knockdown av Wnt-5b ved hjelp av siRNA i HSC2 celler med høy ekspresjon av Wnt-5b. Behandling av Wnt-5b siRNA redusert ekspresjon av Wnt-5b mRNA og inhiberte signifikant invasjon (figur 1B). Selv Wnt-5b ikke påvirker cellevekst (figur 1C), det betydelig fremmet cellemotilitet av HNSCC celler som demonstrert ved sårheling analysen (figur 1D). Interessant, Wnt-5b siRNA betydelig hemmet cellemotilitet av HNSCC celler (figur 1D). Videre vi sammenlignet genuttrykket profilen mellom kontroll og Wnt-5b-overekspresjon HSC4 celler ved microarray analyse (Data S1). S100A8, SERPINB4, osteopontin og SERPINB3 ble oppregulert og TGF-SS2, ble CDH11 og thrombospondin en nedregulert i Wnt-5b-overekspresjon celler (tabell S1).
A, etter Expression of Wnt- 5b i den svært invasive klone og HNSCC cellelinjer. Uttrykk av Wnt-5b mRNA i MSCC-en, MSCC-Inv1 samt seks HNSCC cellelinjer; HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ho-1-N-1, og Ho-en-U-1 ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR. Uttrykk av Wnt-5a mRNA ble også undersøkt i seks HNSCC cellelinjer. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
B, etter Wnt-5b fremmet invasjonen av HNSCC celler. For generasjon av Wnt-5b-overekspresjon celler, ble Wnt-5b ekspresjonsvektoren transfektert inn HSC4 celler uten Wnt-5b uttrykk. Vi fikk den stabile klone og uttrykk for Wnt-5b ble undersøkt ved Western blotting med anti-Wnt-5b polyklonale antistoff (venstre øvre panel). Vi brukte tom vektor transfekterte celler (tom) som en kontroll. p-aktin-ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting. Den invasivitet av Wnt-5b-overekspresjon celler (høyre øvre panel) ble undersøkt av
in vitro
invasjon analysen. 1,5 x 10
5-celler ble plassert på det øvre rom av cellekulturen innsatsen. Etter 12 timer av inkubasjon ble cellene som gjennomtrenges på nedre side av membranen fiksert i formalin og farget med hematoksylin. HSC2 celler med Wnt-5b uttrykk ble transfektert av Wnt-5b siRNA (siWnt-5b) eller kontroll siRNA (siControl). En kryptert sekvens som ikke viser signifikant homologi med rotte, mus eller humane gensekvenser ble anvendt som en kontroll. Effekten av knockdown ble evaluert ved hjelp av RT-PCR (venstre nedre panel). GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Den invasivitet av Wnt-5b-slått ned celler ble undersøkt av
in vitro
invasjonen assay (høyre nedre panel). Etter 24 timers inkubering ble cellene som gjennomtrenges på nedre side av membranen fiksert i formalin og farget med hematoksylin. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk. * Signifikant forskjellig fra tomme vektor transfekterte celler eller styrer siRNA transfekterte celler på
P
0,01.
C, etter Cell spredning av Wnt-5b-overekspresjon celler og Wnt-5b-slått ned celler. Celler ble sådd ut på 24 brønners plater, og trypsineres cellene ble talt ved celleteller på 0, 2, 4 og 6 dagers. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk.
D, etter Migrering av Wnt-5b-overekspresjon celler og Wnt-5b-slått ned celler. Migrasjon av cellene ble bestemt ved sårheling assay. Ved 24 timer etter å skrape cellene, fase-kontrast (10 x felt) av såret helbredelsesprosessen ble fotografert digitalt med et invertert mikroskop. Avstanden av de viklede områder ble målt på bildene, satt ved 100% for 0 timer, og den gjennomsnittlige prosentandelen av den totale avstand på såret områder ble beregnet. Søylene viser gjennomsnittsverdiene og sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk. * Signifikant forskjellig fra tomme vektor transfekterte celler eller kontrollere siRNA transfekterte celler på
P
. 0,01
MMP-10 er identifisert som et felles mål genet for Periostin, IFITM1 og Wnt -5b overekspresjon
for å identifisere felles målgener for Periostin, IFITM1 og Wnt-5b overekspresjon, sammenlignet vi genuttrykk profiler mellom kontroll HSC2 celler og Periostin-overekspresjon HSC2 celler, kontroll Ca9-22 celler og IFITM1- overekspresjon Ca9-22 celler og kontroll HSC4 celler og Wnt-5b-overekspresjon HSC4 celler (Figur 2A). Som et resultat, ble flere grupper av gener med variable biologiske funksjoner i normal utvikling og i ferd med malignitet funnet å være vanlig i Periostin, IFITM1, og Wnt-5B-overuttrykkende celler (figur 2B). En rekke vanlige målgener med flytende biologiske atferd inkludert celleadhesjon, celleproliferasjon, apoptose, cellesyklus og andre ble identifisert. Gene ontology analyse ble gjort ved hjelp av genet Spring GX programvare for å identifisere de biologiske funksjoner av disse molekylene (figur 2B). Vanlige oppregulert gener mellom Periostin- og IFITM1-overekspresjon, Periostin- og Wnt-5b-overekspresjon og IFITM1- og Wnt-5b-overekspresjon er oppført i tabell S2, S3 og S4, henholdsvis. Flere gener ble den høyt oppregulert blant Periostin-, IFITM1-, og Wnt-5B-overekspresjon HNSCC celler (tabell S5). Blant dem ble stromelysin-2 (MMP-10) inkludert. MMP’er er kjent som en familie av sink-avhengige proteinaser som er i stand til å nedbryte ECM-komponenter, og de har en rolle i tumorutvikling [10]. Men lite er kjent om involvering av MMP-10 i invasjonen og metastasering av kreft celler. Derfor fokuserte vi på MMP-10 som en vanlig oppregulert molekylet indusert av invasjonsrelaterte faktorer av HNSCC og undersøkt sin rolle i invasjonen av HNSCC.
A, etter skjema viser strategi for å identifisere felles mål om invasjons relaterte molekyler. Periostin, IFITM1, og Wnt-5b er identifisert som invasjonen relaterte molekyler ved å sammenligne genuttrykket profilen mellom foreldre (MSCC-1 celler) og en meget inngripende klone (MSCC-Inv1 celler). For å identifisere felles mål for invasjon relaterte molekyler, sammenlignet vi genuttrykk profiler av kontroll vs. Periostin-overekspresjon HSC2 celler, kontroll vs. IFITM1-overekspresjon Ca9-22 celler, og kontroll vs. Wnt-5b-overekspresjon HSC4 celler. Ektopisk ekspresjon nivå av Periostin, IFITM1 og Wnt-5b i hver celler er vist ved RT-PCR. GAPDH ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting.
B, etter flere oppregulert gener ble funnet mellom Periostin og IFITM1, Periostin og Wnt-5b, og Wnt-5b og IFITM1. Ved å bruke Gene ontologi programvare, identifiserte vi de biologiske funksjonene til disse genene. Tabellen viser disse vanlige oppregulert genene som omfatter ulike familier med variable biologiske funksjoner.
Høy uttrykk for MMP-10 er godt korrelert med invasjonen mønstre og metastaser i HNSCC
Vi først undersøkte ekspresjon av MMP-10 i 30 normale orale slimhinnevevet og 116 HNSCC tilfeller ved immunohistokjemi. Kliniske opplysninger fra 116 pasienter inkludert alder, sted, tumor størrelse, invasjon mønster, metastase, tumor stadium, TNM klassifisering, behandling, overlevelse og MMP-10 uttrykket vises i Data S2. For å demonstrere spesifisiteten av antistoffet immunhistokjemisk farging av MMP-10, utførte vi immunhistokjemisk farging uten sekundært antistoff eller uten primært antistoff som en negativ kontroll (figur S1). Høy ekspresjon av MMP-10 ble observert i 89 av 116 (76,7%) HNSCC tilfellene, mens ikke-neoplastisk epitel ikke viste MMP-10 uttrykket (figur 3A). Deretter, sammenlignet vi MMP-10-ekspresjon med invasjon mønster, scene gruppering og lymfeknutemetastaser (tabell 1). Vi brukte Jacobsson klassifiseringssystem (Patterns I-IV) for evaluering av invasjon mønster (figur S2) [14]. Ut av 116 HNSCC tilfeller, 9, 12, 62, og 33 tilfeller viste mønsteret I, II, III og IV, henholdsvis (tabell 1). Interessant var forekomsten av MMP-10 positive tilfeller i et mønster III og IV var signifikant høyere enn i mønsteret I og II (figur 3B). Det er vel kjent at mønstrene III og IV er tilsvarende til dårlig differensiering og høy metastatisk hastighet [14]. Korrelasjonen mellom MMP-10-ekspresjon og invasjon mønster var statistisk signifikant (P 0,001) (tabell 1). Vi har også sammenlignet MMP-10 uttrykk med gruppen iscenesettelse. Førti-ni HNSCC tilfellene var tilgjengelig for scene gruppering (I-IV) i henhold til kriteriene i Japan Society for hode og nakke kreft [15]. De fleste tilfeller (97,1%) viste høy ekspresjon av MMP-10 i avansert stadium gruppe (III og IV), mens 46,7% av tilfellene viste høy ekspresjon av MMP-10 i tidlig stadium gruppe (I og II). Korrelasjonen mellom MMP-10-ekspresjon og scene gruppering var statistisk signifikant (P 0,001) (tabell 1). I tillegg ble MMP-10-ekspresjon signifikant korrelert med lymfeknutemetastaser (P 0,001) (tabell 1 og figur 3B). Twenty-ni av 89 HNSCC tilfeller med høy ekspresjon av MMP-10 hadde lymfeknutemetastaser, mens 5 av 27 HNSCC tilfeller med lavt uttrykk av MMP-10 hadde lymfeknutemetastase (figur 3B). Videre undersøkte vi sammenhengen mellom MMP-10 uttrykk og overlevelse i HNSCC tilfeller. Førtito HNSCC tilfellene var tilgjengelig for overlevelsesanalyse. Interessant, selv om det ikke var noen statistisk signifikans (
P
= 0,21), pasienter med høyt uttrykk av MMP-10 hadde en tendens til å vise dårlig prognose (Figur 3C).
A
Immunhistokjemisk uttrykk for MMP-10 i 116 HNSCC tilfeller og 30 normale epitel. Normal epitelet er fullstendig negative for MMP-10 i forhold til HNSCC tilfeller hvor de fleste tumorceller viste sterkt ekspresjon av MMP-10. Representant tilfelle av lav MMP-10 uttrykk i normal oral epitel og HNSCC saken (Jacobsson klassifikasjon Pattern I), og representative tilfeller av høyt uttrykk av MMP-10 (lav og høy forstørrelse) i HNSCC tilfeller (Jacobsson klassifikasjon Pattern IV) er vist. Scale bar er vist på hvert bilde.
B, etter Sammenheng mellom MMP-10 uttrykk og invasjon og metastasering i HNSCC tilfeller. Venstre graf som viser forholdet mellom MMP-10-ekspresjon og mønster av invasjon. Den Jacobsson klassifisering (Patterns I-IV) ble brukt for evaluering av invasjon mønster (figur S1) [14]. * Signifikant forskjellig fra mønsteret I eller II på
P
0,01. Høyre graf viser sammenhengen mellom MMP-10 uttrykk og metastasering. * Signifikant forskjellig fra lav uttrykk for MMP-10
P
0,01.
C, etter MMP-10 uttrykk og dårlig resultat. Førtito italienske HNSCC tilfellene var tilgjengelig for overlevelsesanalyse. Kaplan-Meier-kurver viser overlevelse av HNSCC pasienter med høyt uttrykk av MMP-10 (•, N = 34) eller lavt uttrykk av MMP-10 (▴, N = 8).
MMP-10 fremmer invasjon av HNSCC
Vi neste undersøkt MMP-10 mRNA og protein i 6 HNSCC cellelinjer fra henholdsvis RT-PCR og Western blot analyse. Høy ekspresjon av MMP-10-mRNA og protein ble observert i Ca9-22, Ho-en-U-en og Ho-1-N-1-celler (figur 4A). I HSC2, HSC3 og HSC4 celler, MMP-10 uttrykk var lav (Figur 4A). MMP-10 protein uttrykk samsvarer mRNA uttrykk nivå. For å undersøke om MMP-10 fremmer invasjonen av HNSCC
in vitro
, genererte vi MMP-10-overekspresjon celler ved hjelp HSC2 og HSC3 celler med lav ekspresjon av MMP-10 (figur 4B). Vi har bekreftet den høyere aktivitet av MMP-10 i kondisjonert medium av MMP-10-overuttrykkende celler ved stromelysin zymografi (figur 4B). Selv MMP-10 overekspresjon ikke påvirke celledeling (data ikke vist), det dramatisk forbedret invasiv aktivitet både HSC2 og HSC3 celler (
P
0,05) (Figur 4C). For ytterligere å bekrefte at MMP-10-mediert invasjon av HNSCC-celler, undersøkte vi knockdown av MMP-10 ved hjelp av siRNA i Ca-9-22 og Ho-1-N-1-celler med høy ekspresjon av MMP-10. For MMP-10 knockdown, brukte vi 3 forskjellige sirnas (# 1, # 2 og # 3). Alle sirnas inkludert cocktail av 3 sirnas redusert MMP-10 uttrykk (Figur S3). Vi brukte cocktail av 3 sirnas i følgende studier. MMP-10 knockdown inhiberte ekspresjon av MMP-10 mRNA og protein i Ca9-22 og Ho-1-N-1-celler (figur 4D). MMP-10 knockdown undertrykte betydelig invasjonen av HNSCC celler (Figur 4E). Tatt alt sammen, disse funnene tyder på at MMP-10 spiller en viktig rolle i invasjonen av HNSCC celler.
A, etter Uttrykk av MMP-10 mRNA og protein i seks HNSCC cellelinjer. Ekspresjon av MMP-10 mRNA i HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ho-1-N-1, og Ho-en-U-1 ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. MMP-10 proteinet uttrykket nivå ble evaluert i de seks HNSCC cellelinjer ved Western blot-analyse. Bilder av kort- og langtidseksponering av MMP-10 protein uttrykk vises. ß-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
B, etter generasjon av MMP-10-overekspresjon celler. Vi har fått flere kloner av transfeksjon med pBICEP-FLAG-merket MMP-10 i HSC2 og HSC3 celler. Ektopisk uttrykk for MMP-10 ble bestemt ved Western blotting med anti-FLAG antistoff (venstre panel). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Enzymatiske aktiviteten til MMP-10 ble påvist ved zymografi stromelysin (høyre panel). Aktiv form av MMP-10 (pil hode) ble detektert i kondisjonert medium av MMP-10-overuttrykkende celler.
C, etter Invasive aktivitet av MMP-10-overekspresjon HSC2 (venstre panel) og HSC3 (høyre panel) celler sammenlignet med tom vektor transfektert HSC2 og HSC3 celler (tom) etter
in vitro
invasjon analysen. Celler ble fiksert etter inkubasjon på 12 timer eller 20 timer i HSC2 celler eller HSC3 celler, respektivt. Figuren viser farget nedre side av membranen hvor gjennomtrengt cellene (øvre panel). Grafene viser antall invaderte celler i MMP-10-overekspresjon og tomme vektor transfektert celler (nedre panel). Søylene viser gjennomsnittsverdiene og sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk. * Signifikant forskjellig fra tom vektor transfekterte celler på
P
0,01.
D, etter MMP-10 siRNA trykt invasjonen av HNSCC celler. Cocktail av 3 forskjellige MMP-10 sirnas ble transient transfektert inn i Ca-9-22 og Ho-1-N-1 celler med MMP-10 uttrykk. En kryptert sekvens som ikke viser signifikant homologi med rotte, mus eller humane gensekvenser ble anvendt som en kontroll. Etter 48 timer med transfeksjon, ble ekspresjon av MMP-10-mRNA og protein undersøkt ved hjelp av RT-PCR og Western blotting (WB), respektivt. GAPDH mRNA og β-aktin-protein ble anvendt som en kontroll lasting. Densitometrisk analyse av MMP-10-ekspresjon ble utført. MMP-10 /GAPDH-forholdet er vist.
E, etter bekjempelse av invasjonen av MMP-10 knockdown i Ca9-22 og Ho-1-N-1 celler. Den invasivitet av MMP-10 slått ned celler ble undersøkt av
in vitro
invasjon analysen sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler. En kryptert sekvens som ikke viser signifikant homologi med rotte, mus eller humane gensekvenser ble anvendt som en kontroll. Etter 24 timers inkubering ble cellene fiksert og antallet invaderte celler ble tellet. Figuren viser farget nedre side av membranen hvor gjennomtrengt cellene (venstre panel). Grafen viser antall invaderte celler (høyre panel). Søylene viser gjennomsnittsverdiene og sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk. * Signifikant forskjellig fra kontroll siRNA transfekterte celler på
P
. 0,01
MMP10 knockdown undertrykker Periostin og Wnt-5b-forfremmet invasjonen av HNSCC celler
våre nåværende funn viste at MMP-10 er en vanlig oppregulert gen blant Periostin, IFITM1, og Wnt-5b overekspresjon. Vi sammenlignet uttrykket av MMP-10 i Periostin, IFITM1, og Wnt-5b-overekspresjon celler med det i kontrollceller. MMP-10 ble funnet å være oppregulert ved Periostin eller Wnt-5b (figur 5A), men ikke ved IFITM1 (data ikke vist). I vår microarray analyse, ble det observert 17,4 ganger økning av MMP-10 uttrykk i Periostin-overekspresjon HSC2 celler og 5,8 ganger økning av MMP-10 uttrykk ble observert i Wnt-5b-overekspresjon HSC4 celler. Derfor har vi undersøkt potensielle rolle MMP-10 i Periostin og Wnt-5b-forfremmet invasjonen i HNSCC. Vi undersøkte effekten av MMP-10 knockdown på invasjonen i Periostin-overekspresjon Ca9-22 celler og i Wnt-5b-overekspresjon HSC4 celler. Uttrykk av MMP-10 protein ble redusert med MMP-10 knockdown i Periostin- og Wnt-5b-overekspresjon celler (figur 5B). Interessant, MMP-10 knockdown undertrykte betydelig den Periostin- og Wnt-5b-promo invasjon (figur 5C), noe som indikerer at MMP-10 kan spille en rolle i den invasivitet drevet av Periostin- og Wnt-5b-overekspresjon i HNSCC. Vi har også undersøkt MMP-10 knockdown i Periostin-overxpressiong HSC2 celler (figur S4). I likhet med Periostin-overxpressiong Ca9-22 celler, MMP-10 siRNA trykt invasiv kapasitet i Periostin-overxpressiong HSC2 celler. I tillegg MMP-10 knockdown vesentlig hemmet invasjonen i kontroll Ca9-22 celler, mens MMP-10 knockdown litt hemmet invasjonen i kontroll HSC2 og HSC4 celler (figur 5C og Figur S4). I Ca9-22 celler, ble høye nivå av MMP-10 ekspresjon observert, men ikke i HSC2 og HSC4-celler (figur 4A). Som Ca9-22 celler viste endogen MMP-10 uttrykk på et høyere nivå, tenkte vi at MMP-10 siRNA trykt invasive kapasiteter gjennom nedregulering av endogen MMP-10 uttrykk i Ca9-22 celler. Graden av hemming av MMP-10 knockdown var mest sannsynlig avhengig av ekspresjonsnivået av MMP-10.
A, etter at ekspresjon av MMP10 mRNA ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR i kontroll CA9 -22 celler, Periostin-overekspresjon Ca9-22 celler, kontroll HSC4 celler og Wnt-5b-overekspresjon HSC4 celler. GAPDH ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting.
B, etter MMP-10 knockdown i Periostin- og Wnt-5B-overekspresjon celler. Cocktail av 3 forskjellige MMP-10 sirnas ble transient transfektert inn Periostin-overekspresjon Ca-9-22 celler og Wnt-5b-overekspresjon HSC4 celler. En kryptert sekvens som ikke viser signifikant homologi med rotte, mus eller humane gensekvenser ble anvendt som en kontroll. Etter 48 timer av transfeksjon, ble MMP-10 proteinnivå undersøkt ved Western blot analyse med anti-MMP-10-antistoff i MMP-10 siRNA transfektert Periostin-overuttrykkende celler. ß-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
C,
invasivitet av MMP-10 siRNA transfekterte Periostin-overekspresjon Ca-9-22 celler (venstre panel) og Wnt-5b-overekspresjon HSC4 celler (panel høyre) ble undersøkt av
in vitro
invasjon analysen. Etter 18 timers inkubering av HSC4 celler og 24 timers inkubering av Ca9-22-celler, ble cellene fiksert og antallet invaderte celler ble tellet. Figuren viser farget nedre side av membranen hvor gjennomtrengt cellene (øvre panel). Grafene viser antall invaderte celler i knockdown og kontrollceller (nedre panel). Søylene viser gjennomsnittsverdiene og sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk. * Signifikant forskjellig fra kontrollen på
P
. 0,01
MMP-10-forfremmet invasjonen er assosiert med p38 hemming
For å vite mekanisme MMP-10 markedsført invasjon, vi observerte aktiviteten av cellesignalisering molekyler slik som p38, FAK, RSK, Akt, Src, og ERK ved western blotting ved anvendelse fosforylering spesifikt antistoff i kontroll og MMP-10 overekspresjon celler. Blant disse molekylene ble p38 inaktivert av MMP-10 overekspresjon (Figur 6A). For ytterligere å bekrefte involvering av p38-hemming i MMP-10-promo invasjon, invasiv evne til kontroll og MMP-10-overuttrykkende celler etter behandling med p38 inhibitor, ble SB203580 undersøkt. Interessant, SB203580 behandling signifikant fremmet invasjonen av kontrollceller med p38 aktivitet (figur 6B). På den annen side, SB203580 behandling ikke fremme invasjonen i MMP-10-overuttrykkende celler uten p38 aktivitet. I tillegg undersøkte vi om en p38 inhibitor reddet blokken av invasjonen indusert av MMP10 knockdown i MMP-10 overekspresjon HSC2 og HSC3 celler. MMP-10 knockdown i MMP-10-overekspresjon celler fremmet invasiv kapasitet etter behandling med p38 inhibitor (figur S5). Men p38 hemmer ikke fullt redde invasiv kapasitet trykkes av MMP-10 siRNA (figur S5). Videre fikk vi bekreftet at tillegg av kondisjonert medium fra MMP-10-overekspresjon celler hemmet p38 aktivitet i HSC2 og HSC3 celler (figur 6C). Vi undersøkte også p38 aktivitet og invasjonen av MMP-10 knockdown i MSCC-Inv1 celler. I MSCC-Inv1 celler, MMP-10 knockdown litt oppregulert p38 aktivitet (figur 6D) og hemmet invasiv aktivitet (figur 6E).
A, etter p38 hemming ble notert i MMP-10 overekspresjon celler. Nivåene av total og fosforylerte formene for p38, FAK, RSK, Akt, Src, og ERK i kontroll og MMP-10 overexpresing celler ved western blotting.
B, etter invasjonen av kontroll og MMP-10 overekspresjon celler etter behandling av p38 inhibitor. Den invasivitet av ble undersøkt av
in vitro
invasjon analysen i tomme vektor transfekterte celler og MMP-10 overekspresjon celler med SB203580 behandling. Tom vektor transfekterte celler ble anvendt som en kontroll. Etter 12 timers inkubering ble cellene fiksert og antallet invaderte celler ble tellet. Figuren viser farget nedre side av membranen hvor gjennomtrengt cellene (øvre panel). Grafene viser antall invaderte celler (nedre panel). Søylene viser gjennomsnittsverdiene og sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk. * Signifikant forskjellig fra tom vektor transfekterte celler uten SB203580 behandling på
P
0,01.
C, etter p38 aktivitet etter behandling med kondisjonert medium fra MMP-10 overekspresjon celler. Betinget media fra MMP-10 overekspresjon HSC2 og HSC3 celler ble samlet etter 48 timer med platekledning. Etter å legge kondisjonert medium for 0, 6, 12 og 24 timer, ble HSC2 eller HSC3 celler samles. Ekspresjon av fosfo-p38 og p38, ble undersøkt ved Western blot-analyse.
D, etter MMP-10 siRNA oppregulerer p38 aktivitet i HNSCC celler. Cocktail av 3 forskjellige MMP-10 sirnas ble transient transfektert inn MSCC-Inv1 celler. En kryptert sekvens som ikke viser signifikant homologi med rotte, mus eller humane gensekvenser ble anvendt som en kontroll. Etter 48 timer med transfeksjon, ble ekspresjon av MMP-10-protein undersøkt ved Western blotting. Nivåene av total og fosforylerte formene for p38 ble også undersøkt ved Western blotting. p-aktin-ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting.
E, etter bekjempelse av invasjonen av MMP-10 knockdown i MSCC-Inv1 celler. Invasive ble undersøkt av
in vitro
invasjon analysen. Etter 6 timers inkubering ble cellene fiksert og antallet invaderte celler ble tellet. Figuren viser farget nedre side av membranen hvor gjennomtrengt cellene (øvre panel). Grafen viser antall invaderte celler (nedre panel). Søylene viser gjennomsnittsverdiene og sikkerhetsdatablad av tre uavhengige forsøk. * Signifikant forskjellig fra kontrollen på
P
. 0,01
Diskusjoner
invasjon og metastasering er det store problemet, og den største hindringen for behandling av HNSCC. Derfor er det viktig å identifisere nye molekyler som er involvert i den invasjon og metastasering av HNSCC. Vi identifiserte flere invasjonsrelaterte gener ved å sammenligne genuttrykk profiler mellom foreldre celler og en meget inngripende klone [8]. Periostin og IFITM1 ble identifisert som den høyeste gener i en meget inngripende klone og deres engasjement i invasjonen ble bekreftet av
in vitro Hotell og
in vivo
studier [8], [9]. Her viste vi at Wnt-5b fremmet invasjonen av HNSCC celler (figur 1). Så langt er det bare én rapport som Wnt-5b er oppregulert i kreftcellelinjer og lite er kjent om rollen Wnt-5b i kreft [16].
