Abstract
adenovirus er svært immunogen og blir undersøkt som potensielle vektorer for immunterapi. Infeksjon av onkolytisk adenovirus blir etterfulgt av massiv autophagy i kreftceller. Her, hypoteser vi at autofagi regulerer behandling av adenovirus proteiner for antigen presentasjon. For å teste denne hypotese, vi først undersøkt presentasjon av virale antigener av infiserte celler ved anvendelse av et antistoff cocktail av virale kapsidproteiner. Vi har funnet at virusantigener ble behandlet med JNK-mediert autophagy, og at autophagy var nødvendig for deres presentasjon. I samsvar med disse resultatene, splenocytter isolert fra virus-immuniserte mus ble aktivert av infiserte celler i et MHC II-avhengig måte. Vi deretter hypotese at denne mekanismen kan benyttes til å generere en effektiv vaksine kreft. For dette formål konstruerte vi et onkolytisk virus omfatter en EGFRvIII cancer-spesifikk epitop i det adenovirale fiber. Infeksjon av kreftceller med denne fiber modifiserte adenovirus medført innregning av infiserte kreftceller ved en spesifikk anti-EGFRvIII antistoff. Imidlertid inhibering av autophagy drastisk redusert mulighet for det spesifikke antistoff for å påvise kreft-relaterte epitoper i infiserte celler. Våre data tyder på at kombinasjonen av adenovirus med autofagi indusere kan forbedre behandling og presentasjon av kreftspesifikke antigener innlemmet i kapsidproteiner
Citation. Klein SR, Jiang H, Hossain MB, Vifte X, Gumin J, Dong A, et al. (2016) Kritisk rolle Autophagy i behandlingen av Adenovirus kapsid-Incorporated Cancer-spesifikke antigener. PLoS ONE 11 (4): e0153814. doi: 10,1371 /journal.pone.0153814
Redaktør: Maria G. Castro, University of Michigan School of Medicine, USA
mottatt: 25 januar 2016; Godkjent: 04.04.2016; Publisert: 19 april 2016
Copyright: © 2016 Klein et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra NIH (P50CA127001; R01NS069964, kreftsenter Support Grant P30CA016672-sekvensering og microarray Facility og forsknings Animal Support Facilities), den Marnie Rose Foundation, den Will Power Foundation, Schissler Foundation, og American Legion Auxiliary. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. JF, CG-M, og HJ har intellektuell eiendom på Delta-24-RGD , lisensiert til DNAtrix, Inc. (patent arkivert US 14/148259, Infeksjons forbedret betinget-replicative adenovirus og bruker disse). J.F. og C.G-M. er grunnleggerne og konsulent DNATrix, Inc. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Onkolytiske adenovirus som Δ24-RGD (Delta -24-RGD), [1, 2] er meget immunogene. [3] den nåværende hypotese for å forklare antitumormekanisme hos pasienter behandlet med onkolytiske adeno-virus er at hovedeffekten er oppnådd gjennom avtrekkeren av en antitumor immunrespons. [4 ] autophagy er en anerkjent funksjon i celler infisert med adenovirus [5, 6] og er en viktig del av den lyseprosessen. [7] Xenophagy [8] og patogen-avledede antigen prosessering [9, 10] er grunnleggende funksjoner av autophagy i -celler infisert med virus. Autophagy degraderer intracellulære innhold, behandling av epitoper for å bli lastet på hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) molekyler for presentasjon på overflaten av immunceller. [9-11] Imidlertid, på hvilken måte kreftceller behandle adenovirus-avledede antigener er for tiden ukjent.
modulering av autophagy i pattedyrceller er best beskrevet i celler som gjennomgår sult. [12-14] i tillegg til den kanoniske vei, [12-14] de c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaltransduksjon svei er aktivert i celler som gjennomgår autofagi. [15] videre JNK-aktivering er blitt observert i celler infisert med virus. [16] til tross for den klare rollen som JNK spiller på regulering av medfødte og ervervede immunresponser, [17], inkludert evnen for å forsterke immunresponsen til virale patogener ved opp-regulerer ekspresjonen av proinflammatoriske cytokiner, [18-20] den direkte funksjon av JNK i patogen-avledede antigen prosessering og presentasjon er ennå ikke definert.
Vi har har nylig rapportert at JNK-ekspresjon og aktivering av phoshporylation er nødvendig for induksjon av produktiv autophagy i adenovirus-infiserte celler. [16] i denne undersøkelsen, fant vi at adenovirus strukturelle proteiner samvirke med autofagi last-reseptorproteiner som fører til nedbrytning i autophagolysosomes . Autophagy synes å være avgjørende for presentasjonen adenovirus-deriverte antigener fordi inaktivering av autofagi regulator JNK eller direkte inaktivering av autofagi drastisk begrenset anerkjennelse av kreftinfiserte celler ved primet immunceller og antistoffer mot hovedkapsidproteinet eller kreftspesifikke ektopiske epitoper kodet av adenovirus fiber.
Materiale og metode
Cell kultur
U87 MG glioma, HeLa livmorhalskreft, og A549 lunge kreft cellelinjer ble alle hentet fra ATCC. HeLa-celler ble dyrket i DMEM (1X), og A549-celler ble dyrket i DMEM /F-12 50:50 medium (Invitrogen). U87 MG-celler (ATCC) ble dyrket i MEM med 10% FBS og 1% essensielle aminosyrer. Wild-type og
JNK1 /2 – /-
mus embryo fibroblaster (MEFs) ble levert av Roger Davis (University of Massachusetts Medical School, MA). Villtype og knock-out Atg5 MEFs (
Atg5 – /-
) er en generøs gave fra Noboru Mizushima (Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan). Villtype og knock-out P62 MEFs (
p62 – /-)
var en generøs gave fra Jorge Moscat (Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA). MEFs ble dyrket i DMEM /F12 50:50 medium. Cellene ble dyrket med 10% FBS ved 37 ° C i 5% CO
2 i luft.
Kjemi og antistoffer
JNK kinase inhibitor SP600125 og bafilomycin A1 ble kjøpt fra Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA). Rapamycin ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California, USA). Rekombinant humant protein interferon gamma (IFN-γ) ble innkjøpt fra Prospec (East Brusnwick, NJ, USA). Antistoffer mot LC3, Beclin en, og ubiquitin ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Beverly, MA, USA). Anti-p62 og anti-Actin-antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, USA). Anti-adenovirale fiber ble oppnådd fra ThermoScientific (Waltham, MA, USA). EGFRvIII ble oppdaget med et monoklonalt antistoff (L8A4) oppnådd som en sjenerøs gave av Dr. Bigner (Duke University i North Carolina, USA). Allofykocyanin (APC) konjugert anti-mus sekundære antistoffer og fluorescein (FITC) konjugert sekundært antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology.
Adenoviral produksjon og infeksjon
Δ24RGD og AdWT adenoviruses ble produsert som beskrevet tidligere. [1] Δ24FvIII ble konstruert ved innsetting av EGFRvIII epitopen (LEEKKGNYVVT) [21] inn i HI sløyfe av fiberprotein mellom aminosyrene 543 og 544. [22] Først den sekvensen som koder for EGFRvIII epitopen ble innlemmet fiber-genet i vektoren pXK-F inneholder
Xba
I-
Kpn
fragment av pVK503C [23] via seterettet mutagenese. Deretter Xba I-Kpnl fragment fra den resulterende vektoren pXK-FVIII var co-transduced med
Swa
-linearisert pVK500C.delta-24 til
E
.
coli BJ5183
for homolog rekombinasjon som beskrevet tidligere. [24] Viruset ble deretter reddet i 293-celler og formert i A549-celler, som tidligere beskrevet. [24] adenovirus ble tilsatt til cellekulturmedium ved den angitte multiplisitet av infeksjon (MOI).
Western blot analyse
Celler ble lysert med RIPA lysebuffer. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med bruk av en Bio-Rad proteinanalyse. Proteinprøver (25 mikrogram) i 1X SDS lasting buffer ble kokt og lastet inn Tris-glysin natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gels (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Prøver ble separert ved hjelp av elektroforese. Gelene ble deretter overført til polyvinylidenfluorid membraner, som ble blokkert ved anvendelse av 5% ikke-fettholdig melk i 1X TBS-T (0,025% Tween) i en time ved romtemperatur og deretter inkubert over natten ved 4 ° C i et primært antistoff ved passende fortynninger. Membraner ble vasket tre ganger med TBS-T (0.05% Tween), og deretter inkubert ved romtemperatur i 1 time med egnede sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, 1: 4000) fremstilt i 1% ikke-fettmelk i TBS-T. SuperSignal West Femto kjemiluminescenssubstrat (ThermoScientific) og HyBlot CL autoradiografi film (Denville Scientific Inc., South Plainfield, NJ, USA) ble brukt til å visualisere proteinbåndene.
RNA interferens
Wild-type MEF-celler ble utsådd i 6-brønners plater i 24 timer før small-interfererende RNA (siRNA) transfeksjon. INTERFERin (Polyplus Transfeksjon (Illkirch-Graffen, Frankrike) ble brukt til å sette inn de sirnas inn i cellene i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble 50 nM siRNA oligonukleotider kombinert med 10 mL av transfeksjon reagens og lagt til cellene etter 15 min av inkubasjon ved romtemperatur. siRNA oligonukleotider muse~~POS=TRUNC MHC klasse i, MHC klasse II, og ikke-kodende områder ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology.
Co-immunoprecipitation
Celler ble infisert med AdWT eller Δ24RGD for opp til 48 timer. Flytende og festede celler ble oppsamlet og lysert med immunutfelling (IP) lysebuffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Igepal CA-630) . protein~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble pre-erte med protein A og protein G-agarose perler anti-adenovirale fiber eller anti-P62-antistoffer ble tilsatt til lysatene ved en fortynning på 1:. 100, og komplekser av proteiner ble immobilisert med protein A og protein G (1: 1). agarosekuler immunopresipitert prøver, pre-erte perler, og 5% inndata ble analysert ved Western blotting. IP-deteksjons sekundært antistoff ble brukt for å påvise proteiner bundet med alle anti-kanin og anti-muse foretrukne IgGs.
Strømningscytometri
Cellene ble behandlet i de respektive tidspunkter, trypsinert, og oppsamlet i fosfat-bufret saltvann (PBS) med 1% bovint serumalbumin (BSA). Celler ble behandlet slik som angitt med IFN-γ (300 enheter /ml) og bafilomycin A1 (Sigma-Aldrich). Levende celler ble farget for adenovirus-antigenene ved å bruke en kombinasjon av mus anti-adenovirus (blanding) belegg (1:75; Millipore, Billerica, MA, USA) og muse anti-adenovirus fiber antistoffer (1:75; ThermoScientific) i 30 min ved 4 ° C. Etter at cellene var vasket, ble de farget med APC-konjugerte anti-mus antistoffer (sekundære 1,75; Santa Cruz Biotechnology) i 30 minutter ved 4 ° C. For påvisning av den EGFRvIII epitopen (LEEKKGNYVVT), ble cellene farget med et monoklonalt antistoff (L8A4) fulgt av FITC-konjugert sekundært antistoff farging. De levende celler ble analysert ved bruk av en BD FACSCalibur (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NY, USA). Døde celler ble utelukket ved hjelp propidiumjodid- eller ethidium homodimer-1 flekker før analyse. Dataene representerer minst fire uavhengige forsøk.
splenocytt aktivering
Alle dyrestudier ble utført i veterinærtjenester ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center i samsvar med institusjonens retningslinjer og Guide for omsorg og bruk av Forsøksdyr. Studien ble godkjent av Universitetet MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). C57BL /6-mus (10-12 uker gamle) ble infisert intracranially med to injeksjoner (dag 0 og 3) av 1 x 10
8 pfu /mus Δ24RGD via førings-mannskap system, som beskrevet tidligere. [1] dyrene ble avlivet med anvendelse av en CO
2 kammeret; miltene ble fjernet andsmashed trau 100-um sil; [25] og splenocytter ble vasket med PBS. Røde blodceller ble fjernet via ACK Lysing buffer (Lonza, Houston, TX, USA). Vill-type og JNK knock-out MEFs ble sådd ut på en 10 x
5 celler i en 6-brønns plate (in triplo). Cellene ble infisert med 100 MOI på Δ24RGD i 24 timer, trypsinert, og re-platet inn i en 96-brønners plate ved 5 x 10
4 celler per brønn i RPMI 1640 medium med 10% FBS og 55 mM beta-merkaptoetanol . Splenocytter (1 x 10
6 celler) ble inkubert med MEFs i kultur i 24 timer. For eksperimenter inkludert blokkerer antistoffer, ble pre-infiserte MEF celler inkubert med to mikrogram av anti-mus MHC klasse II (IA /IE), anti-mus MHC klasse I (H-2KD) (eBioscience, San Diego, CA), eller mus IgG (Santa Cruz) 2 h før co-kultur med splenocytter. Splenocytter ble så inkubert med de pre-infiserte MEF-celler og blokkerende antistoffer i 24 timer. En mus IFN-γ ELISA Kit (ThermoScientific) ble anvendt for å evaluere konsentrasjonen av IFN-γ i 50 mL av mediet utvunnet fra ko-kultur. ELISA ble utført i henhold til produsentens anvisninger, og absorbans ble analysert ved hjelp av en Omega mikroplateleser (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland).
Statistisk analyse
En to-tailed Student
t
-test ble anvendt for å bestemme den statistiske signifikans av behandlede og infiserte prøvene i forhold til kontrollprøvene. P-verdier mindre enn 0,05 ble akseptert som statistisk signifikant.
Resultater
JNK-mediert autofagi regulerer presentasjon av adenovirus-deriverte antigener
patogen-avledet antigener kan bli behandlet i den autophagolysosomal rommet via autofagi, [10] men rollen autofagi i presentasjonen av adenovirus epitoper er ennå ikke bestemt. Med bruk av en blanding av anti-adenovirus protein-antistoffer, screenes vi infiserte celler i nærvær av adenovirus-avledede peptider på overflaten av levende, nonpermeabilized, infiserte celler. For disse studiene, vi tok fordel av det faktum at JNK-null-celler er mangelfull for autofagi. [15, 16] Vi observerte at mens mesteparten (mer enn 77%) av
JNK wt
MEFs infisert med adenovirus AdWT uttrykte proteiner på sin overflate, som påvist ved FACS-analyse (figur 1 A), den genetisk ablasjon av
JNK1 Hotell og
JNK2
isoformer resulterte i en betydelig nedgang i andelen av celler som testet positiv for adenovirus proteiner. Siden T-celleaktivering, gjenspeiles av syntesen og sekresjon av IFN-γ, er kjennetegnet metode for å bekrefte antigenpresentasjon gjennom interaksjoner mellom epitop-inneholdende MHC molekyler og T-celle-reseptoren, [26] vi sannsynligimmun relevansen av vår data ved å tallfeste utskillelsen av IFN-γ ved splenocytter fra infisert mus (naivt) eller adenovirus-behandlede mus (grunnede) i co-kultur med
JNK vekt
eller
JNK1 /2
– /- MEFs infisert med adenovirus. Som forventet, co-kulturer av naive splenocytes med adenovirus-smittet
JNK vekt
, eller
JNK1 /2
– /- celler ikke lokke fram betydelig sekresjon av IFN-γ. Imidlertid villtype MEFs infisert med adenovirus blir bedt om IFN-γ produksjon når ko-dyrket med splenocytter (figur 1B). I kontrast, kulturer av autofagi-mangel
JNK1 /2 Anmeldelser – /- MEFs med adenovirus-primet splenocytes inneholdt betydelig lavere utskilling av IFN-γ nivåer (fig 1b). Disse dataene viste at autofagi-svekket cellene er mangelfull for presentasjon av adenovirus-deriverte antigener til immunsystemet.
(a)
JNK vekt Hotell og
JNK
1 /2 – /- MEFs var mock-smittet eller infisert med AdWT (100 MOI) i 48 timer og inkubert med to kombinerte sett med anti-adenovirus antistoffer (en blanding av adenovirus kappeproteiner og adenovirus fiber). De ble deretter inkubert med APC-konjugert sekundært antistoff og analysert ved strømningscytometri. IgG-isotype ble anvendt som en kontroll. Propidiumjodid ble brukt for å vurdere cellenes levedyktighet og for å analysere levende celler. Data representerer prosentandelen av positive celler som gjennomsnitt ± SD. ***
P
0.001 (AdWT-smittet
JNK
1/2 – /- MEFs versus AdWT-smittet
JNK vekt
MEFs) (unpaired, tosidige Student
t-test)
. (B) Splenocytter ble isolert fra naive og Δ24RGD-infiserte C57BL /6 mus og co-dyrket med
JNK vekt
eller
JNK
1/2 – /- MEFs som var mock-smittet eller infisert med Δ24RGD adenovirus (100 MOI) i 24 timer før co-kultur. Etter 48 timer med ko-kultur, ble IFN-y-nivåer (pg /ml) i det kondisjonerte medium bestemt ved ELISA. Data representerer IFN-y-nivåer (pg /ml) som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige ko-kulturer. **
P
0.01 (uparet, tosidige Student
t-test
). (C) U87-MG-celler ble forbehandlet med DMSO, SP600125 (25 uM), eller bafilomycin A1 (BA1, 10 nM) 30 min før infeksjon med adenovirus Δ24RGD (50 MOI) i 48 timer. Levende celler ble inkubert med antistoffer dannet mot adenovirus kapsidproteiner, eller IgG-isotype som kontroll, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Prosentandelen av APC-positive celler ble kvantifisert og representert som gjennomsnitt ± SD (
n
= 3). *
P
0,05 (prosent av positive celler etter behandling med AdWT og SP600125 vs. AdWT og BA1) (unpaired, tosidige Student
t-test
). (D) Betydelig økning i presentasjonen av adenovirus antigener i celler infisert med Δ24RGD når rapamycin ble tilsatt til kulturene. U87 MG celler ble mock-infisert, infisert med Δ24RGD, eller infisert med Δ24RGD og rapamycin (100 nM /48 h) i 48 timer og deretter kontrollert for adenovirus antigener ved strømningscytometri.
Ytterligere støtte rollen til JNK og autophagy i behandlingen av adenovirus-avledede antigener, observerte vi at behandling av autophagy-dyktig infiserte kulturer med JNK-inhibitorer (SP600125) [27] eller autofagi magnetfelt-inhibitorer (bafilomycin A1 [28]) signifikant redusert prosentandelen av infiserte levende celler som presenterer i sine overflate adenovirus proteiner i FACS analyser (fig 1c). I overensstemmelse med disse data, motsatt Forsøket viste at forbehandling av infiserte celler med den autophagy-indus rapamycin [29] resulterte i en økning i prosentandelen av celler som testet positivt for adenovirus epitoper i FACS-screening (Fig 1 D). Kombinert, alle disse observasjonene sterkt at autophagy kan spille en rolle ved presentasjonen av patogen-avledede antigener i adenovirus-infiserte celler.
MHC klasse II er nødvendig for adenovirus antigener
Autophagy er involvert i behandlingen av peptider for presentasjon hovedsakelig via MHC klasse II molekyler, [10, 11] derfor bestemte vi oss for å bestemme hvorvidt antistoffbasert blokade av MHC klasse II hindret erkjennelsen av infiserte celler av adenovirus-splenocytter. For å oppnå dette, kvantifisert vi IFN-γ produksjon i ko-kulturer av adenovirus-splenocytter med virusinfiserte MEFs pre-inkubert med blokkerende antistoffer for MHC klasse I eller II. Vi har observert at celler behandlet med antistoffer mot MHC klasse II proteinene viste signifikant inhibering av IFN-γ produksjon sammenlignet med celler behandlet med antistoffer mot MHC klasse I-proteiner eller IgG-behandlede kontroller (figur 2A). For å bekrefte disse data vi utfordret presentasjon av adenovirus antigener ved hjelp av spesifikke siMHC klasse II (figur 2B). Vi observerte at ned-modulering av MHC-klasse II-mRNA resulterte i reduksjon i antallet celler som presenterer adenovirus epitoper (figur 2C). Indikerer den dominerende rollen til MHC klasse II i prosessen, viste at ned-modulering av MHC klasse I hadde mye mindre virkning på presentasjonen av adenovirus-avledede antigener enn gjorde den nedregulering av MHC klasse II. Disse data indikerer at adenovirus-avledede antigener er hovedsakelig presenteres via MHC klasse II, den dominerende vei av epitop presentasjon for proteinene bearbeides via autofagi. [10, 11]
(a) Mock- eller Δ24RGD-infiserte vill- skriver MEFs ble pre-inkubert med antistoffer mot MHC klasse I, klasse II MCH, eller IgG isotop og deretter ko-dyrket med splenocytter erholdt fra Δ24RGD-infiserte mus. Den sammenleggbare forandring av IFN-γ nivåer (pg /ml) i den ko-kulturmedium blir vist i forhold til kontroll og er vist som gjennomsnitt ± SD. **
P
0.01 (uparet, tosidige Student
t-test
). (B) Vill-type MEF-celler ble transfektert med et basseng av sinc, siMHCI, siMHCII, eller kombinerte like mengder siMHC I og siMHC II i 48 timer og deretter infisert med Δ24RGD adenovirus ved en MOI på 10 i ytterligere 48 timer . Hel-celle-lysater ble analysert ved hjelp av anti-MHC klasse I og anti-MHC klasse II-antistoffer. Effekten av hver behandling siRNA på proteinnivået av MHC-molekyler er illustrert. (C) Wild-type MEFs ble transfektert med en pool av sinc, siMHCI, siMHCII, eller kombinert like mengder siMHCI og siMHCII i 48 timer, og deretter infisert med Δ24RGD adenovirus ved en MOI på 10 for ytterligere 48 timer. Deretter ble cellene farget for påvisning av adenovirus antigener. Propidiumjodid ble brukt for å vurdere cellelevedyktighet. Data er vist som prosentandelen av positive celler (gjennomsnitt ± SD). Nedgangen i prosent av positive adenovirus-infiserte, siMHCII-transfekterte celler sammenlignet med adenovirus-infiserte, sinc-transfekterte celler var statistisk signifikant. **
P
0.01 (uparet, tosidige Student
t-test)
.
adenovirus strukturelle proteiner samhandle med p62 og brytes ned i autolysosome
Neste vi søkt å undersøke om strukturelle adenovirus proteiner ble degradert i autophagolysosomes. Fordi p62 anstand protein binder seg til ubiquitinmolekyler for deres håndtering og nedbrytning i autophagolysosomes, [30] vi analysert potensialet for interaksjon mellom p62 og fiber protein utføre co-immunoprecipitaton eksperimenter. Vi viste at adenovirus fiber protein ble ubiquitinmolekyler under adenovirus infeksjoner og interaksjon med p62 (fig 3A). I samsvar med en rolle autophagolysosome i nedbrytningen av adenovirus fiber protein, interaksjoner av p62 og fiber protein var mer tydelig i
Atg5 Anmeldelser – /- MEFs, som er mangelfull for adenovirus-indusert autofagi [7] ( figur 3A). Faktisk detaljert undersøkelse av fiber proteinnivåer ved flere tidspunkter etter infeksjon adenoviral viste bemerkelsesverdig høyere nivåer av disse proteiner i autofagi-manglende
Atg5 – /-
MEFs celler sammenlignet med villtype
Atg5
MEFs (
Atg5 vekt
) infisert med like mengder villtype adenovirus (fig 3B). Videre observerte vi også at etter adenovirus infeksjon var det en betydelig nedgang i andelen av celler som presenteres adenovirus proteiner i
Atg5 – /-
MEFs kulturer sammenlignet med
Atg5wt
MEFs (Fig 3C ). Som forventet, ble lignende resultater observert med
p62
– /- MEFs infisert med adenovirus som bekrefter at mangel på
p62
ekspresjon resulterte i en betydelig reduksjon av prosentandelen av adenovirus belegge-positive celler med når det gjelder adenovirus-infiserte vill-type
p62
MEFs (figur 3D), sannsynligvis på grunn av mangelfull p62-mediert transport av adenovirus proteiner til autophagosome. Disse dataene videre foreslått at adenovirus proteiner ble degradert i autophagolysosomes under aktiv autophagic flux resulterer i presentasjon av adenovirus-deriverte epitoper på vertscelleoverflaten.
(a) Cellelysater fra
Atg5wt
eller
Atg5 – /-
MEFs infisert med AdWT (50 MOI) ble analysert for fiber /ubiquitin og fiber /P62 protein komplekser. LC3-I til LC3-II-konvertering og p62 ekspresjonsnivåene ble analysert i et inngangs prøve (5%). Aktin er vist som en lasting kontroll. (B) Cellelysater fra
Atg5wt Hotell og
Atg5 Anmeldelser – /- MEFs var mock-smittet eller infisert med AdWT (50 MOI) for de angitte tider og analysert for adenovirus fiber uttrykk. Actin ble brukt en lasting kontroll. (C)
Atg5wt Hotell og
Atg5 – /-
MEFs ble mock-smittet eller infisert med AdWT adenovirus (50 MOI) i 48 timer og deretter farget med antistoffer mot adenovirus kappeproteiner, inkubert med APC-konjugert sekundært antistoff og analysert ved strømningscytometri. IgG-isotype ble anvendt som en kontroll. Propidiumjodid ble brukt for å vurdere cellelevedyktighet. Data er vist som prosent av APC-positive celler (gjennomsnitt ± SD) av tre uavhengige eksperimenter. ***
P
0,001 (prosentandel av APC-positive i AdWT-smittet
Atg5wt
celler vs. AdWT-smittet
Atg5 Anmeldelser – /- celler) (unpaired, tosidige Student
t-test
). (D)
p62wt Hotell og
p62 – /-
MEFs ble infisert med AdWT adenovirus (100 MOI) i 48 timer og deretter farget med antistoffer mot adenovirus kappeproteiner, inkubert med APC-konjugert sekundært antistoffer, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. IgG-isotype ble anvendt som en kontroll. Propidiumjodid ble brukt for å vurdere cellelevedyktighet. Data er vist som prosent av APC-positive celler (gjennomsnitt ± SD) av tre eksperimenter. ***
P
0.001 (prosent av APC-positive celler i AdWT-smittet
p62 Anmeldelser – /- vs. AdWT-smittet
p62wt
celler) (unpaired, tosidige Student
t-test
).
Generering av Δ24FvIII adenovirus
Modifisering av adenovirus kapsider ved innsetting av antigener sekvenser er en lovende teknologi for utvikling av vaksiner og anti-kreftvaksiner, [31] og derfor søkt å bestemme hvorvidt autofagi var den viktigste mekanisme for behandling av ektopiske kreftspesifikke epitoper som kodes for av adenovirus fibre. Deretter genereres en eksperimentell modell som ville tillate oss å fastslå hvorvidt en bestemt sekvens i den adenovirale fiber kunne påvises i adenovirus-infiserte celler. For å oppnå dette har vi konstruert og bygget et chimerisk adenovirus fiber som omfatter sekvensen av et godt karakterisert humant epitop (figur 4A). Den resulterende konstruksjonen ble betegnet Δ24FvIII, og brukt Δ24 tumor-selektive ryggrad adenovirus [32] og kodet epitopen LEEKKGNYVVT innsatt i HI-løkken av adenovirus fiber-sekvensen. Dette peptid er avledet fra junctional sekvensen til det avkortede protein som genereres i den muterte varianten III av mutanten EGFR og har tidligere blitt vist å være sterkt immunogent [21] (figur 4A).
(a) Skjematisk representasjon av genereringen av de kimære VIII fiber. PCR-basert mutagenese ble brukt til å sette inn den sekvensen av LEEKKGNYVVT epitop i den hypervariable region av HI-sløyfe. Et unikt EcoRV-restriksjonssete ble innlemmet for å tillate innsetting av ektopisk sekvens mellom glycin-543 og asparaginsyre-544. (B) Ekspresjon av det kimære fiber som omfatter LEEKKGNYVVT peptidet ble vurdert i A549-celler infisert med Δ24FvIII (40 MOI). Protein lysater ble underkastet Western blot-analyse 72 timer etter infeksjon ved anvendelse av både anti-fiber og L8A4 anti-LEEKKGNYVVT antistoffer. (C) Levende villtype
Atg5 Kjøpe og
Atg5
– /- MEFs ble infisert med Δ24FvIII på en MOI 150 i 48 timer og deretter farget med L8A4, etterfulgt av FITC-konjugerte sekundære antistoffer for flowcytometri analyser. Etidium homodimer-1-farging ble anvendt for å ekskludere døde celler. Prosenter av FITC-positive levende celler er angitt øverst i høyre hjørne på hver graf. Nedgangen i antall positive celler i Δ24FvIII-smittet
Atg5 Anmeldelser – /- sammenlignet med Δ24FvIII-infiserte villtype
Atg5
celler var statistisk signifikant. Data er vist som gjennomsnitt ± standardavvik for tre eksperimenter. ***
P
0.001 (uparet, tosidige Student
t-test
). (D) HeLa-celler ble infisert med Δ24FvIII ved en MOI på 40. IFN-γ (300 enheter /ml) eller /og bafilomycin A1 (BA1; 100 nM) ble tilsatt til mediene 6 timer eller 24 timer etter infeksjon, respektivt. Levende celler ble farget med L8A4 48 timer etter infeksjon, og deretter inkubert med FITC-konjugert sekundært antistoff for å visualisere positive celler med et strømningscytometer. Etidium homodimer-1-farging ble anvendt for å ekskludere døde celler. Diagrammet representerer middelverdier fra tre forsøk ± SD. *
P
0,05; **
P
0.01 (uparet, tosidige Student
t-test
).
Celler infisert med F_21 «\\ o» Humphrey, 1990 # «thEGFRvIII-avledet kreft-spesifikke epitop 149
Ved hjelp av en svært spesifikk antistoff generert mot EGFRvIII peptidet [21], vi dokumentert at ekspresjonen av det kimære fiber ble lett detektert i Δ24FvIII-infiserte celler (figur 4B). Vi antok at ektopisk sekvensen til det humane epitop satt inn i den adenovirale fiber ble behandlet via autophagy og presentert på overflaten av infiserte celler Derfor, etter villtype og autofagi-mangel
Atg5
-. /- MEFs ble infisert med Δ24FvIII, overflatene av levende celler ble undersøkt for tilstedeværelse av LEEKKGNYVVT med bruk av det spesifikke antistoff [21] og FACS-analyser. Vi viste at en høy prosentandel av villtype
Atg5
MEFs ble positivt identifisert ved den anti-LEEKKGNYVVT antistoff (fig 4C .) Men prosentandelen av positive celler ble betydelig redusert i autofagi-mangel
Atg5 Anmeldelser – /- MEFs infisert med Δ24FvIII adenovirus (fig 4C). Lignende data ble oppnådd når HeLa-celler ble infisert med adenovirus Δ24FvIII og autophagy fluks ble blokkert med bafilomycin A1. Således er andelen av HeLa-celler som presenterer det LEEKKGNYVVT peptidet minsket dramatisk når de infiserte kulturer ble behandlet med bafilomycin A1 (figur 4D). Sterkt at den spesifikke aktivering av antigen-prosessering maskineri under infeksjon, presentasjonen av LEEKKGNYVVT peptidet økt etter tilsetning av IFN-γ, som transkripsjonelt aktivere MHC, [33] til kulturene infisert med adenovirus Δ24FvIII (figur 4D). Til slutt, noe som ytterligere viser den rolle autophagy i behandlingen av LEEKKGNYVVT, bafilomycin A1 forbehandling induserte en blokkerende virkning som antagoniseres og betydelig redusert den positive modulering av antigen-presentasjon mediert av IFN-γ (figur 4D).
diskusjon
Vårt data gir bevis for første gang at inhibering av autophagy i adenovirus-infiserte celler forhindrer effektiv presentasjon av adenovirus-avledede og fiber-inkorporerte kreftspesifikke epitoper. Vi har også vist at adenovirus proteiner samhandle med autophagy last-reseptor-p62 protein, sterkt tyder på at p62 kan bære adenovirus kapsidproteiner til autophagosome. Interessant nok har p62 blitt foreslått å fungere som en potensiell sensor for virus infeksjon og koblingen mellom virusproteiner og autofagi. [34] Det faktum at p62 binder adenovirus fiber sterkt antydet at autofagi var involvert i adenovirus protein degradering.
