Abstract
Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er en angiogen mitogen involvert i å fremme tumor angiogenese inne i kroppen. VEGF er en nøkkel protein som er nødvendig for progresjon av tumoren fra godartet til ondartet fenotype. I denne studien undersøkte vi bindingsaffiniteten til en på forhånd valgt 26-mer-DNA-sekvens aptamer (SL
2-B) mot heparinbindende domene (HBD) av VEGF
165 protein. SL
2-B ble først kjemisk modifisert ved innføring av fosfortioat-bindinger (PS bindinger). Deretter ble overflate-plasmonresonans (SPR) spektroskopi og sirkulær dikroisme (CD) anvendt for å bestemme bindingsaffiniteten, spesifisitet og for å utlede den konformasjon av PS-modifisert SL
2-B-sekvens. Til slutt ble antiproliferative aktivitet av den modifiserte SL
2-B-sekvens på Hep G2 kreftceller undersøkt. Våre resultater viser en markant forbedring i biostability av SL
2-B sekvensen etter PS modifisering. Den modifiserte SL
2-B-sekvens oppviser også forbedret antiproliferativ aktivitet mot Hep G2 kreftceller i hypoksi forhold. I tillegg er modifisert SL
2-B-sekvens inhiberer ekspresjon av taggete-1-protein, som er en av ligandene til VEGF koblede delta /taggete lyd signalveien
relasjon:. Kaur H, Li JJ, Bay BH, Yung L-YL (2013) Gransker antiproliferative aktivitet av høy affinitet DNA Aptamer på kreftceller. PLoS ONE 8 (1): e50964. doi: 10,1371 /journal.pone.0050964
Redaktør: Antonio Facchiano, IDI, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia
mottatt: 02.05.2012; Godkjent: 29 oktober 2012; Publisert: 16 januar 2013
Copyright: © 2013 Kaur et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Singapore Ministry of Education Akademisk forskningsfond Tier 2 tilskuddet MOE2008-T2-1-046 og Tier 1 tilskuddet R279000282112. Forfatterne har også verddoktorgradsstipend (for H.K.) fra NUS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en av de viktigste årsakene til dødsfall på verdensbasis, og sto for 7,6 millioner dødsfall i 2008 [1], [2]. I USA alene, ca 1 av 4 mennesker dør på grunn av kreft [3]. For tiden, monoklonale antistoffer er en av de mest avanserte terapeutiske midler for behandling av kreft i markedet. Flere FDA godkjent monoklonalt antistoff narkotika, for eksempel bevacizumab (handelsnavn: Avastin) mot vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) i kolorektal, lunge og nyre kreft behandling, trastuzumab (handelsnavn: Herceptin) mot HER2 /neu-reseptoren i behandling av brystkreft og cetuximab (handelsnavn: Erbitux) mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) i metastatisk kolorektalcancer, hode og nakke kreft, har blitt utviklet og brukes enten som monoterapi eller i kombinasjon med andre legemidler og stråling for kreftbehandling [4 ] – [12]
i 1990, en
in vitro
utvelgelsesprosessen kalles systematisk utvikling av ligander ved eksponentiell berikelse (SELEX) ble utviklet for å skjerme enkelt strandet nukleinsyremolekyler fra tilfeldig pool av. bibliotek mot målligand [13], [14]. Disse klassene av single strandet molekyler omtales som «aptamerer». De har høy bindingsaffinitet og spesifisitet som er sammenlignbare med monoklonale antistoffer. I tillegg er den lille størrelsen, ikke-immunogenisitet og enkel modifikasjon sammenlignet med konvensjonelle monoklonalt antistoff gjør aptamerer attraktive for terapeutisk anvendelse [15]. Basert på lovende resultater i prekliniske studier, to kreft målretting aptamerer, ACT-GRO-777 (eller AS1411) – en G-rik DNA aptamer målretting nucleolin for behandling av akutt myelogen leukemi (AML) og NOX-A12 L-RNA aptamer målretting CXCL12 for behandling av multippel myelom og lymfom er allerede i kliniske studier [16], [17].
en sjef problem som oppstår i den terapeutiske anvendelsen av aptamerer er deres ustabilitet under
in vitro
og
in vivo
forhold [18]. De er utsatt for enzymatisk nuklease-angrep på de cellulære og serum fluider. For å omgå dette problemet, har flere kjemisk modifikasjon strategier er ansatt for å forbedre sin motstand mot nukleaser og for å forlenge opplaget halveringstid i biologiske væsker. Slike kjemiske modifikasjoner innbefatter inkorporering av fosfortioat-bindinger (PS bindinger) eller låste nukleinsyrer (LNAs), tilsetning av funksjonelle grupper slik som amino (-NH
2), fluor (-F),
O
metyl (-OCH
3) i 2′-stillingen av ribose sukker, og konjugering til høy molekylvekt polyetylenglykol (PEG) eller kolesterol [19] – [25]. Studier har vist at, sammenlignet med den ikke-modifiserte versjonen, de kjemisk modifiserte aptamerer utviser ikke bare lengre levetid i det biologiske miljøet, men noen ganger også bedre bindende affinitet og spesifisitet til sine mål [21], [26].
VEGF er en avgjørende angiogene mitogen overuttrykt i tumorcellene og induserer deres migrasjon, overdreven spredning, invasjon og metabolismen i kroppen. VEGF er ansett for å være kjennetegnet protein for tumor angiogenese, og har vært forbundet med neoplastisk transformasjon av celler i kroppen [27]. Det er generelt antatt å bli utskilt av endotelceller til å stimulere deres proliferasjon og migrasjon. Tidligere rapporter tyder imidlertid på at ulike karsinom og ondartede mesothelioma cellelinjer også skille ut dette proteinet [28] – [31]. VEGF
165 er den dominerende isoform av VEGF-A-proteinet, et av medlemmene av VEGF-familien, og først og fremst binder seg til sine to tyrosin-kinase-reseptorer VEGFR-1 /Flt-1 og VEGFR-2 /KDR /FLK -1 med meget høy affinitet, og til bestemte ko-reseptor neuropilins [27]. Den mitogene signalisering, og celle-proliferasjon i tumorceller er indusert ved ekspresjon av VEGFR-2 [32], [33]. I kontrast, aktivering av VEGFR-1 resultater i celle invasjon og cellemigrasjon, men ikke celleproliferasjon [34] -. [36]
I vår forrige undersøkelse, en 26-mer DNA aptamer mot heparin-bindende domene (HBD ) av VEGF
165-proteinet (også omtalt som SL
2-B) ble erholdt ved bruk av stammesløyfe avkutting strategi [37]. Sammenlignet med den opprinnelige untruncated aptamer, SL
2-B aptamer utstilt mer enn 200 ganger økning i bindingen affinitet til VEGF
165 protein. Heri vi modifisert SL
2-B aptamer ved å inkorporere fosfortioat (PS) -bindinger, testet dets bindende affinitet, spesifisitet, biostability, sekundærstruktur og potensialet heten av PS-modifiserte SL
2-B aptamer så antagonist på proliferasjonen aktiviteten av kreftceller. Vi har vist at, sammenlignet med umodifisert SL
2-B aptamer, PS-modifiserte SL
2-B aptamer er en forbedret sekvens når det gjelder serumstabilitet og antiproliferative aktivitet uten å ofre den bindende affinitet og spesifisitet for VEGF
165 protein.
Materialer og metoder
Material
HPLC renset oligonukleotid (både umodifisert og PS-modifisert) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Det rekombinante humane bæreren fri VEGF
165 (molekylvekt på 38 kDa, pl = 8,25) og VEGF
121 (molekylvekt på 28 kDa, pl = 6,4) proteiner ble kjøpt fra R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant ved hjelp av t-test
diskusjon
Resultater og
Binding Analyse av PS-modifisert SL
2-B Aptamer og VEGF Complex av. Surface plasmonresonans (SPR)
Som tidligere rapportert i vår studie, den umodifiserte SL
2-B aptamer vises en K
d = 0,5 nM til heparin bindende domene (HBD) av VEGF
165-protein bestemt ved hjelp av SPR-teknikk (tabell 1) [37]. Den umodifiserte aptamer, men oppviste lav strukturell stabilitet i de cellulære betingelser. Dette er på grunn av tilstedeværelsen av eksonukleaser og endonukleaser i biologiske væsker som nedbrytes de aptamerer ved hydrolysering av fosfatesterbindingen i ryggraden [19]. For å avhjelpe dette problemet, i denne studien, SL
2-B aptamer ble kjemisk modifisert med phosphorothioate (PS) leddene ved 5 «og 3’endestasjonen (tabell 1) for å beskytte SL
2-B aptamer fra eksonukleo-lytisk fordøyelsen. PS-modifikasjon omfatter substitusjon av brodannelse fosforyl oksygen i fosfodiester binding av svovel-atom. Siden det overskytende inkorporering av PS bindinger fører til ikke-spesifikk binding, og kan forstyrre den aptamer konformasjon og dets interaksjon med målet, ble den modifikasjon innført bare ved aptamer termini [38].
K
d verdi for PS-modifisert SL
2-B aptamer ble bestemt ved bruk av SPR teknikk ved forskjellige aptamer konsentrasjoner (figur 1 og Tabell 1). K
d verdi for PS-modifiserte SL
2-B ble funnet å være 0,56 nM, som er lik K
d for umodifisert SL
2-B. Vi presenterer PS-modifikasjon synes ikke å påvirke bindingsaffiniteten til SL
2-B aptamer. Videre er affiniteten av PS-modifisert SL
2-B er lik den FDA godkjent humanisert anti-VEGF monoklonalt antistoff «bevacizumab» (K
d ~ 0,5 nM) anvendt for kreftbehandling [4].
Spesifisitet av PS-modifisert SL
2-B Aptamer Sequence
VEGF
165 så vel som andre VEGF-isoformer, som for eksempel VEGF
189 og VEGF
206, genereres fra spleising av et enkelt gen VEGF som deler en carboxyl-terminal heparin-bindende domene (HBD) av 50-rester, og binder seg til heparin med forskjellige bindingsaffiniteter [27], [39], [40]. HBD er ansvarlig for å øke interaksjonen av VEGF med sine reseptorer (VEGFR-1 /Flt-1 og VEGFR-2 /KDR /Flk-1) og de spesifikke ko-receptor neuropilins å utløse den angiogene responsen i ondartede celler [41].
VEGF
121, men deler ikke HBD som andre VEGF isoformer og kan brukes som en kontroll for HBD bindende spesifisitet studien. SPR sensorgram i figur 2 viser at sammenlignet med VEGF
165 protein ved samme aptamer konsentrasjon (80 nM), responssignalet fra PS-modifisert SL
2-B binding til VEGF
121 protein var svak og viste en høy K
d verdi på 17 uM. Dette indikerer at PS modifikasjon ikke reduserer bindingsspesifisiteten til SL
2-B aptamer mot HBD signifikant (K
d = 17 uM for PS-modifisert SL
2-B mot VEGF
121, K
d = 10 mm for umodifisert SL
2-B mot VEGF
121). Sammenlignet med «bevacizumab» monoklonalt antistoff som binder seg til alle isoformer av VEGF, PS-modifiserte SL
2-B er spesifikk for HBD av VEGF
165 protein [4]. Siden VEGF-A er involvert i normale fysiologiske prosesser, så som dannelsen av nye blodkar og sårheling prosess, kan den fullstendig inhibering av VEGF-proteinet påvirker opprettholdelsen av den normale vaskulære system i kroppen [42], [43]. Derfor kan hemning av spesifikk VEGF-protein (for eksempel VEGF
165 i dette tilfellet) være et bedre terapeutisk tilnærming.
punkt A til B tilsvarer krets fase og punkt B til C svarer til dissosiasjon fase i begge sensorgrams. Vist her er PS-modifisert SL
2-B aptamer binding med VEGF
165 protein (K
d = 0,56 ± 0,44 nM) og VEGF
121 protein (K
d = 17 ± 1,24 mm) på 80 nM aptamer konsentrasjon.
Stabilitet av SL
2-B Aptamer mot nukleaser i serum som inneholder Medium
for å teste biostability av umodifisert og PS modifisert SL
2-B aptamer mot nukleaser til stede i de biologiske væsker, begge aptamerer ble inkubert med 10% FBS for forskjellige tidsperioder. Basert på resultatene, det umodifiserte SL
2-B nedbrytes med 50% i løpet av 24 timers inkubering i serum (figur 3). På den annen side, PS-modifiserte SL
2-B vist god stabilitet, med mer enn 90% aptamer intakt etter 72 timers inkubering i serum. Dataene viser viktigheten av PS bindinger i SL
2-B-sekvens termini, som beskytter aptamer-sekvensen fra eksonuklease angrep.
aptamerer ble inkubert med 10% FBS ble oppløst i DMEM-medium ved 37 ° C for ulike tidspunkt og andelen av intakt aptamer ble bestemt ved måling av bandet densitet etter å ha kjørt denaturerende PAGE. Fylt kolonner PS-modifisert SL
2-B, mens åpne kolonner er umodifisert SL
2-B.
Structural Analysis av sirkulærdikroismeanalyse (CD) spek
Strukturelle studier har vist virkningen av konformasjonen på bindingsaffiniteten og spesifisiteten av aptamer for dens target [44]. Hvis konformasjonen forandrer seg med temperatur, deretter bindingsaffiniteten resultatene oppnådd fra SPR-spektroskopi (gjennomført ved 25 ° C) kan ikke være representative i
in vitro assays
(utført ved 37 ° C). Således ble den sekundære konformasjonen til PS-modifiserte SL
2-B aptamer undersøkt. Positive maxima topper ble registrert ved 260 nm og 220 nm, så vel som en negativ minima topp ved 240 nm og ytterligere liten skulder topp ved 290 nm (figur 4). Basert på tidligere rapporter, slike spektre reflekterer en typisk hårnål stilk-løkke konformasjon [45]. Siden ble det ikke observert noen endring i spektrene mellom 25 ° C og 37 ° C, bekrefter dette bevaring av den sekundære konformasjon ved SPR betingelser (25 ° C), hvor K
d til aptamer ble bestemt og ved fysiologiske betingelser (37 ° C). Imidlertid ikke CD-spektroskopi gir ikke fullstendige og validert informasjon om strukturen. Avanserte teknikker slik som kjernemagnetisk resonans (NMR) og røntgen-krystallografi er nødvendig for ytterligere dybdestrukturanalyse.
iM PS-modifisert SL
2-B aptamer i fosfatbuffer saltvann (PBS) buffer, pH 7,2. Spektra ble målt ved 25 ° C (heltrukket linje) og 37 ° C (stiplet linje).
antiproliferativ aktivitet analysen
antiproliferative eiendom SL
2-B aptamer ble undersøkt ved anvendelse av HEP G2 kreftceller i hypoksi forhold. Tidligere studier har vist at ekspresjon av VEGF-proteinet forsterkes i Hep G2-celler under hypoxi betingelser [46]. Siden ingen signifikant effekt på celleformering ble observert ved 24 og 48 timer, både umodifisert og modifisert PS-SL
2-B-aptamerer ble testet for 72 timers varighet. Som vist i figur 5, var nedre celleformering observert ved 15 uM modifiserte SL
2-B-konsentrasjonen etter 72 timer med aptamer behandling (52 ± 2,1%). Imidlertid, ble ingen reduksjon i celleformering observert som ytterligere øker aptamer konsentrasjon til 20 uM. En mulig forklaring for reduksjon i celleformering kan være at enten det overskytende binding av modifisert SL
2-B-sekvensen til VEGF
165-proteinet til slutt hindrer interaksjonen av proteinet til VEGFR-2 (eller KDR /Flk -1) reseptoren, noe som påvirker cellulær proliferasjon. Eller aptamer etter binding med VEGF protein bindes med VEGFR-2, gjennomgår cellulær internalisering og forstyrrer nedstrøms VEGF knyttet intracellulære signalveier. Resultatet viser også at VEGF-proteinet kan være involvert i proliferasjon av undersøkte Hep G2 kreftceller under hypoxi betingelser. Tvert imot, har det umodifiserte SL
2-B aptamer-sekvensen ikke utviser signifikant inhiberende aktivitet på cellulær proliferasjon. Dette kan være på grunn av nedbrytning av umodifiserte sekvensen ved nuklease enzymer i media før å uttale sin effekt på kreftcellene.
Sekvensen spesifisitet ble bestemt ved bruk av egge sekvens for PS-modifisert SL
2 B for hvert datapunkt ved samme konsentrasjon til den modifiserte SL
2-B. Heltrukken linje er PS-modifisert SL
2-B, er stiplet linje umodifisert SL
2-B, og stiplede linjen er kryptert sekvens.
For å vise at antiproliferative effekt av PS -modifisert SL
2-B aptamer er spesifikk sekvens, ble et omkastet rekkefølge tilsatt til Hep G2-celler i samme konsentrasjon som PS-modifisert SL
2-B (figur 5). Resultatene viste minimal reduksjon på celleproliferasjon med det forvrengte sekvensen, noe som bekrefter at den hemmende virkning på VEGF
165 proteinaktivitet etter PS-modifisert SL
2-B ble sekvensspesifikk i Hep G2-celler. Sekvensen spesifikk inhibering ble også bekreftet av celletall og morfologiske forskjeller som er presentert i mikrofotografier (figur 6). Som vist i figur 6A og 6B, blir cellene behandlet med modifisert sekvens har merkbart færre celler sammenlignet med det forvrengte sekvens hvor det synes å være flere celler pr vis og pakket tett til hverandre. Videre, under samme forstørrelse, vises morfologien av cellene behandlet med den modifiserte sekvensen lengre og tynnere med mange sidefremspring som sammenlignet med det forvrengte sekvens, som er mer kantete og mer definert i formen (figur 6C og 6D). Disse funnene indikerer potensialet i PS-modifiserte SL
2-B aptamer sekvens i inhibering av Hep G2 kreftceller spredning sterkt og spesifikt.
Lav forstørrelse riss av (A) modifisert sekvens behandling, (B ) kryptert sekvens behandling på Hep G2-celler etter 72 timer under hypoxi tilstand. Scale bar = 200 mikrometer. Lukke opp visninger av (C) modifisert sekvens behandling, (D) kryptert sekvens behandling på Hep G2-celler etter 72 timer under hypoxi tilstand. Cellulær morfologi er forskjellig på de forskjellige behandlinger; modifisert sekvens behandling produserer celler som er tynnere med flere cellulære fremspring mens det forvrengte sekvensen behandling viser celler som vises nærmere til de ubehandlede Hep G2-celler. Scale bar = 50 mikrometer.
For å bestemme celledød mekanismen i Hep G2 celler ble annexin V apoptose analyse utført og analysert ved hjelp av flowcytometri. I figur 7A ble R9 og R11 kvadrant cellene i flow-cytometri scatterplot telles og uttrykkes som prosentandelen av celler i slutten og begynnelsen av apoptose fase hhv. Tidlig apoptotiske celler omfatter cellepopulasjon som er annexin V positive bare (R11), og sen apoptotiske celler omfatter cellepopulasjon som er både annexin V og PI positive (R9). Den apoptose Analysen viste økt andel av celledød med modifisert sekvens, sammenlignet med det forvrengte sekvens behandling i slutten av apoptose fase (figur 7B, p-verdi 0,05). Imidlertid er prosentandelen av celler som gjennomgår apoptose sen var ikke veldig høy, og ble ikke observert noen signifikant forskjell i celletall mellom modifisert og egge sekvens i tidlig fase apoptose (figur 7C). Dette resultatet indikerer at i tillegg til apoptose, kan andre ikke-apoptotisk celledød mekanisme for eksempel begynnende alderdom være involvert i induksjon av celledød i Hep G2 celler.
(A) Et spredningsplott som viser fordelingen av celler med annexin V flekker langs x-aksen og de som er farget med propidiumjodid (PI) langs y-aksen. Region R10 betegner levedyktig bestand (dobbel negativ for annexin V og PI), R9 de ikke-levedyktige celler (dobbel positivt for annexin V og PI) viser R11 den annexin V positive (PI negative) befolkningen mens R8 er de skadede celler ( PI positiv men annexin-V-negative). (B)% Histogram av K9 kvadrant data. Analysen av triplikate prøver for viste en signifikant høyere mengde av døde celler (p-verdi & 0,05) i den modifiserte sekvensen behandling i forhold til det forvrengte sekvensstyringen. (C)% Histogram av R11 kvadrant data. Resultatene viser ingen signifikant forskjell for tidlig apoptose. Feilfelt = SEM.
For å bekrefte antiproliferative evne til PS-modifisert SL
2-B aptamer, vi undersøkte videre effekten med MCF-7 celler og HCT-116 celler ettersom eksisterende litteratur har vist at de også viser økt ekspresjon av VEGF-proteinet i hypoksi betingelser [47], [48]. En 15 uM modifisert SL
2-B-konsentrasjon ble anvendt i denne studien, men resultatene viste at både MCF-7 og HCT-116-cancerceller vises bare 23 ± 3,2% og 9 ± 1,8% reduksjon i celleformering ble observert respektivt . Basert på disse resultatene celleproliferasjon, effekten av PS-modifisert SL
2-B-sekvens på celleproliferasjon er antatt å være celletypespesifikk. Siden antiproliferativ effekt på MCF-7 og HCT-116 kreftcellene var ikke veldig stor, ble de ikke brukt for videre studier under. Andre antiproliferative studier på ulike kreftcelletyper bør gjennomføres for å avdekke potensielle terapeutiske mål og å identifisere faktorer ansvarlig for celle spesifikk antiproliferative aktivitet av denne aptamer.
flowcytometrisystemer og Western Blot analyse av Jagged-1 Protein Expression
Notch signalering er et evolusjonært konserverte signalveien berører mange cellulære prosesser som celle-skjebne besluttsomhet, differensiering, proliferasjon og overlevelse. Fem Notch ligander (Jagged-1, Jagged-2, Delta-1, Delta-3, og Delta-4) og fire hakk reseptorer har blitt godt etablert i pattedyr [49], [50]. Bevis indikerer biokjemiske sammenhengen mellom VEGF og delta /rufsete lyd trasé aktivering, og sammen begge er involvert i å fremme tumorprogresjon [51], [52]. I denne sammenhengen, er VEGF pathway viktig for initiering av tumor angiogenese og fungerer som den oppstrøms aktiverende stimulus, mens hakk signalering som virker på nedstrøms av VEGF vei, bidrar til å svare på aktiverende stimulus og forme aktivering ved å gjøre cellen skjebne avgjørelser [ ,,,0],49].
