Abstract
Av de anslagsvis 565,650 mennesker i USA som vil dø av kreft i 2008, nesten alle vil har metastaser. Bryst, prostata, nyre, skjoldbruskkjertel og lunge cancer metastasere til benet. Tumorceller bor i benet ved hjelp av inte typen celleadhesjonsprosesser reseptorer og lokke fram invalidiser bensmerter og frakturer. Spesielt, metastatisk human prostata tumorer uttrykker og spalte grin A6, en reseptor for ekstracellulære matriks-komponenter i ben, dvs. laminin 332 og laminin 511. Mer enn 50% av alle prostatakreftpasienter utvikler alvorlig bensmerter i løpet av gjenværende levetid. En viktig målsetting er å forhindre eller forsinke kreft indusert skjelettsmerter. Vi brukte en ny xenograft musemodell for direkte å bestemme om bensmerter kan forebygges ved å blokkere den kjente spaltning av A6-integrin-reseptor-adhesjon. Humane tumorceller som uttrykker enten villtype eller muterte A6-integrin ble plassert inne i levende benmatriks og 21 dager senere, integrin-ekspresjon ble bekreftet ved RT-PCR, ble røntgen oppsamlet og atferdsmessige målinger av spontan og fremkalt smerte utført. Alle dyr som er uavhengige av inte status hadde utvisket tumorbelastning og utviklet bentap 21 dager etter operasjonen. En sammenligning av dyr inneholdende villtype eller muterte integrin vist at tumorceller som uttrykker det muterte integrin resulterte i en dramatisk reduksjon av bentap, unicortical eller bicortical frakturer og en reduksjon i evnen til tumorceller å komme epiphyseal plate av benet. Videre kreftceller i bein uttrykker inte mutasjon forhindret kreft indusert spontan flinching, taktil allodyni, og bevegelse fremkalt smerte. Forebygging av A6 inte spaltning på prostata tumorcelleoverflaten redusert migrering av tumorceller i benet og utbruddet og graden av bensmerter og frakturer. Disse resultatene tyder på at strategier for å blokkere spalting av adhesjonsreseptorer på tumorcelleoverflaten i betydelig grad kan forhindre kreft indusert skjelettsmerte og langsom sykdomsutvikling inne i benet. Siden inte spalting er mediert av Urokinase-type plasminogen Activator (uPA), videre arbeid garantert å teste effekten av uPA hemmere for forebygging eller forsinkelse av kreft indusert bensmerter
Citation. Kongen TE, Pawar SC, Majuta L, Sroka IC, Wynn D, Demetriou MC, et al. (2008) The Role of Alpha 6 Inte i Prostate Cancer Migrasjon og Bone Smerter i en Novel Xenotransplantat Model. PLoS ONE 3 (10): e3535. doi: 10,1371 /journal.pone.0003535
Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 27 juni 2008; Godkjent: 26 september 2008; Publisert: 28 oktober 2008
Copyright: © 2008 Kong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet delvis av NIH tilskudd CA56666, CA23074, og GM008718. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
av de anslagsvis 565,650 mennesker i USA som vil dø av kreft i 2008, nesten alle vil ha metastase [1]. Bryst, prostata, nyre, skjoldbruskkjertel og lunge cancer metastasere til benet. Kreftceller i bein lokke fram osteolytiske og osteoblastiske reaksjoner og invalidiserende skjelettsmerter og frakturer [2], [3]. En viktig målsetting er å forhindre eller forsinke kreft indusert skjelettsmerter. Invasive og metastatiske menneske prostatakreft uttrykkelig inte A6B1, en reseptor for ekstracellulære matrise komponenter av bein, dvs. laminin 332 og laminin 511 [4] – [10]
Menneskelig prostata kreft er en lat sykdom preget av. progressive vedheft endringer i løpet av overgangen fra normale kjertler til prostatahyperplasi intraepitelial neoplasi (PIN) til invasiv kreft [5], [16] – [19]. Nyere arbeider har vist endring i den normale humane prostatavevet organisering og adhesjonsmolekyler i løpet av prostatatumorprogresjon [5], [15]. Flukten fra prostatakjertelen og invasjon gjennom kapselen er assosiert med dårlig prognose, mens begrenset sykdom behandles. Endringer i adhesjonsmolekyler og nedstrøms signal konsekvensene kan redegjøre for stimulert invasjonen av kreftceller fra nettstedet deres opprinnelsesland. Inte er trans heterodimer celleadhesjonsprosesser reseptorer [15]. Inte uttrykk innenfor det normale prostatakjertelen gjenspeiler mangfoldet av ekstracellulære matrix komponenter. Normale mønstre av inte uttrykk blir opprettholdt i lesjoner som normale basal celler beholdes og invasjonen har ikke inntruffet (dvs. PIN-lesjoner) [5], [16] – [19]. Men innenfor invasive karsinomer, flertallet av integrin subenheter er ikke observert på tumorcelleoverflater. Et bemerkelsesverdig unntak til den gjennomgående tap av integrin uttrykk er vedvarende ekspresjon av laminin-reseptorer, A3 (10% av tilfellene) og A6 (69% av tilfellene) integriner, observert i invasive humane prostata-karsinom oppnådd etter radikal prostatektomi [5], [17]. Studier tyder på at laminin reseptorer A6B1 og A3B1 er opprettholdt i de fleste av prostata karsinom. Under den menneskelige PIN-koden til prostata carcinoma overgang, er A6B4 integrin uttrykk tapt og A6B1 integrin dominerer i invasiv human prostatakreft og metastatiske lesjoner i [4], [6]. Tallrike studier har innblandet A6 inte i kreft progresjon [20]. Den ekstracellulære ligander for A6B1 er laminin 332 og 511, fremtredende bestanddeler av mennesker og mus benmarg [7], [21].
En inspeksjon av A6B1 inte uttrykk på prostata kreftceller avslører en ny strukturell variant på celleoverflaten kalt A6pB1 [11], [14], [22]. A6 integrin subenheten blir spaltet i to på tumorcelleoverflaten ved bestemte aminosyrerester som resulterer i tap av beta fat domene, og la resten av reseptoren intakt [12]. Prostatatumorceller som uttrykker en mutert reseptor som ikke kan bli spaltet, resulterte i en inhibering av tumorcellemigrering på laminin 332 i henhold til vevskultur betingelser [13].
I denne undersøkelsen bestemmes vi hvis integrin spaltning ville påvirke tumorcelle migrasjon i en klinisk relevant metastase område, for eksempel bein. Vi brukte en roman xenograft mus modell av bensmerter å direkte fastslå effekten av humane tumorceller plassert innenfor den levende beinmassen på kreft indusert skjelettsmerter. Benmargen er rik på laminin 332 (Laminin 5) og laminin 511 (Laminin 10) [8], [9], er ligander for integrinet A6B1 [7]. Vi testet ytterligere påvirkning på kreft indusert skjelettsmerter siden tidligere arbeid sterkt innblandet griner i vedlikehold av nevropatisk smerte [23].
Resultater
Derfor brukte vi PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR-prostatacancerceller som uttrykker ekvivalente nivåer av vill-type A6 subenheten (spaltes til å A6p via uPA behandling) og de ikke-spaltbare subenhet, henholdsvis (fig. 1a). Overflate ekspresjonsnivåene til reseptorene var tilsvarende som bestemt ved strømningscytometri (FACS) analyse (Fig. 1b). Evnen til å spalte reseptoren av urokinase-type plasminogen-aktivator (uPA) og genereringen av A6p strukturelle variant er skjematisk vist (Fig. 1c). Vi testet neste de funksjonelle egenskapene til A6 integrin ved hjelp av en laminin 111 inneholdende matrise, Matrigel, modifisert til å inneholde laminin 332. Matrigel er et laminin rik ekstracellulær matriks som modellerer fysiologisk relevante betingelser [24]. De PC3N-A6-WT celler migrert i matrigel på en måte som er integrinavhengig (fig. 1d). Cellene som inneholder uncleavable reseptoren, PC3N-A6- RR, ikke var i stand til å migrere i matrigel, i samsvar med tidligere resultater ved bruk av vev dyrkningsbetingelser rutine (Fig. 1d) [13].
(A) Ekspresjon av den fulle lengde 6 integrin (6) og uPA avhengig produksjon av 6p-variant (6p) ble bestemt ved western blot-analyse. Intestatus innenfor de totale cellelysatene fra doksycyklin (Dox) eller urokinase (uPA) ubehandlet (-) og behandlet (+) PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR-cellelinjer ble bestemt. (B) Overflate ekspresjon av villtype og mutert integrin 6 i doksycyklin indusert PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR-celler ble bestemt ved flow-cytometri. PC3N-A6-WT og PC3NA6- RR-celler ble inkubert med primært Rotte anti-integrin-antistoff A6 J1B5 fulgt av Alexa 488 anti-rotte-antistoff, og visualisert ved hjelp av BD FACScan. Den grå topp indikerer fluorescens signal fra sekundært antistoff bare. (C) Skjematisk å illustrere spaltning av full lengde formen av 6 integrin for å gi det 6p varianten. Definisjonen av PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR celler med hensyn til inte status vises. (D) Inte mediert migrering av PC3N-A6-WT celler (øverst paneler) og PC3NA6- RR celler (bunnpaneler) på matrigel. Cellene ble plassert på matrigel i nærvær av et dekkglass for å skape en celle fri sone på Matrigel overflaten. Etter celleadhesjon var fullført, ble objektglassene fjernet fra matrigel overflaten for å tillate migrering inn i den cellefrie sone antydet med hvitt eller svart buet linje. -Cellemigrering Det oppsto under optimale vekstbetingelser ved 37 ° C i ca. 18 timer. Cellene ble enten tillatt å migrere i fravær (venstre panel) eller nærvær (høyre panel) av inte blokkere antistoff AIIB2. Bilder ble oppsamlet under anvendelse av et Zeiss Axiovert mikroskop utstyrt med en 2,5x objektiv.
For å bestemme effekten av humane prostatacancerceller i benet, vi tilpasset den Clohisy-Mantyh murine modell hvor kreften cellene blir injisert direkte og forseglet i femur av en mus [25]. Hann SCID-mus ble bedøvet med ketamin /xylazin og en artrotomi ble utført eksponere kondylene av den distale femur som tidligere beskrevet [26]. Et hull ble boret i femur for kanylen for å sikre nøyaktig plassering av tumorceller i benet. Den nøyaktige plassering av nålen inn i benmargsrommet av femur ble bekreftet av imaging (Fig. 2a, venstre panel). Menneskelig prostata kreftceller ble injisert i høyre ben av musen og injeksjonsstedet forseglet med amalgam (Fig. 2a, panel til høyre).
(A) Røntgen bildene ble tatt for å bekrefte nål plassering inne i benmargs plass av femur opp til den distale tredjedel av benet (venstre panel). Tumorcellene ble forseglet inn i benet (høyre panel). (B) radiographic bilder tatt på 21 dager etter injeksjoner indikerer bentap enten fra ubehandlede mus (kontroll) eller mus injisert med tumorceller som uttrykker villtype inte (PC3N-A6-WT) eller muterte inte (PC3N-A6-RR). (C) Kvantifisering av bentap hos dyr enten humbug injisert (Control) eller injisert med tumorceller som uttrykker villtype inte (PC3N-A6-WT) eller muterte inte (PC3N-A6-RR). Bentap ble vurdert i henhold til følgende fem punktsskala: 0 = normal, 1 = bentap observert i løpet av mindre enn halvparten av den distale tredjedel av bein, 2 = bentap observert i mer enn halvparten av den distale tredjedel av benet, ingen brudd, 3 = full tykkelse unicortical bentap indikerer unicortical beinbrudd, 4 = full tykkelse bicortical bentap indikerer bicortical beinbrudd. (D) Den prosent av mus med brudd 21 dager etter operasjonen. Antallet mus i hver gruppe var tolv.
neste fastsatte de skadelige virkningene av kreftceller bosatt i benet ved hjelp av standard røntgenfotografering i levende dyr 21 dager etter operasjonen. Alle dyr injisert med PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR celler utviklet bentap 21 dager etter operasjonen (fig. 2b). Bilder viste gjennomgående osteolytic aktivitet, spesielt i metafysile ben ved den distale (kne) enden av femur. Mus injisert med PC3N-A6-WT-celler som viser dramatisk mer bentap i forhold til de injisert med PC3N-A6-RR-celler. Ingen bentap ble observert i dyr injisert med media alene (figur 2b). Dyr injisert med de PC3N-A6-WT celler viste økt beintap i forhold til de injisert med PC3N-A6-RR-celler (Fig. 2b). Røntgenbildene ble vurdert i henhold til en 4-punkts skala der 0 indikerer normal bein og 3 indikerer full tykkelse bicortical bentap (Fig. 2c). Dyr injisert med PC3N-A6-WT-celler viste en dramatisk økning i sprekker (unicortical eller bicortical) 21 dager etter kirurgi sammenlignet med de PC3N-A6-RR-behandlede mus (Fig. 2d). Disse data indikerer at plassering av tumorceller i benet inneholdende en ikke-spaltbare A6 integrin resulterer i en betydelig forsinkelse i utviklingen av bentap.
Selv om avbildningsresultatene gitt informasjon om alvorlige bendestruksjon, det gjorde ikke gi direkte informasjon om fordelingen av tumorcellene. Bentap er en konsekvens delvis av tumorceller resident i ben; et arrangement som gir en dramatisk påvirker den kritiske balanse mellom osteolytisk og osteoblastisk aktivitet [3]. Vi undersøkte direkte fordelingen av tumorcellene i benet ved hjelp av histologisk analyse av hemotoxylin og eosin farging av decalcified prøver. Muse ben ble forsiktig orientert for langsgående seksjonering for å inkludere observere epiphyseal platen, så vel som den fjerne regionen av benet i den samme seksjon (fig. 3A, øvre panel). Analysen av bein fra tumor injiserte dyrene viste tilstedeværelse av tumor i hele intramedullære plass av benet i de injisert med PC3N-A6-WT-celler sammen med invasjon inn i det kortikale ben (fig. 3A, midtpanel). Tumorcellene som inneholder det spaltbare inte hadde nådd epiphyseal plate; benmargen ble fullstendig erstattet. Dette resultatet er i tråd med kunnskapen om at når prostatakreft har etablert seg i beinmargen vil det etter hvert erstatte marg, avbryte bein homeostase [3]. I kontrast, PC3N-A6-RR injisert dyr inneholdt kreftceller i midten av akselen regionen i benet og svulsten ikke klarte å nå epifyse plate. Normal benmarg var til stede i de områdene som ikke inneholder kreftceller (Fig. 3A, bunn panel). Tumorcellene i midten av akselen region, eller de som hadde nådd epiphyseal plate var levedyktige og ikke skilles morfologisk. (Fig. 3A, senter og nedre panelet, innfellinger). Tumoren fordelingsmønsteret ble funnet å være konsistent i histologisk analyse av alle forsøksdyrene analysert.
(A) Hematoxylin-eosin-farging av den normale ben (kontroll) eller ben injisert med PC3N-A6-WT celler (WT, midtre panelet og innfelt) og PC3N-A6-RR celler (RR, bunn panel og innfelt). Veksten plate av bein (epifyse plate) er orientert øverst til venstre på hvert panel for sammenligningsformål. (B) RT-PCR-analyse for å påvise ekspresjon av det muterte 6 integrin i benmargen. Tyve dager etter en injeksjon, ble benmarg høstet, RNA ble ekstrahert og analysert. RNA fra PC3N-A6-WT celler og PC3N-A6-RR celler som vokser i vevskultur ble sammenlignet med benmargen isolert fra mus injisert med PC3N-A6-WT celler (Benmargs-WT celler) eller PC3NA6- RR celler (bein marg-RR celler). GAPDH forsterkning ble gjennomført som kontroll og KB markører som vist.
For å bekrefte at de injiserte tumorceller ble uttrykker det muterte inte, 21 dager etter injeksjon av PC3N-A6-WT eller PC3N-A6-RR celler, margen ble uttrykt fra benmargs plass av muse lårben. Analyse av benmargsprøver resulterte i mRNA spesifikke for de PC3N-A6-RR celler i margen fra mus injisert med PC3N-A6-RR, men ikke PC3N-A6-WT mus. Disse data indikerte at PC3N celler transfektert med den uncleavable A6 integrin opprettholdt ekspresjon av det mutante integrin innenfor den intramedullære plass av femur og var til stede 21 dager etter injeksjon av cellene inn i femur (Fig. 3B).
behavioral analyser av spontan og fremkalt smerte ble bestemt 21 dager etter injeksjon av PC3N-A6-WT eller PC3N-A6-RR-celler til femur for å vurdere rollen til spalting av A6-integrin på utviklingen av spontan og fremkalt kreftsmerter atferd. Spontan smerte ble målt ved å vurdere flinching av kreft behandles bakbenet som tidligere beskrevet [26]. Mus injisert med PC3N-A6-WT celler viste økt spontan flinching atferd i forhold til PC3N-A6-RR behandlede mus som viste lave nivåer av flinching som var sammenlign å kontrollere dyr (Fig. 4a). Fremkalt smerte, som indikert av berørings-allodyni, ble bestemt ved potetilbaketrekning fra sentret av bakpoten ipsilaterale til kreft ble behandlet femur med kalibrerte von Frey filamenter som tidligere beskrevet [26]. Mus injisert med PC3NA6-WT celler viste berørings-allodyni som antydet med de senker terskelen for potetilbaketrekning fra von Frey-filamenter (fig. 4b). I kontrast, PC3N-A6-RR injisert mus viste ikke taktil allodyni, med labben-uttak terskler lignende for å kontrollere dyr (Fig. 4b). Movement-fremkalt smerte ble bestemt etter rating lem bruk under normale oppegående bevegelse som tidligere beskrevet [26]. Mus injisert med PC3N-A6-WT celler utviklet bevegelse fremkalt smerte mens mus injisert med PC3N-A6-RR celler viste ingen bevegelse-fremkalt smerte, med lem bruke karakterer på samme måte som kontrolldyrene (fig. 4C).
(A) Spontaneous smerte som målt ved å trekke seg tilbake fra den ipsilaterale bakben ble bestemt i narre injiserte dyr (kontroll) eller de som er injisert med tumorceller som uttrykker villtype-integrin (PC3N-A6-WT) eller de som er injisert med tumorceller som uttrykker den muterte inte (PC3N-A6-RR). Høyde i flinching atferd er tegn på økt smerterespons. (B) berørings-allodyni som målt ved pote-tilbaketrekning fra von Frey filamenter i narre injiserte dyr (kontroll) eller de som er injisert med tumorceller som uttrykker villtype-integrin (PC3N-A6-WT) eller de som er injisert med tumorceller som uttrykker den muterte integrin (PC3N-A6-RR). En reduksjon i uttrekkings terskelen er indikativ for en øket smerterespons. (C) bevegelse utløste smerter ble observert i narre injisert dyr (kontroll) eller de injisert med tumorceller som uttrykker villtype inte (PC3N-A6-WT) eller de injisert med tumorceller som uttrykker det muterte inte (PC3N-A6-RR) .
Disse data indikerer at spaltning av integrin A6 påvirket utviklingen av spontan cancerinduced og fremkalt smerte assosiert med bentap og brudd. Forebygging av spalting av inte A6 dramatisk redusert bentap og utvikling av cancerinduced smerte. I kontrast, uttrykk for den spaltbare A6 inte økt cancerinduced bentap og brudd med en samtidig økning i smerte oppførsel.
Diskusjoner
I denne studien har vi utnyttet en direkte innsprøytning bein modell for å spesifikt plassere menneskelig prostata tumorceller direkte inn i fysiologisk og klinisk relevante ben miljø, rik på laminin 332 og 511. Dette tillater oss å fastslå om å blokkere produksjon av en laminin-reseptor (A6pB1) vil endre evnen som tumorceller til å migrere eller modifisere miljøet innenfor benet og om dette holdes funksjonell betydning i form av bensmerter.
resultatene viste at å modifisere produksjonen av A6pB1 laminin reseptor på tumorcelleoverflaten kan bemerkelsesverdig hindre migrering inne i benet. Den direkte injeksjon modellen gir mulighet for nøyaktig plassering av kjente antall av tumorceller i benet. Ettersom tumorcellene vokser like godt uavhengig av intestatus [13], [27] (både i vevskultur og som humane tumorer i mus), tyder dataene på at fordelingen av tumorceller innenfor ben kan være et nøkkelelement som påvirker kreft indusert skjelettsmerter. Den manglende evne for tumorceller å komme epiphyseal område av benet som følge av intestatus falt sammen med en bemerkelsesverdig reduksjon av tre distinkte adferdssmertemålinger. Selv om det er ukjent hvorvidt tiden plassering av tumorceller innenfor ben og bensmerter ble funksjonelt knyttet sammen, har andre rapporter indikert at i ben, microenvironments er tilstrekkelig tydelig til å rettferdiggjøre denne mulighet [28].
Det er mulig at den redusert skjelettsmerter er på grunn av den manglende evne til integrin å bli spaltet, uavhengig av plasseringen av tumorcellene i benet. Inte og cadherins spaltes eller skur på tumorcelleoverflater [29] – [32]. De frigjorte fragmenter av reseptorer som gjennomgår ectodomain spalting er biologisk aktive og kan bidra til kreft indusert bensmerter [33]. Videre forsøk vil skille mellom disse mulighetene.
Selv om skjelettmetastaser er tradisjonelt antatt å være enten osteolytic eller osteoblastisk har morfologiske analyser viste at i de fleste pasienter, skjelettmetastaser har både osteolytic og osteoblastiske elementer [38]. I prostatakreftpasienter, skjelettmetastaser viser ofte mer osteoblastisk fenotype, selv om noen pasienter har osteolytiske lesjoner lik dem man ser hos pasienter med metastatisk brystkreft [38]. Denne forskning fokusert på en human prostatakreft-cellelinje som produserte det meste osteolytisk benremodelleringen i mus benet. Den manglende evne til integrin til å bli spaltet resulterte i redusert bentap og brudd. Som de fleste bentap og brudd er observert ved den distale ende av benet, til den manglende evne av tumorcellene nå epiphyseal område av benet kan ha redusert bentap og brudd i dette området. Fremtidige studier på rollen til inte på osteoblastisk benremodelleringen ville være nødvendig for å fastslå om endring inte funksjonen vil også endre osteoblastiske reaksjoner i benet.
Til slutt ser vi at kreft indusert ben ødeleggelse er assosiert med alvorlig redusert kvalitet på liv stammer fra komplikasjoner som hyperkalsemi, beinbrudd og invalidiserende smerter. Fremskritt innen kreft deteksjon og behandling er utvide forventet levealder for kreftpasienter og øker fokus på å forbedre pasientenes livskvalitet. Både bruk av romanen xenograft mus modell for å studere forebygging av kreft indusert bensmerter og målretting adhesjonsreseptorer på tumorcelleoverflaten for benet bør ha betydelig innvirkning på livskvaliteten for pasienter med metastatisk sykdom.
Materialer og metoder
Menneskelig Prostate Cancer Cell Lines
PC3N celler ble transfektert med plasmider som inneholder enten villtype eller mutert inte A6 som tidligere beskrevet [13]. De stabile kloner (PC3N-A6-WT som uttrykker villtype-integrin A6 og PC3N-A6-RR som uttrykker de ikke-spaltbare integrin A6) ble isolert og holdt ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2. PC3N-A6-WT og PC3N-A6-RR-celler ble dyrket i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) pluss 10% føtalt bovint serum (FBS) i nærvær av 6 g /ml Blasticidin ( Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) og 1 g /ml Zeocin (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)
antistoffer og kjemikalier
antistoffene var som følger:. J1B5, rotte monoklonale anti A6 inte (Dr. Caroline Damsky, University of California, San Francisco, USA) [34]; AA6A kanin polyklonalt anti-A6-integrin-antistoff [13] og AIIB2, rotte monoklonalt anti-B1-integrin-antistoff [35] (American Type Culture Collection). Menneskelig rekombinant EGF ble kjøpt fra Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA. Urokinase ble kjøpt fra Chemicon (Temecula, CA, USA).
Immunoblotting
Celler ble dyrket til konfluens og deretter vasket tre ganger med HEPES buffer og lysert i kaldt RIPA buffer pluss proteasehemmere (PMSF , 2 mM, leupeptin og aprotinin, 1 pg /ml). Lysatene ble kort sonikert på is før den ble suspendert i 2 x ikke-reduserende prøvebuffer. Prøvene ble kokt i 5 minutter, og etter en rask kjøle på is, ble de fylt på 7,5% SDS-PAGE. Proteiner løst i gelen ble elektrooverført til Millipore Immobilon-P polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA, USA), inkubert med Western blotting antistoffer pluss sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase og visualisert ved kjemiluminescens (ECL western blotting Detection System , Amersham, Arlington Heights, IL, USA).
Matrigel Migration analysen
Seks brønners plater ble belagt med 1 ml Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) og supplert med laminin 332 inneholder betinget medium fra HaCaT-celler i forholdet 2:01 og tillates å størkne. En steril sirkulær dekkglass ble plassert i midten. Cellene ble deretter sådd ut på plater og tillatt å følge i 2 timer ved 37 ° C. Eventuelle ikke-adherente celler ble fjernet og deretter Dekkglass ble fjernet etterlater en klar sone i sentrum av platen. Periferien av denne sone ble markert. Serumfritt medium, eller serumfritt medium med blokkerende antistoff ble tilsatt til cellene og inkubert ved 37 ° C i 18 timer. 1 ng /ml EGF ble lagt til media for å indusere migrasjon. Cellene ble observert ved hjelp av en Zeiss Axiovert mikroskop (2,5 × forstørrelse) og bilder ble samlet inn ved hjelp av en CCD-kamera.
Kirurgi
Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av University of Arizona institusjonell dyr omsorg og bruk komité, IACUC protokollen # 06-081. Dyrene ble bedøvet med ketamin /xylacine og en artrotomi ble utført eksponere kondylene av den distale femur. Et hull ble boret inn i femur, og kanylen ble satt inn i hullet. Faxitron bildene ble tatt på 2 plan for å verifisere nål plassering inne i benmargs plass av femur. PC3N-A6-WT, eller PC3N-A6-RR-celler, 10
6 i 5 ul av filtrert minimalt essensielt medium (MEM) inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA), eller 5 ul av filtrert MEM inneholdende 1% BSA alene (kontroll) ble injisert inn i den intramedullære plass av musen femur av høyre ben og injeksjonsstedet ble forseglet med amalgam. For de følgende forsøk 12 dyr fikk PC3N-A6-WT, 12 fikk PC3N-A6-RR celler, og 12 dyr fikk cellefritt serum (kontroll).
Behavioral Pain Tiltak [26]
Movement-fremkalt smerte
. Musen ble plassert i et tomt mus panorering og observert mens du går over pannen i en kontinuerlig bevegelse. Limping og /eller vokter oppførselen til høyre (kreft injisert) bakben ble vurdert på følgende skala: 0 = fullstendig mangel på bruk, 1 = delvis ikke-bruk, 2 = halting og vokter, 3 = halting, 4 = normal gange.
Spontan smerte
. For å vurdere å trekke seg tilbake og vokter atferd, ble dyrene plassert i økte plexiglass kamre med en stålgittergulv for observasjon av flinching og vokter av høyre bakben. Musene fikk lov til å akklimatisere seg til kammeret i 20 minutter. Vokter og flinching atferd av hver mus ble målt i 2 minutter. Antallet flinches ble talt opp, og tidsbruk vokter foten (foten er løftet ut av gulvet) ble målt.
Taktil overfølsomhet (allodyni)
. Tilbaketrekking av pote ved terskler fra von Frey filamenter ble bestemt på den måte som er beskrevet av Chaplan et al. [36] for tilbaketrekking av pote terskel ble bestemt i respons til probing med kalibrerte von Frey filamenter. Musene ble holdt i opphengte bur med netting gulv og von Frey filamentet ble påført vinkelrett på plantar overflate av poten av musen til den spente litt, og ble holdt i 3-6 sek. En positiv respons ble indikert ved en skarp tilbaketrekking av pote. Den 50% potetilbaketrekning terskel ble bestemt ved den ikke-parametrisk metode for Dixon [37]. En innledende sonde tilsvarende 2 g ble påført og hvis responsen var negativ, stimulus ble gradvis øket inntil en positiv respons ble oppnådd, og deretter redusert til et negativt resultat ble erholdt. Denne opp-ned-metoden ble gjentatt inntil 3 endringer i oppførsel ble bestemt, og mønsteret av positive og negative responser ble ordnet. Den 50% potetilbaketrekning terskel ble bestemt som (10
[Xf + k *]) /10 000, hvor Xf = verdi for det siste von Frey filament som anvendes, k = Dixon verdi for det positive /negative mønsteret, og * = middelverdien (log) forskjell mellom stimuli. Alle smerte tester ble utført på hvert dyr i følgende rekkefølge, bevegelse-fremkalt smerte, spontan smerte (etter 20 min akklimatiseringsperiode), og taktil overfølsomhet.
Fastsettelse av beinødeleggelse
Røntgen ble tatt før injeksjon av kreftceller (baseline, BL) og 21 dager etter induksjon av ben- cancer ved anvendelse av en Faxitron MX-20 maskin ved 7 uM nominell oppløsning med en X-ray strøm på 300 uA og en spenning på 26 kV (Faxiton X-ray Corp, Wheeling, IL). Digitale røntgenbilder ble tatt følgende atferds testing på 12 dyr per behandling tilstand. Bilder ble tatt til fange av et digitalt kamera og overført til datamaskinen og lagret i digitalt gråtoner format (TIFF). Bentap ble vurdert i henhold til følgende fire punkts skala. 0 = normal, 1 = bentap, ingen brudd, 2 = full tykkelse unicortical bentap indikerer unicortical beinbrudd, 3 = full tykkelse bicortical bentap indikerer bicortical beinbrudd
Statistiske analyser
statistiske sammenligninger mellom behandlingsgruppene ble gjort ved hjelp av ANOVA. Parvise sammenligninger mellom grupper ble gjort med t-test, ble flere sammenligninger mellom grupper gjøres ved hjelp av Newman-Keuls multiple sammenligningstest. For vurdering analyser, lem bruk og bein tap, ble statistiske sammenligninger gjort ved hjelp av ikke-parametrisk analyse med Mann-Whitney test. For alle analysene, ble betydningen satt til p. 0,05
Histologisk analyse av svulst i benet
På dag 21 etter operasjonen, ble musene dypt bedøvet med ketamin og dynket intracardially med 25 ml av 0,1 M PBS, etterfulgt av 25 ml 10% nøytral bufret formalin. Ipsilaterale lårben ble fjernet fra 6 dyr per tilstand og postfiksert over natten i 10% nøytral bufret formalin. Lårben ble skylt i vann for å fjerne formalin før det tas i Overføringsbilde løsning (RDO-Apex, Aurora, IL), for en time for å oppnå avkalking. Prøvene var dehydrert i gradert etanoloppløsning før nøye innstøping i parafin. De ble orientert slik at hele lengden av lårbenet kan i lengdesnitt. §§ 3 um tykk ble farget med hematoksylin og eosin å visualisere normal marg elementer og kreftceller under lyse felt mikroskopi. Prøvene ble observert ved hjelp av et Nikon mikroskop (10 × forstørrelse) og bilder ble samlet inn ved hjelp av en CCD-kamera.
RT-PCR analyse av PC3N-A6-RR celler i benmargs løpet av femur
<
