Abstract
metastatisk kolorektalcancer (mCRC) er avhengig av avløsning av aggressive maligne celler fra den primære svulsten i blodet, og concordantly, den nærværet av disse sirkulerende tumorceller (CTC) er assosiert med en dårlig prognose. I dette arbeidet ble molekylær karakterisering av CTC fra mCRC pasienter nærmet seg, med sikte på å forstå deres biologi og forbedre deres kliniske nytte i forvaltningen av pasienter med kolorektal kreft. For dette ble EpCAM basert immunoisolering av CTC kombinert med hele transkriptom forsterkning og hybridisering på cDNA mikromatriser. Genuttrykk data fra mCRC pasienter, når bakgrunn av uspesifikk immunoisolering fra en gruppe av kontroller var blitt trukket fra, resulterte i 410 gener som er kjennetegnet CTC befolkningen. Bio ble anvendt for biologisk tolkning av dataene, avsløre at CTC er preget av gener relatert til celle bevegelse og adhesjon, celledød og proliferasjon, og cellesignalisering og interaksjon. RTqPCR på selvstendig serie mCRC pasienter og kontroller ble anvendt for validering av en rekke gener relatert til de viktigste cellulære funksjoner som kjennetegner den CTC befolkningen. Sammenligning mellom primær karsinomer og lunge og levermetastaser ytterligere involvert CTC-gener i markedsføringen av metastasering. Videre er korrelasjonen av CTC-genekspresjon med kliniske parametre demonstrert deteksjon og prognose betydning. I konklusjonen, molekylær karakterisering av CTC fra mCRC pasienter og identifisering av diagnostiske og prognostiske biomarkører representerer en nyskapende og lovende tilnærming i den kliniske behandlingen av denne type pasienter
Citation. Barbazan J, Alonso-Alconada L , Muinelo-Romay L, Vieito M, Abalo A, Alonso-Nocelo M, et al. (2012) Molekylær karakterisering av sirkulerende tumorceller i Human metastatisk kolorektalcancer. PLoS ONE syv (7): e40476. doi: 10,1371 /journal.pone.0040476
Redaktør: Xin Wei Wang, National Cancer Institute, USA
mottatt: 17 januar 2012; Akseptert: 8. juni 2012; Publisert: 10. juli 2012 |
Copyright: © 2012 Barbazan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis finansiert av det spanske helsedepartementet (CP08 /00 142) og EU-kommisjonen Program Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. J. Barbazan og L. Alonso-Alconada er mottakere av stipend fra det spanske departementet for utdanning og forskning, og den baskiske regjeringen (Spania), henholdsvis. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er den tredje vanligste diagnosen kreft hos menn og den andre hos kvinner, med over 1,2 millioner nye krefttilfeller anslått å ha skjedd i verden i 2008 [1]. Klinisk, fjernt tumor spredning og metastasering er de viktigste faktorene i prognose: mens ikke-invasiv stadium I karsinom presentere en 90% fem års overlevelse, scene IV karsinom med fjernmetastaser korrelerer med et dramatisk fall til en 10% overlevelse [2 ]. Følgelig nye terapeutiske strategier som forbedrer effekten mot metastatisk sykdom og nøyaktige biomarkører for oppfølging av CRC pasienter er store utfordringer, sammen med tidlig oppdagelse og screening i høyrisikogrupper.
spredning av kreft er avhengig av løsgjøring av aggressive maligne celler fra den primære tumor i blodstrømmen som en hovedkilde for ytterligere metastase [3]. Det er allment akseptert at Sirkulasjonstumorceller (CTC) egen eller tilegne seg evnen til å unngå vertens immunsystemet og for å nå et fjernt organ, vanligvis lever i CRC, hvor de etablere en sekundær tumorvekst stedet i en svært ineffektiv, men dramatisk prosess [4]. Concordantly har tilstedeværelsen av CTC i perifert blod er assosiert med dårlig prognose i forskjellige typer kreft, inkludert CRC [5], [6]. Som presumptive grunnleggere i generering av metastaser, er CTC bli en interessefelt, og forståelsen av deres biologi kan åpne nye perspektiver i onkologi. Når det gjelder deres molekylære karakterisering, i de siste årene har en rekke grupper er presentert ekspresjonsdata rettet mot ulike gener eller signalveier i forbindelse med kreft for forbedring av sensitiviteten og spesifisiteten til påvisning [7], [8]. Smirnov et al. nærmet profilering av CTC gjennom en diverse bryst, prostata og tykktarmsmetastatisk perspektiv [9]. I tillegg er data som kommer på muligheten av å studere biologi og verktøyet for å evaluere målrettet terapi basert på den genomiske profilering av CTC [10], [11].
I dette tilfellet er definert av en begrenset effektivitet av dagens kjemoterapi i behandling av metastatisk CRC (mCRC) og CTC som sentrale aktører i forvaltningen av metastatisk sykdom, ble bestemt molekylær profilering av CTC befolkningen nærmet seg. Kombinasjonen av CTC EpCAM-baserte immunoisolering og nøyaktig ekstraksjon av RNA fra svært lite antall CTC pluss hel transkriptomet forsterkning, har gjort det mulig å hybridisere cDNA fra CTC populasjonen på gen-ekspresjon mikromatriser. Ved å bruke denne fremgangsmåten til en gruppe av mCRC pasienter sammenlignet med bakgrunnen av uspesifikke isolerte hematopoetiske celler, ble populasjonen av immunoisolerte CTC profilert spesielt. I tillegg til den molekylære karakterisering av CTC for forståelsen av biologien til en viktig kilde til metastaser i CRC, disse dataene gitt potensielle terapeutiske mål og diagnostiske /prognostiske biomarkører.
Resultater
CTC immunoisolering og molekylær Profilering
prosedyrene for CTC immunoisolering, RNA ekstraksjon og forsterkning for hybridisa; sjon på cDNA mikromatriser er avbildet i figur 1A. Kort fortalt CTC ble immunoisoleres fra 7,5 ml perifert blod fra scenen IV mCRC pasienter (n = 6, Tabell S1). Magnetiske kuler ble brukt, som var belagt med et monoklonalt antistoff mot humant Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM), et overflatemolekyl sterkt uttrykt i epitel-opprinnelse tumorer så som CRC. RNA fra isolerte CTC ble renset ved hjelp av en kit spesielt utviklet for lav overflod prøver. Parallelt ble den samme protokoll anvendes på blodprøver fra friske donorer (n = 3) for å bestemme grunnlinjen for bakgrunnen fra uspesifikke ikke-CTC immunoisolering. Forut for genekspresjon analyse, ble nærværet av isolerte CTC bekreftet ved direkte immunofluorescens visualisering ved hjelp av en cocktail av antistoffer mot cytokeratins 8, 18 og 19 (figur S1), og ved en kombinasjon av to biomarkører validert for nøyaktig kvantifisering av CTC i mCRC pasienter (GAPDH-CD45; [12]) (Mann-Whitney U, p-verdi 0,05) (figur 1B). Videre er nøyaktigheten av metoden som er vurdert som utvinningsgraden under immunoisolering resulterte i en median på 91,56% (Methods S1).
(A) Skjematisk representasjon av fremgangsmåten anvendt for CTC molekylær karakterisering. CTC ble isolert fra 7,5 ml perifert blod ved immunomagnetisk separasjon ved anvendelse av anti-EpCAM belagte magnetiske kuler. Isolerte celler ble utsatt for en RNA-ekstraksjon etterfulgt av en hel transkriptomet amplifikasjonsprosessen (WTA). Endelig forsterket cDNA ble hybridisert på Agilent genuttrykk arrays. (B) GAPDH-CD45 nivåer i kontroller og mCRC pasienter målt ved real time PCR. Horisontale stenger representerer medianverdien for hver gruppe (* p 0,05). (C) Spearman korrelasjonsanalyse mellom GAPDH-CD45 nivåer hentet både fra post-array-data og qPCR tidligere til WTA forsterkning. (D) SAM analyse utgang graf som viser genuttrykk forskjeller mellom gruppen av pasienter og kontroller. Dots uthevet tilsvarer gener med statistisk signifikante økte nivåer av uttrykk i gruppen av pasienter i forhold til kontroll bakgrunn, blir ansett for å karakterisere CTC befolkningen fra mCRC.
For å karakterisere CTC befolkningen isolert fra mCRC pasienter, metodikk beskrevet av Gonzalez-Roca et al. ble tilpasset, for nøyaktig genekspresjon profilering av svært små cellepopulasjoner [13]. I utgangspunktet renset RNA ble videre behandlet med DNaseI, amplifisert ved å bruke WTA2 hele transkriptomet amplifikasjonsmetoden, og komplementære DNA ble merket og hybridisert på Agilent uttrykk arrays (figur 1A) (Gene Expression omnibus, GEO Accession nummer:. GSE31023). Etter den første pre-prosessering av rådata, ble et gjennomsnitt på 21,070 flekker filtrert i henhold til de kriterier som er beskrevet i Materialer Metoder, som representerte 47,35% av plassene i microarray med maksimalt 32 443 og minimum 13 247. Ved filtrering, den% variasjonskoeffisient (CV) for replikerte prober varierte fra 5,98% til 12,13%. Normalisering innenfor hver mikroarray ble utført ved anvendelse av Loess metoden, som går ut på at de fleste genene i mikromatriser ikke blir uttrykt forskjellig i forhold til kontrollen, slik at normaliseringen mellom alle microarray data ble utført ved Aquantile fremgangsmåten implementert i Limma pakke av R statistisk programvare. Denne metoden sørget for at A-verdier (gjennomsnittlig intensiteter) hadde samme empiriske fordelingen over mikromatriser mens forlate M-verdier (log-forholdstall) uendret. Korrelasjonsanalyse av RTqPCR GAPDH-CD45 nivåer før og etter forsterkning indikerte en robust linearitet under prosessen med transkriptomet forsterkning (Spearman koeffisient: 0,8667; p-verdi 0,005). (Figur 1C)
Det neste trinn er involvert gen-uttrykk profilering av CTC isolert fra mCRC pasienter på bakgrunn av forurensende celler under immunoisolering. For dette ble normalisert gen-uttrykk intensiteter fra mCRC pasienter og fra den gruppe av kontroller behandlet ved hjelp MeV (MultiExperiment Viewer) programvare (se Metoder S1). Resultatene oppnådd fra friske kontroller signaler ble betraktet som bakgrunn fra ikke-spesifikt isolerte blodceller, som var hovedsakelig lymfocytter. Den oppnådde fra mCRC pasienter signal representert summen av denne ikke-spesifikk bakgrunn pluss det spesifikke gen-ekspresjon mønster av CTC. Ved å subtrahere denne bakgrunn ble det forurensende ikke-CTC befolkning fjernet, og de resulterende gener som viser statistisk signifikant ekspresjon ble ansett for å karakterisere populasjonen CTC fra mCRC pasienter (figur 1A). Concordantly, alle vesentlige genene presentert positivt uttrykk i mCRC pasienter ved subtraksjon av bakgrunnen fra friske donorer (figur 1D), som var konsistent med nærværet av CTC bare i mCRC prøvene. Denne strategien førte til identifikasjon av en sluttherdning av 410 gener som var spesifikke for den CTC populasjonen (tabell S2), med hierarkisk klyngeanalyse klart å skille mellom mCRC pasienter og kontroller (figur 2A).
(A) hierarkisk clustering av forskjellig uttrykt gener mellom pasienter (n = 6) og kontroller (n = 3) (CTC spesifikke gener). (B) RTqPCR validering av elleve gener valgt fra array-data. CD45-normalisert ganger endring forskjeller mellom mCRC pasienter (n = 20) og friske kontroller (n = 10) (grå bar) i CTC beriket fraksjon (svarte striper; *** p 0,0001). Av notatet, ble det ikke observert forskjeller mellom mCRC pasienter (n = 5) og kontroller (n = 5) i den resterende del etter CTC immunoisolering (hvite søyler).
bioinformatiske analyse med Oppfinnsomhet Pathway Analysis ( IPA) og Genecodis (for Gene ontologi) programvare servert å tolke den resulterende liste av gener som karakteriserer CTC befolkningen. De viktigste cellulære funksjoner definert ved disse CTC-spesifikke gener relatert til celle bevegelse, celleadhesjon, celledød og proliferasjon, celle-celle-signalisering og interaksjon, og cytoskjelettet omstilling (figur S2A og C). Interessant, IPA analyse av kanoniske reaksjonsveier, som var representative for disse genene, også markert et antall av kjente signalveier som er involvert i cellemigrering /invasjon og celleadhesjon, som proteinkinase A, RhoA, Integriner, ILK, eller Actin cytoskjelett signalmolekyler (Figur S2B). Videre analyse av gen-gen-interaksjoner gjengitt biologiske nettverk som preger CTC befolkningen fra mCRC pasienter. Blant dem ble kreft og cellulær morfologi bevegelse og funnet å være de viktigste hendelser assosiert med en CTC fenotype, mens denne tolkningen kan bli forspent av det viktige bidrag av kreft til databaser (figur S3). Alle disse analysene peker på en balanse mellom genene underliggende celleoverlevelse, samspill med miljøet og cellulær bevegelse som de grunnleggende biologiske prosesser som må møtes i bestanden av CTC for en vellykket utvikling av metastaser i CRC.
real-Time Kvantitativ PCR Validering og identifikasjon av diagnostisk og prognostisk Biomarkører
det neste trinnet involverte RTqPCR validering av elleve gener presentere høy log2 forhold i mCRC pasienter og en funksjonell relevans i de biologiske prosessene som karakteriserer CTC befolkningen i et uavhengig serie mCRC pasienter og kontroller. Den spesifikke ekspresjon av disse genene ble evaluert ved å sammenligne CTC populasjoner fra gruppen bestående av mCRC pasienter (n = 20) med bakgrunnen fra friske kontroller (n = 10), etter at de hadde blitt normalisert til CD45 som en markør for unspecificity under CTC isolasjon. Disse genene inkludert APP, CLU og TIMP1, som er forbundet med celledød og anti-apoptotiske aktivitet; VCL, ITGB5, BMP6 og TGFβ1, som er gener som er involvert i celle migrasjon og invasjon og cellulær morfologi; og TLN1, ITGB5, LIMS1, RSU1 og CD9, som er forbundet med celle adhesjon. Som observert i figur 2B (svarte striper), ble alle de valgte kandidat gener validert i denne nye serien av prøver av RTqPCR med betydelige forskjeller mellom pasientgruppen og gruppen av kontroller (p-verdi 0,0001).
Viktigere, for å sikre at ekspresjonen av utvalgte gener var karakteristisk for CTC og ikke en gjenstand på grunn av variasjonen av gen-ekspresjon i lymfocytter hos kreftpasienter, ble deres ekspresjon sammenlignet i den gjenværende ikke-isolerte fraksjonen ved CTC anrikning i et sett av mCRC pasienter (n = 5) og kontroller (n = 5). Som vist i figur 2B (hvite stolper), ble det ikke funnet forskjeller mellom begge grupper for de elleve kandidatgener, forsterkende deres spesifisitet av ekspresjon i den CTC populasjonen. Når fem prøver i CTC isolert brøkdel ble tilfeldig valgt, ble betydelig høyere nivåer konsekvent funnet i mCRC prøver, noe som viser at mangelen på forskjeller mellom pasienter og kontroller i den ikke-isolerte fraksjonen var ikke på grunn av utvalgsstørrelse gjenstander (data ikke vist) .
for å ytterligere evaluere involvering av kandidatgener i metastatisk potensial av CTC i CRC, ble deres uttrykk sammenlignet i en rekke primære karsinom (n = 14) og lunge (n = 7) og lever ( n = 7) metastaser. Som vist i figur 3A, er alle de utvalgte gener ble oppregulert i metastaser i forhold til primære lesjoner, med syv av de elleve genene presentere statistisk signifikans. Blant dem, CLU og TIMP1 presentert en spesiell opp-regulering i levermetastaser, som tyder på en mulig rolle for disse gener i vev-spesifikk evne mCRC CTC å kolonisere leveren (figur 3B). I tillegg er tre av de elleve utvalgte gener viste en signifikant økt uttrykk ved invasiv foran de primære svulster i forhold til paret ikke-invasiv overfladisk område, noe som tyder på en link til anskaffelse av en aggressiv fenotype (Figur 3C). Alle disse resultatene validert strategien til molekylært profilere CTC i mCRC pasienter, noe som bekrefter tilstedeværelsen av den CTC befolkningen og effektiv immunoisolering av CTC fra mCRC pasienter, så vel som evnen til spesifikt å karakterisere disse cellene på det molekylære nivå.
(A) genekspresjon forskjeller mellom lunge og levermetastaser fra CRC pasienter (n = 14) og primærsvulster (n = 14) for de elleve validerte gener. (B) Forskjeller i genekspresjon for CLU og TIMP1 mellom lunge (n = 7) og lever (n = 7) metastaser (M) sammenlignet med den primære tumor. (C) Spesifikk oppregulering av TGFβ1, TIMP1 og CLU i invasiv foran CRC primære tumorer (n = 14) sammenlignet med den ikke-invasiv område (* p 0,05, ** p 0,01; *** p 0.001).
til slutt, den molekylære profilering av CTC skal resultere i identifikasjon av potensielt pålitelige biomarkører for påvisning av den CTC populasjonen fra mCRC pasienter. For å evaluere dette punkt ble nøyaktigheten av RTqPCR validerte genene i påvisning av metastatisk sykdom evaluert i serien av mCRC pasienter og kontroller. Som vist i tabell 1, alle de validerte gener presenteres gode diskriminerende verdier i form av AUROC (verdier i området 0,94 til 1, p-verdi 0,0001). Dessuten, og med unntak av CD9 og TLN1, de utvalgte biomarkører vist en utmerket oppførsel som predikator for sykdomsprogresjon. Disse data garanterer videre studier i store kohorter av pasienter for bruken av disse biomarkører i klinisk setting.
Diskusjoner
Molecular profilering er mye brukt som en kraftig strategi for å karakterisere bestemte typer av svulster, bestemte undergrupper av karsinomer eller bestemte hendelser assosiert med kreftutvikling. I tillegg til å bidra til forståelsen av molekylære hendelser assosiert med dannelsen og utviklingen av kreft, har gen-uttrykk profilering førte til identifisering av terapeutiske mål og biomarkører i et forsøk på å forbedre forvaltningen av kreftpasienter i klinisk setting. I dette arbeidet, ønsket vi å takle med en meget spesiell og attraktiv bestand av kreftceller som er på opprinnelsen til metastasering, sirkulerende tumorceller (CTC). En kombinasjon av CTC immunoisolering, nøyaktig RNA ekstraksjon fra svært lavt antall celler, hel-genom forsterkning og massiv gen-uttrykk profilering for karakterisering og tolkning av biologi CTC i metastatisk kolorektalcancer er presentert her. Til teknisk validere denne strategien ble det profilering av CTC fra mCRC pasienter nærmet ved å subtrahere bakgrunns av ikke-spesifikk isolert fra en gruppe av friske kontroller. Den neste utfordring er å sammenligne den gene-ekspresjon profil av CTC befolkningen med de primære CRC lesjoner og med de åpenbare metastaser, for bedre å forstå mekanismene for tilpasning av tumorceller under prosessen med metastase og crosstalk med omgivelsene. Subtraksjon av bakgrunnen fra en gruppe av kontroller ble også ansett for å være mer relevant enn bakgrunnen fra samme mCRC pasienter som det ville kreve to runder med CTC isolasjon innenfor de samme prøvene, som representerer en betydelig kilde til tekniske gjenstander. Forskjeller i bakgrunnen kan ikke utelukkes på grunn av den systemiske metastatisk sykdom, selv om analyse av den resterende del etter CTC isolasjon ikke yte noen forskjeller innenfor de utvalgte gener.
Når det gjelder immunoisolering, og selv om CTC anriking med EpCAM -koblet antistoffer har vist seg å være overlegne i forhold til andre cytometriske metoder og en pålitelig metode for CTC deteksjon i mCRC pasienter [14], og dette CTC innfangingsprosedyren hevet noen debatt på grunn av avhengigheten av denne teknikken på ekspresjon av EpCAM. Som først ble beskrevet for 30 år siden som en dominant antigen i humane colon carcinoma vev, er det antatt at en redusert ekspresjon av epitel-markører skjer under epiteliale til mesenchymal overgang (EMT) forbundet med tumorinvasjon [15]. Viktigere er EpCAM tydeligvis nødvendig for å opprettholde ulike kreftcelle attributter og potensielt kreftstamcelle fenotype [16]. CD133 + celler, for tiden en av de beste markører for karakterisering av tykktarmskreftstamceller og en uavhengig prognostisk markør som korrelerer med lav overlevelse, er positivt for EpCAM [17]. På samme måte kan antistoffer mot EpCAM effektivt målrette kolorektal Tumor-Initiere celler [18], overdragelse en betydelig verdi til EpCAM-isolert CTC befolkningen i form av terapeutisk intervensjon. Dataene som presenteres her entydig vist effektiv isolering av CTC fra mCRC pasienter.
En viktigste oppnåelse av dette arbeidet var oversettelsen av metoden beskrevet av Gonzalez-Roca et al. for nøyaktig uttrykk profileringen av meget små cellepopulasjoner [13], inn i en klinisk relevant cellepopulasjon. Hele transkriptomet forsterkning tillot karakteriseringen av den CTC populasjon isoleres fra metastaserende CRC-pasienter på det molekylære nivå. Hittil har de fleste av studiene beskrev uttrykk nivåer av et begrenset antall gener i ulike CTC bestander, hovedsakelig for gjenkjenning formål [19], [20]. Fremgangsmåten benyttet her tillates molekyl profilering av CTC fra mCRC, og deres definisjon som en populasjon av celler med antatte trekkende og klebeegenskaper. Dette er i overensstemmelse med en undergruppe av tumorceller som må anskaffe en aggressiv og invasive fenotype slik dissosiasjon fra den primære lesjon, som fører til invasjonen av den omkringliggende stroma og deres intravasation og overlevelse i blodstrømmen. I tillegg kan disse cellene også ekstravasere og hell implantat i det fjerne vevet mål å generere en micrometastasis [19]. Listen av gener fenotypisk karakteriserer CTC befolkningen fra mCRC pasienter inkluderer kandidater knyttet til alle de ovenfor beskrevne funksjoner (figur 4), berettiger videre studier for å definere sin innblanding i metastatisk oppførselen til CTC befolkningen i CRC. Gener som VCL, ITGB5, BMP6 eller TGFβ1 har vært forbundet med kjøpet av en invasiv fenotype [8], [21], [22], blant annet gjennom EMT. Likeledes TLN1, APP, CD9, LIMS1 og RSU1 har vært knyttet til adhesjon og migrasjon, med CD9 moduler lokalisering av TLN1, en kritisk regulator av integrin aktivisering, til brennvoksn [23], eller LIMS1 å være assosiert med celle adhesjon og inte signalering, og, spesielt, med RSU1 og Ras-reaksjonsveien i løpet av cellemigrering [24]. Et viktig skritt i prosessen med kreft formidling er muligheten til å migrere og for å komme nærmere og intravasate nærliggende blodkapillærer. En gang i sirkulasjon, må overvinne CTC vertens immunsystemet ved å styrke deres apoptoseresistens blant andre mekanismer. Gener som TIMP1 og CLU er nøkkelmolekyler knyttet til denne prosessen [25]. Interessant nok har TIMP1 vært knyttet til fremgangsmåten ifølge anoikis motstand i forskjellige cancermodeller, slik at unnvikelse av celledød i fravær av substrat forankrings [26]. Ved å nå et målorgan, må CTC være i stand til å ekstravasere og danne kolonier, og CD9 har blitt beskrevet som av avgjørende betydning for prosessen med implantasjon og mikrometastaser dannelse forbundet med stamcelle attributter, som er relatert til disse hendelsene [27]. Interessant nok var en betydelig overlapping funnet med en leverspesifikk metastaser signatur i CRC [28] (se tabell S4), noe som tyder på en aktiv innblanding i tropisme og micrometastasis potensialet i CTC til dette organet i CRC. Spesielt, og i samsvar med korrelasjonen av TIMP1 ekspresjon i CTC og levermetastaser, er det blitt beskrevet som en regulator av leveren mikromiljøet, noe som øker følsomheten i dette organ til tumorceller [29]. Totalt har involvering av utvalgte gener i metastase kapasitet CTC også blitt forsterket av deres oppregulering i lunge- og levermetastaser i forhold til primære kolorektal karsinom.
In vitro
primære CTC kulturer og
in vivo
modeller for CTC i CRC vil definitivt gi forskere med robust bevis for å validere den rollen av disse genene i evnen til CTC å generere mikrometastaser, og til definere strategier spesielt rettet mot denne gruppen av metastatisk CTC.
av den resulterende microarray datasettet, er noen av de mest aktuelle genene viste i forbindelse med visse trekk ved prosessen med metastaser.
på samme måte, i form av biomarkører for forvaltning av mCRC pasienter, den molekylære profilering av CTC fra mCRC pasienter gjengis verdifulle verktøy for påvisning og kvantifisering av metastatisk sykdom, samt for prediksjon av sykdomsprogresjon. Den høye spesifisitet og sensitivitet demonstrert av de ovenfor beskrevne validerte gener i CTC befolkningen fra mCRC pasienter garanterer studiet av disse biomarkører i evalueringen av behandlingstiltak eller i utvelgelsen av pasienter for målrettet terapi.
I konklusjonen, denne studien beskrev, så vidt vi vet, den første spesifikke molekylære profilering av CTC isolert fra mCRC pasienter. Dette gen-ekspresjon analyse ble brukt til karakteriseringen av denne bestemt populasjon med antatte klebemiddel, trekkende og invasive evner, så vel som en modulert som reaksjon på celledød for en vellykket gjennomføring av prosessen med metastasering. Videre identifisering av terapeutiske strategier er spesielt rettet mot CTC befolkningen bør forbedre effektiviteten i utrydding og forebygging av CRC metastaser, mens en armamentarium av svært spesifikke og sensitive verdifulle markører bør påvirke styring og oppfølging av metastatisk CRC pasienter.
Materialer og Metoder
Pasienter
Alle deltakerne undertegnet et informert samtykke spesielt godkjent for denne studien av Etisk komité i Complexo hospitalario Universitario fra Santiago de Compostela (code of approval: 2009/289). Inklusjonskriterier for mCRC pasientene var tilstedeværelsen av målbare mCRC og en performance status Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) ikke er større enn 2. friske kontroller med et fravær av en tidligere kreft episode og en alder matchet med pasienter ble valgt. Detaljert informasjon om pasienter inkludert i analysen er tilgjengelig i tabell S1.
CTC immunoisolering
CTC ble isolert ved hjelp av CELLection ™ epithelial Enrich kit (Invitrogen, Dynal) ifølge produsentens instruksjoner. I korte trekk ble 7,5 ml blod fra mCRC pasienter og friske kontroller inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med 100 ul magnetiske kuler. Etter vasking CTC koblet til de magnetiske kuler direkte ble resuspendert i 100 ul RNAlater® oppløsning (Ambion) og lagret ved -80 ° C inntil bearbeidet for RNA-ekstraksjon.
Gene Expression Analyse
Total RNA fra CTC ble ekstrahert med QIAmp viralt RNA mini kit (Qiagen), spesielt utformet for svært lave cellularitet prøver. Renset RNA var ved siden utsatt for en hel transkriptomet forsterkning reaksjon (WTA2, Sigma Aldrich), Cy3 merket og hybridisert på Agilent 4 × 44 k gen-uttrykk arrays. Signalbehandling og filtrering, samt genekspresjon av data analyse er beskrevet i detalj i Supplemental material. Genuttrykk data er tilgjengelig på NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (deponeringsnummer: GSE31023).
Real-Time Kvantitativ PCR Validering
RTqPCR validering ble utført i et uavhengig sett med 10 friske kontroller og 20 stadium IV metastatisk kolorektalcancer (se tabell S1). CTC ble isolert som beskrevet, og RNA ble renset med en RNA-bærer for å forbedre utbytte og stabilitet. cDNA ble syntetisert ved hjelp SuperScriptIII kjemi (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. For ytterligere å optimalisere følsomhet for deteksjon, utførte vi en preamplification skritt ved å bruke TaqMan® PreAmp Master Mix kit (Applied Biosystems) med 14 reaksjonssykler. Preamplified produkter ble utsatt for TaqMan® real-time PCR forsterkning for elleve kandidatgener (se tabell S3 for analyse detaljer).
I tillegg har vi evaluert av RTqPCR uttrykket nivåer av kandidatgener i den cellulære brøkdel rester på CTC immunoisolering, i 5 mCRC pasienter og 5 friske kontroller. I korthet, utførte vi en rød blodlysering i den fraksjonen som blir tilbake etter EpCAM immun-perle inkubasjon og CTC isolasjon, og RNA ble renset fra de gjenværende kjernedannede blodceller med det RNeasy Mini Kit (Qiagen). RNA mengde og renhet ble vurdert av Nanodrop måling, ble cDNA syntetisert ved hjelp MuLV revers transkriptase system (Applied Biosystems) og TaqMan® qPCR ble utført for de elleve kandidatgener.
Expression for hvert gen ble normalisert til CD45 som en markør for ikke-spesifikk isolering. Brett endrings forskjeller mellom pasienter og kontroller ble statistisk analysert med GraphPad Prism programvare, bruk av Mann-Whitney ikke-parametrisk t-test og vurderer en p-verdi. 0,05 som betydelig
Gene Expression Analysis i primære svulster og metastaser
Primær kolorektal karsinom (n = 14) og metastase (levermetastaser, n = 7; lungemetastaser, n = 7) ble behandlet av patologi Institutt for Complexo hospitalario Universitario av Santiago de Compostela. Den overfladiske ikke-invasiv sone og den dype invasiv området av de primære tumorene ble dissekert makroskopisk, slik at tilsvarende tumor prosenter. RNA ble renset (TRIZOL reagent, Invitrogen, RNeasy kit, Qiagen), cDNA ble syntetisert (MuLV revers transkriptase, Applied Biosystems) og genekspresjon ble evaluert (TaqMan RTqPCR, Applied Biosystems). Data ble representert som ganger endring i forhold til uttrykk i den overfladiske non-invasiv området. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. Ikke-parametrisk Mann-Whitney t-test ble brukt for statistisk signifikans vurderer p-verdi. 0,05
Areal under ROC Curve (AUROC) og Kaplan-Meier analyse
Nøyaktigheten de elleve kandidatgener som biomarkører for diagnose ble evaluert med ROC-kurver, mens Kaplan-Meier-kurver ble bygget for sin evaluering som markører for prognose. Stenge verdier ble satt som den optimale verdier for hver markør. Pasienter progresjonsfri overlevelse ganger ble etablert som medgått tid mellom kjemoterapi linje start og sykdomsprogresjon evaluert av bildebehandling, eller pasienten døde av enhver årsak.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Representative bilder av epitelceller isolert fra mCRC pasientens blod.
