Abstract
Helicobacter pylori
, en Gram-negative, mikroaerofile bakterien funnet i magen, antas å være assosiert med kreftutvikling, invasjon og metastasering i fordøyelsessykdommer. Cytotoxin-assosiert gen A (CagA) er et onkogen protein av
H. pylori
som kodes for av en Cag patogenitet øy knyttet til utvikling av magekreft. Den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT) er den viktigste biologiske arrangementet i invasjon eller metastase av epitelceller.
H. pylori
kan fremme EMT i menneskelige mage kreft cellelinjer, men de spesifikke mekanismene er fortsatt uklar. Vi utforsket den underliggende molekylære mekanismen for EMT indusert av
H. pylori
CagA i magekreft. I vår artikkel, vi har oppdaget magekreft prøver og tilstøtende ikke-kreft eksemplarer av immunhistokjemi og fant økt uttrykk av EMT-relaterte regulatorisk protein TWIST1 og mesenchymale markør vimentin i kreftvevet, mens programmert celledød faktor 4 (PDCD4) og epiteliale markør E-cadherin uttrykk redusert i kreftprøver. Disse endringene var assosiert med graden av malignitet vev. I tillegg ble PDCD4 og TWIST1 nivåer relatert. I magekreftceller cocultured med CagA uttrykk plasmid, CagA aktivert TWIST1 og vimentin uttrykk, og hemmet E-cadherin uttrykk ved downregulating PDCD4. CagA også fremmet mobilitet av magekreftceller ved å regulere PDCD4. Dermed
H. pylori
CagA indusert EMT i magekreftceller, som avslører en ny signalveien fra EMT i magekreft cellelinjer
Citation. Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Sun Y, et al. (2014)
Helicobacter pylori
Fremmer Epitelial-Mesenchymale Overgang i magekreft ved Downregulating programmert celledød Protein 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10,1371 /journal.pone.0105306
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 12 februar 2014; Godkjent: 21 juli 2014; Publisert: 21 august 2014
Copyright: © 2014 Yu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Basic Research Program of China (ingen 973 Program 2012CB911202.), Natural Science Foundation National of China (nos: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 og 81170514), den Medical Science and Technology Development Program of Shandong (ingen . 2013WS0209) og Innovasjon Foundation Uavhengig av Shandong University (nr. 2012TS106). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Helicobacter pylori product: (
H. pylori
) er en helix-formet, Gram-negative bakterien forbundet med fordøyelsessykdommer, inkludert kronisk gastritt, magesår, magekreft, og slimhinne-assosiert lymfoid vev lymfom.
H. pylori
har blitt klassifisert som kreftfremkallende av Verdens helseorganisasjon og International Agency for Research on Cancer (WHO /IARC) i 1994 [1], [2].
H. pylori
gener har en cytotoxin-forbundet gen A (CagA) patogenitet øy som koder for de store virulens protein CagA og en type IV sekresjon system (T4SS). CagA blir levert til vertsceller ved T4SS og induserer kreft dannelse og progresjon [3].
H. pylori
kan deregulere celleproliferasjon, påvirke den normale apoptotiske reaksjonsvei, påvirker celleform, avskaffe junctional aktivitet og legge til rette for en epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) fenotype etter den translocates inn i vertscellen [4], [5].
H. pylori
effektorproteinet CagA påvirker de fleste av disse banene.
In vivo
eksperimenter viste at transgene uttrykk for CagA kan føre til flere kreftformer hos mus, inkludert mage epiteliale hyperplasia, myeloid leukemi og B-celle lymfom, eller mage polypper og adenokarsinomer i magen og tynntarmen [6]. Men den molekylære mekanisme av
H. pylori
CagA samspill på vertsceller er fortsatt uklart.
EMT ble først anerkjent som en funksjon av embryogenese, en viktig prosess for morphogenesis under embryonal og hjerte utvikling. Men det bidrar også til vev fibrose, tumor invasjon og metastasering. EMT er kjennetegnet ved flere forskjellige egenskaper, for eksempel tap av celleadhesjon, øket cellemobilitet, resistens mot apoptose, og noen egenskaper av stamceller. Med EMT, epiteliale markører som E-cadherin viser redusert uttrykk og mesenchymale markører som vimentin viser økt uttrykk. Andre regulatoriske molekyler som brev, TWIST og SLUG showet endret uttrykk [7], [8], [9]. Onkogene trasé som kan indusere EMT innbefatter transformerende vekstfaktor-β (TGF-p), Src, Ets, Ras, Wnt /β-catenin, Notch, nukleær faktor-kB og integrin [10], [11], [12].
Infeksjon med humant patogene faktor
H. pylori
antas å føre til EMT, invasjon eller metastasering av magekreft. For eksempel oppregulering av matriksmetalloproteinase 7 av sykdomsfremkallende
H. pylori
delvis avhenger av gastrin og kan ha en funksjon i utviklingen av magekreft, eventuelt gjennom EMT, ved indirekte induserende nivåer av oppløselig heparin-bindende endotelial vekstfaktor [13].
H. pylori
CagA er involvert i invasjonen av kreftceller ved å deregulere c-met reseptor signalisering [14]. I tillegg, CagA kunne øke aktiveringen av Wnt /β-catenin signalveien ved å forstyrre stabilisering av E-cadherin-β-catenin kompleks. Dermed spiller CagA en viktig rolle i utviklingen av intestinal metaplasi [15]. I tillegg microarray analyse antydet at fosforylering status for CagA kan påvirke uttrykket av EMT-relaterte gener i magekreftceller [16]. Men lite er kjent om de mekanismene som ligger til grunn for EMT indusert av CagA.
programmert celledød protein 4 (PDCD4) er lokalisert til kjernen i prolifererende celler [17]. Som en viktig post-transcriptional målet for mikroRNA (MIR) MIR-21, PDCD4 er relatert til tumorprogresjon og prognose i human lunge, kolorektal, bryst og magekreft [18], [19]. Svulsten Lyddemper PDCD4 kan binde seg til eIF4A eller eIF4G og hemme oversettelse. PDCD4 kan regulere mitogen-aktivert protein kinase 4 en eller urokinase-plasminogen-aktivator reseptor (uPAR) uttrykk for å hemme invasjon karsinom og intravasation [20], [21]. PDCD4 kan også påvirke transkripsjon av gener. Den samvirker med den DNA-bindende domene av TWIST1 og hemmer Y-box bindende protein 1-ekspresjon [22]. I tillegg, er tap av PDCD4 uttrykk assosiert med malign transformasjon i magekreft [23], [24]. Nedregulering av PDCD4 er knyttet til tumoren differensiering i fordøyelseskanalen kreft [25]. Men om PDCD4 er involvert i EMT indusert av CagA i magekreft og den spesifikke mekanismen fortsatt trenger ytterligere forklaring.
Her utforsket vi regulering av EMT-assosierte proteiner og PDCD4 uttrykk i magekreft vev og CagA aktivering av TWIST1 uttrykk og hemming av E-cadherin og PDCD4 uttrykk i magekreftceller.
Materialer og metoder
Pasient og prøver vev
studiet ble godkjent av etikk Committee of Shandong University School of Medicine, og alle prøvene og informasjonen ble samlet med skriftlig informert samtykke. Gastric tumorvev og deres matchet ikke-kreft vev ble høstet fra 30 pasienter i løpet av kirurgi ved Qilu Hospital, Shandong University (Jinan, Kina) fra 2010 til 2012. Ingen av pasientene hadde fått adjuvant kjemoterapi eller strålebehandling før operasjonen. Diagnostisering av magekreft ble histopathologically bekreftet av hematoxylin og eosin farging.
Cell kultur og transfeksjon
Menneskelige mage kreft cellelinjer (AGS, BGC-823 og SGC-7901) ble hentet fra Kina Academia Sinica Cell Repository (Shanghai). Celler ble inkubert i de anbefalte media og en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C uten antibiotika. SGC-7901-celler og BGC-823-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), og AGS-celler ble dyrket i F12-medium supplert med 10% FBS. Medier og FBS ble kjøpt fra Invitrogen (USA). Deretter ble cellene transient transfektert med plasmider pcDNA3.1 eller pcDNA3.1-CagA (en gave fra Dr. Yongliang Zhu, Zhejiang University, Kina) og pEGFP-C1 eller pEGFP-C1-PDCD4 (konstruert og levert av Dr. Youhai Chen , Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) ved hjelp av X-treme GENE HP Transfeksjon Reagens (Roche Diagnostics, Tyskland) i henhold til produsentens protokoller.
RNA isolering, revers transkripsjon og QRT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra cellene ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, USA). Revers transkripsjon involverte Superscript III First Strand Synthesis sett (Invitrogen). Uttrykket av gener ble påvist ved bruk av kvantitativ real-time PCR SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Kina) og normalisering involverte to
– △△ ct metode i forhold til p-aktin. Primersekvensene var for PDCD4, følelse, 5′-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 «og antisense, 5′-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3′; E-cadherin, følelse, 5»-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 «og antisense, 5′-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3′; CagA, følelse, 5»-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 «og antisense, 5′-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3′; og TWIST1, følelse, 5»-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 «og antisense, 5′-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3′; vimentin, følelse, 5»-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 «og antisense, 5′-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3′; SNAIL, følelse, 5»-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 «og antisense, 5′-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3′; β-aktin, følelse, 5»-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 «og antisense, 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3».
Western blot-analyse
Protein ble ekstrahert fra prøvene og separert ved SDS-PAGE og deretter overført til PVDF-membraner (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), som ble blokkert umiddelbart med 5% fettfri melk i TBST inneholdende 1% Tween-20 i 1,5 timer ved romtemperatur. Etter å ha blitt vasket i fosfat-bufret saltvann (PBS) 3 ganger, ble membranene inkubert med antistoffer mot PDCD4 (1:500; Cell Signaling Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, USA), brev (1:1000 , Cell Signaling Technology, USA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-cadherin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA), vimentin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA ), og β-aktin (1:2000, Sigma-Aldrich, USA), som en normaliseringskontroll, ved 4 ° C over natten, deretter med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff ved romtemperatur i 1 time. Etter vasking ble immunoreaktive bånd visualisert ved forsterket kjemiluminescens (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Western blotting ble utført 3 ganger for hver prøve. Protein ble lastet på 20-50 mikrogram per kjørefelt.
Immunohistochemistry
Parafin vevsprøver ble de-paraffinized med xylen og dehydrert med en gradert serie av alkohol. Antigen gjenfinning ved varmebehandling utført i 0,1 M citratbuffer. Og blokkerer endogen peroksidase aktivitet ble brukt av 3% H
2o
2. Deretter lysbilder ble inkubert med antistoffer mot PDCD4 (1:200), Twist1 (1:500), vimentin (1:100) eller E-cadherin (1:500), og tilsvarende pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer og DAB for kjerner. Antistoffer for immunhistokjemisk farging ble de brukt til western blot. Endelig hematoksylin ble brukt for kontra lysbilder. Tumor differensiering av kreftvev ble bestemt på en blindet måte. Det første antistoffet ble erstattet med fosfatbufret saltvann som negativ kontroll. Prøvene ble sett under et Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokyo, Japan) mikroskop.
Alle fargede delene ble observert og scoret av 2 uavhengige blindet etterforskere, og lysbilder fikk en total flekker indeks (SI) scorer etter fargeintensitet, og prosentandelen av positive tumorceller. Fargeintensitet ble gradert som 0, ingen farging; 1, svak flekker; 2, moderat farging; og 3, sterk farging. Tumorcelle andel ble scoret som 0, ≤20% positive tumorceller; 1, 20% -40% positive tumorceller; 2, 40% -60% positive tumorceller; 3, 60% -80% positive tumorceller; og 4, ≥80% positive tumorceller. Ved å vurdere SI ble fargingsresultater endelig registreres som 0-4, lav uttrykk; 4-6, moderat uttrykk; og 6-12, høy uttrykk. Hvis farging tolkning skilte mellom etterforskere, ble dataene for seksjonen kastes.
Matrigel invasjonen assay
Matrigel invasjonen assay involvert en transwell kammer (Costar, New York, USA). SGC-7901 celler ble transfektert med 2 mikrogram pcDNA3.1, pEGFP-C1; pcDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; eller pcDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. Etter 48 timer ble 1 x 10
5 legg-transfekterte celler ble trypsinert og sådd ut på Transwell kamre forhåndsbelagt med 20 ug Matrigel. Medium inneholdende 20% FBS i det nedre kammer tjente som kjemoattraktant, og det øvre kammer ble fylt med medium inneholdende 10% FBS. Non-migrerte celler ble fjernet med bomullspinner etter 24 eller 48 timer. Celler migrerer til undersiden av filteret ble farget med 0,1% krystallfiolett og tellet på et mikroskop. Til slutt ble gjenværende cellene høstet for protein og RNA-isolering. Hver behandling ble gjentatt 3 ganger.
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Student
t
test eller chi-kvadrat test ble brukt for å sammenligne 2 grupper. Dataanalyse involvert SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
1.. Uttrykk av TWIST1, E-cadherin, vimentin og PDCD4 i magekreft
For å undersøke sammenhengen av EMT og magekreft, høstet vi 30 vevsprøver kliniske fra mage kreftpasienter. Biopsier ble delt inn i midten /lav differensiering vev, høy differensiering vev og ikke-kreftvev i tilknytning til carcinoma av hematoxylin og eosin farging (Fig. 1a). På Immunhistokjemi, TWIST1 og vimentin ekspresjon var høyere i ondartet vev enn ikke-kreftvevet, mens ekspresjon av E-cadherin og PDCD4 var motsatt den til TWIST1 (Fig. 1A-E). TWIST1 og PDCD4 ekspresjon ble knyttet til graden av tumoren differensiering men ikke kjønn eller alder (p = 0,021 og p = 0,013, tabell 1). I tillegg, redusert PDCD4 ekspresjon ble omvendt assosiert med endret TWIST1 ekspresjon i løpet av magekreft (p = 0,035, tabell 2). Derfor kan EMT spille en viktig rolle i magekreftutvikling og utvikling.
(A) Hematoxylin og eosin-farging bekreftet preoperativ diagnose og histologisk karakter. Representant immunhistokjemisk farging av TWIST1, brev, PDCD4, vimentin og E-cadherin tydelig i tilstøtende normalt vev og høy differensiering kreftvev og middels /lav differensiering kreftvev. (B-E) Kvantifisering av TWIST1-, SNAIL-, PDCD4-, vimentin- og E-cadherin- uttrykk i normale og kreft vev. Det totale antall prøver er 30 og hvert punkt representerer en prøve. Horisontal medium bar mener og værhår er SD.
*
P
0,05 og
**
P
. 0,01 versus kontroll
2. TWIST1, vimentin eller E-cadherin uttrykk i mage cellelinjer er regulert av CagA
Neste, vi undersøkt om CagA, som en ondartet faktor på
H. pylori
, påvirket EMT og derfor fremmet invasjon og metastasering i magekreft. Vi valgte 3 menneskelige mage kreft cellelinjer av differensiering statuser (AGS, godt differensiert gastrisk epitelial cellelinje, SGC-7901, moderat differensiert cellelinje og BGC-823 dårlig differensiert cellelinje). CagA ekspresjonsplasmid ble transfektert inn i forskjellige gastriske cellelinjer. Selv om de morfologiske forandringer CagA-transfekterte celler ikke ble observert (data ikke vist), ble ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer og celle markører påvirkes av CagA. MRNA og protein uttrykk for TWIST1 og vimentin ble oppregulert med CagA transfeksjon (Fig. 2A-G), og at av PDCD4 og E-cadherin ble nedregulert (Fig. 2A-G), men ble ikke observert noen signifikante endringer i brev uttrykk i CagA transfeksjon gruppe. Derfor
H. pylori
CagA kan påvirke EMT regulatorer inkludert TWIST1. Videre E-cadherin, som en viktig epithelial markør og vimentin, som en mesenchymale markør regulert av TWIST1, ble også påvirket av CagA, og EMT-relaterte genet PDCD4 ble nedregulert.
CagA helaftens plasmid ble transfektert inn i AGS, SGC-7901 og BGC-823-celler i 48 timer, og cellene ble høstet for mRNA og western blot analyse. (A-C) Kvantitativ RT-PCR analyse av mRNA nivå av PDCD4, EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer (TWIST1 og snegl) og cellemarkører (vimentin og E-cadherin) i 3 mage kreft cellelinjer. Alle verdier ble normalisert til p- aktin mRNA i samme prøve. (D) Western blot analyse av protein nivå av CagA, TWIST1, brev, PDCD4, vimentin og E-cadherin kontroll eller CagA-transfekterte celler. (E-G) Western blot Tetthetsmåling ble kvantifisert (ImageJ) og nivået av det angitte protein ble normalisert til p-aktin. Dataene som vises representerer gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
. 0,01 versus kontroll
3. Uttrykk av TWIST1, vimentin og E-cadherin var påvirket av PDCD4
Vi neste analysert den molekylære mekanismen av EMT regulert av
H. pylori
CagA i magekreftceller. PDCD4 hemmer cellevekst via en direkte interaksjon med TWIST1 i human prostatacancer [22]. Immunhistokjemi og statistisk analyse viste relevansen av PDCD4 og TWIST1 eksisterte i gastrisk karsinom (fig. 1, tabell 2). Men mekanismene bak PDCD4 funksjon i magekreftceller var ikke klart. Så AGS? GSC-7901 og BGC-823 celler vi transfektert med et plasmid av overekspresjon PDCD4. PDCD4 mRNA og protein ekspresjon ble oppregulert i alle plasmid-transfekterte cellelinjer (Fig. 3A-G). I tillegg mRNA og proteinnivå TWIST1 og vimentin, men ikke SNAIL, var redusert i varierende grad, og E-cadherin-nivåene ble øket (fig. 3A-G). Derfor kan TWIST1, vimentin og E-cadherin uttrykk reguleres av PDCD4 i mage epitelceller.
Plasmider av pEGFP-C1 og pEGFP-C1-PDCD4 ble henholdsvis transfektert inn i AGS, SGC-7901 og BGC-823 cellene i 48 timer, og deretter ble cellene høstet for isolering av total cellulær RNA eller protein. (A-C) QRT-PCR analyse av mRNA nivå av TWIST1, brev, PDCD4, vimentin og E-cadherin i AGS, SGC-7901 og BGC-823 celler. Alle verdier ble normalisert til p-aktin mRNA i samme prøve. (D) Western blot-analyse av 5 target-proteiner ekspresjon i kontrollceller og PDCD4 overekspresjon celler. (E-G) Western blot resultatene ble kvantifisert (ImageJ) og nivået av målproteinet ble normalisert til p-aktin. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01 versus pEGFP-C1 con
4.. EMT er regulert av CagA via hemme PDCD4 i mage epitelceller
Basert på ovennevnte funn, hypoteser vi at EMT prosessen indusert av
H. pylori
CagA skjedde ved downregulating PDCD4, vi kotransfektert mage epitelceller med CagA plasmid og PDCD4 overekspresjon plasmid. Den reduserte uttrykk for PDCD4 ble utvunnet med CagA og overexpressed PDCD4 transfeksjon. I tillegg, ble den økt ekspresjon av TWIST1 og vimentin hemmet og den reduserte ekspresjon av E-cadherin er oppregulert i de ko-transfektert gruppe. Disse endringer ble observert ved både på mRNA og proteinnivåer (Fig. 4A-G). Migrering av human magekreft cellelinje SGC-7901 transfektert med plasmider ble bestemt av matrigel invasjon analysen. Resultatene viser at det ble indusert ved CagA plasmid. Celle migrasjon analysen avslørte også at PDCD4 overekspresjon downregulated CagA-indusert sin invasjon og metastase evne (Fig. 5A). Fig. 5B viser de migrerte celle tall fra SGC-7901 i CagA transfeksjon gruppe er åpenbart mer enn kontrollgruppen, mens mengden av migrerte celle i ko-transfeksjon gruppe er vesentlig mindre enn CagA transfeksjon gruppe. De biologiske fenomener demonstrere EMT promotering av CagA ble gjenfunnet i en del av forhøyet PDCD4 uttrykk. På grunnlag av bevis, det utledes at PDCD4 kan kreves for
H. pylori
CagA-mediert magekreft progresjon
Alle forsøkene ble delt inn i tre grupper:. 1) pcDNA3.1 + pEGFP-C1 (kontroll), 2) pcDNA3.1-CagA + pEGFP-C1, 3) pcDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4. Ifølge ulike grupper, ble de tilsvarende plasmider transfektert i AGS, SGC-7901 og BGC-823 celler. Deretter ble cellene høstet for mRNA og western blot analyse. (A-C) QRT-PCR analyse av mRNA nivå av TWIST1, brev, PDCD4, vimentin og E-cadherin i mage kreft cellelinjer. Alle verdier ble normalisert til p- aktin mRNA i samme prøve. (D) Western blot analyse av CagA, TWIST1, brev, PDCD4, vimentin og E-cadherin protein uttrykk i alle celler. (E-G) Western blot resultatene ble kvantifisert (ImageJ) og normalisert til p-aktin. Viste data representerer gjennomsnitt ± SD fra 3 uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, **
P
0,01 versus con,
Δ
P
0,05,
ΔΔ
P
0,01 versus pEGFP + CagA
(A) forsøket ble delt inn i tre grupper:. 1) pcDNA3.1 + pEGFP-C1 (kontroll), 2) pCDNA3.1- CagA + pEGFP-C1, 3) pcDNA3.1-CagA + pEGFP-C1-PDCD4.The tilsvarende plasmider ble transfektert inn SGC-7901 celler i henhold til ulike grupper. Den invasjon og metastasering evne av celler ble analysert ved hjelp av Matrigel invasjon assay. (B) kvantitative de migrerte celle tall av SGC-7901 i tre grupper. Viste data representerer gjennomsnitt ± SD fra 3 eksperimenter. *
P
0,05 versus con,
Δ
P
. 0,05 versus pEGFP + CagA
Diskusjoner
hoved~~POS=TRUNC i denne studien er oppsummert som følger: 1)
H. pylori
CagA er ansvarlig for induksjon av TWIST1 eller vimentin og hemming av E-cadherin i mage kreftceller. 2) CagA-indusert epitelial-mesenchymale overgang er delvis avhengig av regulering PDCD4. 3) TWIST1 og PDCD4 innebærer i EMT av magekreft.
Magekreft er en flertrinns og gradvis sykdom. Overskudd av proliferasjon av epitelceller er en viktig del av den opprinnelige tumor angiogenese eller tidlig vekst [5]. Deretter celle invasjon, først reflekteres gjennom basalmembranen, ble betraktet som en prediktor for den siste fasen av kreft; det til slutt fører til metastatisk spredning og dødelighet [26]. Sykdomsfremkallende infeksjon kan forårsake kreft tumorgenesis og malign transformasjon av vertsceller. Som en viktig patogen risikofaktor,
Helicobacter pylori
ble nært knyttet til mavesår, slimhinne-assosiert lymfoid vev lymfom av magen, og adenokarsinom i ventrikkel [20], [27], [28], [29] . CagA, en av de mest prinsipielle virulensfaktorer av
H. pylori
induserer forekomst og utvikling av magekreft. Ondartet transformasjon av vertsceller innebærer i regulationary nettverk, inkludert mange celleproteiner, ikke-kodende RNA og andre biologiske aktivitet molekyler. Men mekanismen bak CagA effekter på mageslimhinnen er så kompleks og uklar.
EMT er en svært konservert biologisk prosess på embryonale organutvikling, noe som gjør at epitelceller å miste epitelial fenotype og få mesenchymale fenotype. Dette inkluderer tap av celle polaritet i epitelceller, tap av evnen til å koble med basalmembran, tilgang til mesenchymale fenotype slik som høyere migrering og invasjon, anti-apoptose, og evnen til å nedbryte den ekstracellulære matrisen [8], [30] . EMT spiller en avgjørende rolle i kroniske betennelsessykdommer, fibrotiske sykdommer, tumorprogresjon og vev gjenoppbyggingen, spesielt i oppkjøpet av migrasjon og invasjon muligheten for maligne epitelceller. Unormal aktivitet i EMT epith av voksne epitelceller inhiberes celleadhesjonsmolekyler, forårsaket celleadhesjon redusert kapasitet, og derved slå på tumorceller til å spre seg i kroppen, til syvende og sist å fremme tumormetastase [31], [32], [33]. Derfor EMT er ansett begynnelsen av invasjon og metastase og er også et tegn på sterk evne til invasjon og metastase av tumorceller.
h.pylori
induserer epitel-mesenchymale overgang av TNF-α induserende protein [34]. Den aktuelle studien indikerer CagA kan føre epitelceller til morfologiske endringer. Det er blitt foreslått at CagA ekspresjon var ikke bare er tilstrekkelig til å forstyrre apikale knutepunkter, men også ligne epiteliale til mesenchymal overgang i Madin-Darby hundenyreceller [35]. Epitelceller infisert av bakterier dukket opp ulike genomikk endringer, og effekten på EMT markører indusert av
H. pylori
var sannsynligvis på en cagPaI relatert måte. Dataene viste at epitel mesenchymale overgang (EMT) -relaterte gener var opp- eller nedregulert med CagA-positive
H. pylori
stammer i AGS [36], [37]. Av notatet, er det regulatoriske nettverk av CagA involverer i EMT av magekreft fortsatt må avklares.
For å undersøke den spesifikke mekanismen av EMT fremmet av CagA i magekreft, sammenlignet vi gener uttrykk for tilstøtende ikke- tumorvev og magekreft vev ved immunhistokjemi. Resultatene indikerte at Twist1 /vimentin uttrykk i carcinoma vev var høyere enn tilstøtende ikke-tumorvev, og dens uttrykk i midten /lav differensiering karsinom vev høyere enn høye differensiering vev. Imidlertid E-cadherin og PDCD4 redusert i ferd med epiteliale-mesenchymale overgang i magekreft. Interessant, den finnes på en negativ korrelasjon til uttrykk av TWIST1 og PDCD4. Vår studie antydet EMT-relaterte gener er knyttet til prosessen av magekreft, i samsvar med tidligere undersøkelser observere tap av epitel protein og /eller oppkjøp av uttrykket av mesenchymale proteiner skjedde i magekreft. Videre ble de henholdsvis korrelert til dårlig differensiert histologi, avansert stadium og dårlig pasient utfall [38]. I tillegg er PDCD4 en nylig funnet molekyl som spiller en viktig rolle på mange biologiske prosesser som kan føre til sykdom eller forekomst og utvikling av svulst. PDCD4 hemmer oversettelsesprosessen ved å binde seg til oversettelse initiering faktor eIF4A eller eIF4G. Ulike induserer apoptose stimulere celler og oppregulere uttrykk for PDCD4, noe som ytterligere kan regulere P21, Cdk4, karboanhydrase II og JNK /c-Jun /AP-1. PDCD4 kunne hemme invasjon relaterte urokinase-plasminogen-aktivator reseptor-ekspresjon, invasjon eller infiltrasjon av blodkar, og metastase; Derfor, redusert ekspresjon av PDCD4 spiller en viktig rolle i tumorforeteelse, utvikling og prognose [17], [33], [39], [40]. Så vi lurte på om Twist1 og PDCD4 deltok i CagA-indusert EMT.
Så, vi har oppdaget EMT-assosiert transkripsjonsfaktorer og markører uttrykk i CagA-transfekterte mage kreft cellelinjer. Våre data viste at
H. pylori
CagA kan opp-regulerer uttrykket av TWIST1 og vimentin men ikke SNAIL, og nedregulere E-cadherin og PDCD4 i mage cellelinjer (AGS, SGC-7901 og BGC-823). Resultatene var ikke påvirket av differensiering status av transfekterte celle. Selv om vi ikke observere morfologiske endringer av CagA-transfekterte celler, kunne invasjon og metastase evne magekreftceller bli fremskyndet av CagA via transwell celle invasjon analysen. Dette er delvis forårsaket av funksjonell heterogenitet av CagA i forskjellige vev. Så effekten av EMT indusert av
H. pylori
fortsatt behov for å bli ytterligere utforsket. MiR-21 forfremmet TGF-β-indusert myofibroblast differensiering prosessen ved å målrette PDCD4. TGF-β indusert MIR-21-ekspresjon i fibroblaster og mir-183 downregulated PDCD4 og inhiberte TGF-β-indusert apoptose i humane leverkreft-celler [41], [42]. I mellomtiden, TGF-β regulert SNAIL, TWIST, eller ZEB1 og påvirket EMT og metastasering [43]. Videre PDCD4 ble funnet å være involvert i transkripsjon også. Faktisk ble COOH endestasjonen Twist1 inneholder grunnleggende helix-loop-helix domene antydet at mediert direkte interaksjon med PDCD4 proteiner. Så, samhandler PDCD4 med DNA-bindende domene av Twist1 og hemmer dens DNA bindende evne til å målrette gener i menneske prostata kreft celler [22] .Derfor, vi videre testet om PDCD4 kunne regulere TWIST1 i magekreftceller. Vår studie viste at TWIST1 ble nedregulert av PDCD4 høy uttrykk plasmid ved real-time PCR og Western blotting, mens E-cadherin uttrykk var motsatt TWIST1 i AGS, SGC-7901 og BGC-823. MRNA uttrykk for brev ble nedregulert i AGS og SGC-7901, mens preotein uttrykk ikke ble observert de samme endringene. Det kan være på grunn av kompleksiteten av proteinsyntese. Det vil si, protein ikke bare regulert på transkripsjonsnivå, men også oversettelse og snu nivå. Det ser ut til at noen ganger mRNA er ikke en direkte indikasjon på protein-nivå i cellene. Siste gjennomførte vi videre forskning på rollen PDCD4 i CagA-indusert epitelial-mesenchymale overgang. Gastriske epitel-celler ble transfektert med CagA ekspresjonsplasmid og PDCD4 overekspresjon plasmid samtidig. Restaurering av PDCD4 uttrykk kan hemme TWIST1 og vimentin, og indusere E-cadherin som reguleres av CagA, PDCD4 ble også sertifisert som kan påvirke invasjon og metastase evne i mage celler ved matrigel invasjon analysen. Selv om flere studier er nødvendig for å teste denne hypotesen, konkluderte vi i utgangspunktet at CagA-indusert epitelial-mesenchymale overgang er delvis avhengig av regulering PDCD4.
Oppsummert viser vi at
H. pylori
CagA indusere TWIST1 uttrykk og EMT i mage kreftceller ved å regulere PDCD4 (Fig. 6). Vi gir et innblikk i den molekylære nettverk av magekreft indusert av
H. pylori
infeksjon, og leverer et teoretisk grunnlag for PDCD4 som en biologisk mål for diagnose eller behandling av kreft. Fremtidig forskning som involverer musemodeller kan føre til en bedre forståelse av hvilken rolle PDCD4 i
H. pylori
indusert EMT av magekreft.
H.
