Abstract
I denne studien har vi testet utbredelsen, histoanatomical distribusjon og svulst biologiske betydningen av Wnt målet protein og kreft stamcelle markør LGR5 i svulster i fordøyelsessystem. Differensiell ekspresjon av LGR5 ble studert på transkripsjonen (real-time PCR) og translasjonelt nivå (immunhistokjemi) i maligne og tilsvarende ikke-maligne vev av 127 pasienter som består av seks forskjellige primære tumor-stedet, for eksempel spiserør, mage, lever, pancreas, colon og rektum. Den klinisk-patologisk betydning LGR5 uttrykk ble undersøkt hos 100 pasienter med magekreft (GC). Ikke-neoplastisk vev vanligvis næret bare svært få spredt LGR5
+ celler. De tilsvarende karsinom i spiserøret, magesekk, lever, bukspyttkjertel, tykktarm og endetarm viste signifikant flere LGR5
+ celler samt betydelig høyere nivåer av LGR5-mRNA sammenlignet med tilsvarende ikke-neoplastisk vev. Doble flekker eksperimenter viste en koekspresjon av LGR5 med de antatte stamcellemarkører CD44, Musashi-1 og ADAM17. Neste vi testet hypotesen om at de sekvensielle endringer av magekreftutvikling, dvs. kronisk atrofisk gastritt, intestinal metaplasi og invasivt karsinom, er forbundet med en omfordeling av LGR5
+ celler. Interessant, den romlige fordelingen av LGR5 endret: i ikke-neoplastiske mageslimhinnene, LGR5
+ celler ble funnet hovedsakelig i den mukøse nakkeregionen; i intestinal metaplasi LGR5
+ celler ble lokalisert ved krypten base, og i GC LGR5
+ celler var tilstede på luminal overflaten, svulsten sentrum og invasjonen fronten. Uttrykket av LGR5 i svulsten sentrum og invasjon foran GC korrelerte signifikant med den lokale tumorvekst (T-kategorien) og nodal spredning (N-kategori). Videre pasienter med LGR5
+ GCer hadde en kortere median overlevelse (28,0 ± 8,6 måneder) enn pasienter med LGR5
– GCer (54,5 ± 6,3 måneder). Våre resultater viser at LGR5 er forskjellig uttrykt i gastrointestinale kreftformer, og at den romlige histoanatomical fordelingen av LGR5
+ celler har å bli vurdert når deres svulst biologiske betydningen er søkt
Citation. Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) Den romlige fordelingen av LGR5
+ Cells korrelerer med Gastric Cancer Progresjon. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10,1371 /journal.pone.0035486
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 5 juli 2011; Godkjent: 16 mars 2012; Publisert: 18 april 2012
Copyright: © 2012 Simon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Gastrointestinale Kreftsvulster er blant de vanligste kreftformer og er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1], [2]. Årsakene til den dårlige prognosene er komplekse: mange kreft i mage-tarmkanalen er diagnostisert i avansert stadium eksklusive kurativ behandling, er det ingen pålitelige tumor markører som kan tillate tidlig diagnose eller screening av høyrisikogrupper. Behandlingsalternativene er begrenset i lokalavansert eller metastatisk sykdom, og et betydelig antall tumorer gjenoppstå til tross for innledende terapeutisk respons [3]. En antatte forklaring av en lite effektiv terapi er tilstedeværelsen av kreft stamceller (CSC). CSC hypotese postulerer at en svulst er et konglomerat av heterogene cellepopulasjoner. Bare en subpopulasjon av dette konglomerat opprettholder evnen til kolonidannelse, og følgelig tilbakefall og metastatisk spredning. Cscs er mer resistente overfor kjemoterapi, som fører til tumor gjentakelse, progresjon og pasient til slutt død [4], [5]. Mens CSC-modellen er i økende grad akseptert, er identifikasjon og bekreftelse av såkalte stamcellemarkører i naturlig humant vev vanskelig og stort sett fraværende. Nylig, leucine-rik, G-proteinkoblet reseptor (GPCR) og Wnt målet genet
LGR5
ble identifisert som en roman stamcelle markør av tynntarm, tykktarm og i hårsekkene til mus [6] . Uttrykk av LGR5 i flere andre organer indikerer at det kan representere en global markør for voksne stamceller. Men lite er kjent om dens uttrykk i lever og mage-tarmkanalen hos mennesker.
I denne studien vi forsøkte å fylle dette gapet av informasjon og testet hypotesen om at kreftstamcelle markør LGR5 har prognostisk og svulst biologisk betydning.
Materialer og metoder
fag
Formalin-fiksert og parafin-embedded ondartede og tilsvarende ikke-ondartet vev fra 127 pasienter med seks anatomiske steder i lever og mage kanalen (dvs. spiserør, magesekk, lever, bukspyttkjertel, tykktarm og endetarm) ble hentet fra arkiver i Institutes of Pathology av Christian-Albrechts-universitetet i Kiel og Charité universitetssykehus Berlin (begge Tyskland). Alle pasientene ble operert i begge universitetssykehus Schleswig-Holstein (1997-2009) eller Charité universitetssykehus Berlin (1995-2008, tabell 1). Ufikserte, friskt frosset vev var tilgjengelig fra 105 av disse pasientene med åtte forskjellige tumortyper, dvs. Barretts adenokarsinomceller (9 pasienter) og karsinomer (7) av spiserøret, tarmen (19) og diffuse (21) type magekreft, adenokarsinom i tykktarmen (19) og endetarmen (20), hepatocellulært karsinom (HCC, 4), og kolangiokarsinom (CC, 6). De pasientkarakteristika er oppsummert i tabell 1.
En uavhengig serie av 487 mage kreftpasienter ble hentet fra arkivet for Institute of Pathology av de kristne-Albrechts-University (tabell 2 og tabell 3) . Disse pasientene hadde gjennomgått enten helt eller delvis gastrektomi for adenokarsinomer i magen eller oesophago-mage-krysset. Hver reseksjon prøven hadde gjennomgått histologisk undersøkelse av kvalifisert kirurgiske patologer. Tidspunktet for pasientens død ble hentet fra
Epidemiologisk Kreftregisteret
av staten Schleswig-Holstein, Tyskland. Oppfølgingsdata for pasienter fortsatt i live ble hentet fra sykehuset poster og ved å kontakte de allmennleger.
Etikk erklæringen
Alle vevsprøver ble oppnådd som en del av en diagnostisk eller terapeutisk kirurgi utført etter at pasienten ga skriftlig informert samtykke. Pasienter som tilbyr prøvene for studien ble pseudonymized og analysert anonymt, så ingen individuelle relaterte data finnes i databasen. Studien ble godkjent av lokale etikkutvalg ved Universitetssykehuset i Kiel, Tyskland (ref. Nummer D 453/10).
Sanntids revers transkriptase polymerase chain reaction
Total RNA var isolert fra dyrkede celler og cryoconserved vev ved hjelp Ambion sin Mirvana miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) etterfulgt av en DNase behandling med Turbo DNA-free kit (Ambion). RNA kvalitet ble vurdert i en 1,5% agarosegel. For cDNA-syntese, 2 mikrogram av total RNA ble revers transkribert ved hjelp av Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Genspesifikke primere ble syntetisert ved Biomers.net (Ulm, Tyskland) (tabell S1). Sanntids revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (Real-time RT-PCR) ble utført ved anvendelse av LightCyler® 480 Probes Master (Roche) og LightCycler® 480 System (Roche). Sammenlignings Ct-verdier ble normalisert til at tre housekeeping gener:
Homo sapiens succinatdehydrogenase komplekse, underenhet A, flavoprotein (Fp) (SDHA), Homo sapiens kalpain 2 (CAPN2) Hotell og
Cyklofilin C ( CYCC)
. Templat-kontroller (ingen cDNA i PCR) ble kjørt for hvert gen å oppdage uspesifikke eller genomisk forsterkning og primer dimerization. Alle forsøkene ble utført i duplikater.
Produksjon og rensing av en anti-LGR5-antistoff
Polyklonalt antisera ble samlet mot den karboksy-terminale hale av den humane LGR5 reseptoren. Kaniner ble immunisert med tre forskjellige peptider av identiteten til SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (kalt Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (kalt 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (kalt 12) ved Pineda-abservice (Berlin, Tyskland). Monospesifikt IgG ble renset ved hjelp av hurtig protein-væskekromatografi med ÄKTAprime ™ -system (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) ved anvendelse av en protein A-kolonne (GE Healthcare). For alle påfølgende analyser, dvs. immunfluorescens, immunocytochemistry, western blot og immunhistokjemi, de mono IgG-fraksjonen var affinitetsrenset mot immuniserer peptider ved Pineda-abservice. I dot blot analyser og immunhistokjemiske undersøkelser, vises de mono IgG anti-LGR5-11b antistoff høy affinitet sammen med sterk og spesifikk farging. Derfor ble dette antistoffet anvendt i denne studien. Reaktiviteten og spesifisiteten av det monospesifikke antistoffet ble karakterisert ved western blot; immunfluorescens og immunocytokjemiske analyser.
Plasmid konstruere
Expression konstruerer for LGR5 ble generert ved å forsterke hele kodende sekvens av humant
LGR5 plakater (NM_003667.2) ved PCR (tabell S1 ). For å lette subkloning av det amplifiserte fragment i ekspresjonsvektoren pcDNA3.1 (-), foroverprimeren inneholdt et Nhel restriksjonssete adapter og den reverse primeren inneholdt et BamHI-sete og et c-myc-tag for å bekrefte vellykket transfeksjon. PCR-fragmenter og pcDNA3.1 (-) ekspresjonsvektoren ble spaltet separat med Nhel og BamHI før ligering med T4-Ligase (Roche). Plasmidet ble verifisert ved fordøyelse med Nhel og BamHI og DNA-sekvensering ved hjelp av ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Klar Reaksjons Kits, versjon 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Tyskland).
Cell kultur og transfeksjon
den menneskelige magekreft cellelinje MKN74 ble hentet fra det japanske helsefaglig forskning Resource (Osaka, Japan), MKN45 Bank og fra den tyske samlingen av mikroorganismer og cellekulturer (Braunschweig, Tyskland). HEK293 EBNA celler ble kjøpt av Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Cellene ble dyrket i RPMI 1640-medium (MKN74, MKN45) eller Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (HEK293) supplert med 10% (MKN74, HEK293) eller 20% (MKN45) føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /mL streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østerrike). DNA transfeksjon av HEK293 EBNA, MKN74 og MKN45 celler ble gjort ved hjelp Lipofectamine LTX reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. I korthet ble cellene dyrket i seks-brønns plater. Stabil transfeksjon av MKN74 og MKN45 med ekspresjonsplasmidene ble utført som tidligere beskrevet [7]. For transient transfeksjon av HEK293-celler 1 pg plasmid-DNA og 5 pl Lipofectamine LTX-reagens ble fortynnet i 500 ul Dulbeccos modifiserte Eagle-medium uten serum, respektivt. Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur ble blandingen tilsatt til HEK293-celler. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble transfekterte celler høstet og RNA eller proteiner ble isolert. Celler transfektert med vektoren pcDNA3.1 (-) alene og utransfekterte celler tjente som negative kontroller
immunfluorescens
Tjuefire timer etter såing på CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia),. cellene ble vasket med fosfatbufret saltløsning, fiksert i 07:03 acetone:methanol (20 min, -20 ° C) og deretter permeabilisert med 0,1% Triton-X (5 minutter, romtemperatur). Slides ble deretter inkubert med c-myc monoklonalt antistoff (Clontech, Mountain View, CA, USA) over natten ved 5 ° C i en fuktig kammer, etterfulgt av en anti-mus Alexa Fluor 555 konjugert sekundært antistoff (Invitrogen). For å detektere en vellykket transfeksjon av LGR5, ble celler inkubert med anti-LGR5-antistoff etterfulgt av et anti-kanin-sekundært antistoff konjugert med Alexa Fluor 488 (Invitrogen) som hver i én time ved romtemperatur. Utelatelse av primære antistoffer på LGR5 transfektert HEK293 EBNA celler tjente som negativ kontroll. Montering og kontra ble gjort med Vectashield Hard-Set inkludert DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).
Immunocytochemistry
immunocytokjemisk farging ble utført på formalinfiksert, parafin- innebygd MKN45 mage kreftceller. For dette formål ble MKN45 cellene innleiret i små agarosekuler slik som beskrevet tidligere [8]. Videre behandling og farging med anti-LGR5-antistoff (fortynning 1:1000) ble utført i henhold til den immunhistokjemiske analyser av humane vevssnitt (se nedenfor). Utelatelse av det primære antistoff på LGR5 transfekterte celler MKN45 tjente som negativ kontroll, mens spesifisiteten av anti-LGR5-antistoff-farging ble bekreftet ved å inkubere antistoffet med det immuniserende peptid som blokkerer.
Western blotting
Protein lysates ble oppnådd ved å inkubere menneskelige mage vev og dyrkede mage celler med ProteoJET ™ Mammalian Cell Lysis Reagent (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) og proteasehemmer cocktail (Complete EDTA-fri, Roche). Proteinprøver ble denaturert i Laemmli-buffer (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% natriumdodecylsulfat, 10% glycerol, 5% β-merkaptoetanol og 0,01% bromfenol blå) ved oppvarming til 95 ° C i ti minutter og ble deretter lastet på 4% til 16,5% SDS-polyakrylamidgeler og synliggjort ved farging med Coomassie-blått. Etter separering, ble proteiner på ufargede polyakrylamidgeler overført til en nitrocellulosemembran (Amersham, Freiburg, Tyskland), immunoblottet med anti-LGR5-antistoff (fortynning 1:20,000) og et anti-β-aktin-antistoff (1:10,000; klone AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for å sikre like lasting beløp. Membran bundet HRP merket sekundære antistoffer (DakoCytomation, Glostrup, Danmark) ble oppdaget av forbedret chemiluminescence hjelp av ECL-system (Amersham). Utelatelse av det primære antistoff tjente som negativ kontroll, mens spesifisiteten av anti-LGR5-antistoff-farging ble bekreftet ved å inkubere antistoffet med det immuniserende peptid som blokkerer.
Histologi
For histologisk analyse, vev prøvene ble fiksert i 10% nøytralisert formalin og innstøpt i parafin. Deparaffinized seksjonene ble farget med hematoxylin og eosin (H E). Magekarsinom ble klassifisert i henhold til WHO klassifisering [9]. Den pTNM stadium ble bestemt i henhold til 7
th utgaven av International Union Against Cancer [10].
Tissue micro array bygging
Formalin-fiksert og prøver parafininnstøpte vev var anvendt for å danne vev mikro matriser som tidligere beskrevet [11]. Fire mikrometer deler av den resulterende tumorvevet mikrofylte blokk ble skåret ut for videre analyse. Vellykket overføring av svulstvev ble bekreftet mikroskopisk bruker H . E-fargede seksjoner
Immunohistochemistry
For immunhistokjemi, ble formalinfiksert og parafin-embedded seksjoner brukt. Farging ble utført med anti-LGR5-antistoff (fortynning 1:1000), et monoklonalt antistoff rettet mot CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) og kommersielle polyklonale antistoffer rettet mot LGR5 (LGR5
com , 1:400; Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (fortynning 1:50; Sigma-Aldrich) og Musashi-en (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA). Etter 20 minutter blokkerende med hydrogenperoksyd blokk (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), 5 minutters behandling med Ultra V Block (Thermo Scientific) og inkubering med det primære antistoff ble gjort i et fuktig kammer ved romtemperatur i 30 minutter. Platene ble vasket mellom trinnene med Tris-bufret saltvann (TBS). Immunreaksjoner ble visualisert med n-Histofine Simple Stain MAX PO System (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan) og DAB substrat (Linaris, Wertheim-Bettingen, Tyskland). For dobbel farging av LGR5 med CD44, ADAM17 og Musashi-en, ble frie bindingsseter blokkert med mus-IgG og kanin-IgG-kontroll (Abcam) fortynnet i antistoffdiluent (ZYTOMED Systems, Berlin, Tyskland) etter DAB-behandling. Prøvene ble kontra med hematoksylin. Utelatelse av det primære antistoff tjente som negative kontroller. Ikke-neoplastisk menneskelige magen (CD44) og hjernevev (LGR5
com, LGR5 og Musashi-1) tjente som positive kontroller.
Evaluering av farging
Farging av ikke-neoplastisk epitel og kreftceller ble scoret ved å bruke en immunoreaktivitets scoring system (IRS). Kort beskrevet i kategori A dokumentert intensiteten av immunofarging som 0 (ingen farging), 1 (svak), 2 (middels) og 3 (sterk). Kategori B dokumentert prosentandelen av immunreaktive celler som 0 (negativ), 1 (spredte positive celler; ≤1%), 2 (2-10% positive celler), 3 (11-50%), 4 (51-80%) og 5 ( 80%). Tilsetningen av kategori A og B resulterte i en IRS varierende fra 0 til 8 for hvert enkelt tilfelle. Fordelingsendringer LGR5
+ celler i 100 hele montere deler av tarm typen magekreft ble scoret som følger: antall immunreaktive celler ble kategorisert som 0 (negativ), 1 ( 10 positive celler), 2 (10 -50 positive celler) og 3 ( 50 positive celler) separat for luminal overflaten, tumorsenter og invasjonen foran
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble gjort ved hjelp av PASW Statistikk 18. statistikkpakke (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Sammenligninger mellom grupper ble testet ved anvendelse av Fishers eksakte test. Korrelasjon av LGR5 uttrykk innenfor en gruppe ble etablert av Kendall tau rang-orden korrelasjon. Overlevelseskurver ble utstyrt med Kaplan-Meier metoden og forskjeller i overlevelse vurdert av log rank test. Betydningen av korrelasjoner av LGR5 ekspresjon i primære tumorer og tilsvarende ikke-ondartet vev ble bestemt ved Wilcoxon test. Real-time RT-PCR data, som ble evaluert med en sammenkoblet tosidig t-test, fikk logarithmized å oppnå tilnærmet normalfordelte data. P-verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
LGR5-mRNA er forskjellig uttrykt i lever og mage karsinom
LGR5 ble angivelig uttrykt i murine stamceller tarm krypter [12] og ble ofte overuttrykt i tykktarm kreft cellelinjer [13]. For å undersøke dens uttrykk i ikke-neoplastiske og neoplastiske menneskelig vev, vurderte vi transkripsjons uttrykk for LGR5 i kliniske prøver som består av et bredt spekter av lever og mage-karsinomer. Real-time RT-PCR-analyse ble utført på en serie av 105 pasienter som omfatter ondartede og tilsvarende ikke-ondartet vev, hentet fra de samme pasientene, fra åtte ulike tumortyper: spiserør [Barrett adenokarsinomer (9 pasienter) og plateepitelkarsinom ( 7)], mage [tarm (19) og diffus type (21) gastrisk karsinom], lever [HCCs (4), CCs (6)], tykktarm (19) og endetarmen (20; tabell 1)
LGR5-mRNA var signifikant forskjellig uttrykt i adenokarsinomer i spiserøret (p = 0,007), mage [tarmtypen (p = 0,006) og diffus type (p = 0,013)], lever [CCs (p = 0,022)], tykktarm (p 0,001) samt endetarmen (p = 0,002) sammenlignet med den samsvarende ikke-neoplastisk vev. Men ingen differensial uttrykk ble funnet i plateepitelkarsinom i spiserøret (p = 0,503) og HCCs sammenlignet med tilsvarende ikke-neoplastiske vev (p = 0,545; figur 1).
boksplott som viser samlede fordelingen av LGR5 sammenligne ondartet versus tilstøtende ikke-ondartet vev i (A) Barretts adenokarsinom og (B) plateepitelkarsinom i spiserøret, (C) intestinal typen magekreft, (D) diffuse typen magekreft, (E) leverkreft, (F) kolangiokarsinom, (G) tykktarm og (H) endetarmskreft.
En polyklonale anti-LGR5-antistoff oppdager menneske LGR5 transfektert i HEK293 og MKN45 celler
For ytterligere å undersøke histoanatomical distribusjon av LGR5 i menneskelig vev og for å undersøke dens klinisk-patologisk betydning, ble en LGR5-spesifikt antistoff hevet, siden de kommersielt tilgjengelige antistoffer ikke oppfyller våre krav (Figur 2A). For å utelukke kryssreaktivitet av den nylig genererte antistoff med de strukturelt ligner LGRs, LGR4 og LGR6, vi utført en sekvens innretting med
National Center for Biotechnology Information
justeringsverktøyet i forveien (data ikke vist). Ingen sekvens homologi ble funnet med LGR4 eller LGR6 i området ved LGR5 peptidet vi benyttet for immunisering. For valg av et meget spesifikt antistoff mot LGR5, ble klonet full lengde cDNA transfektert inn i HEK293 EBNA-celler og anvendt som en positiv mål å utføre immunfluorescens. Den LGR5 cDNA ble direkte merket med et myc-epitop, som muliggjorde evaluering av transfeksjon med et anti-myc-tag antistoff. Ved hjelp av immunfluorescens, binding av anti-myc-tag antistoff ble funnet etter inkubering med LGR5 /HEK293-celler, men ikke i tom vektor-transfekterte celler (vektor /HEK293), utransfekterte HEK293-celler, eller i den negative kontroll av LGR5 /HEK293-celler inkubert med antistoff-fortynningsmiddel i stedet for det primære antistoff. Samme resultat ble oppnådd når vi brukte anti-LGR5-antistoff (figur 3), noe som viser spesifikk merking av LGR5.
Representative bilder av immunhistokjemisk farging for LGR5
com (A) og LGR5 (B) i en mage kreft prøven. Etter separat farging for ADAM17 (C) og LGR5 (D), så vel som dobbelt farging for ADAM17 (rød farge) og LGR5 (brun farge, E) i en serie seksjon av sunn gastrisk mucosa. Sammenligning av sunn mageslimhinnene (F, G) og neoplastisk gastrisk vev (H), MSH-en
+ /LGR5
– (rød farge), MSH-en
– /LGR5
+ (brun farge; F), så vel som mSH-1
+ /LGR5
+ celler (G) er tilstede. Overveiende CD44
+ /LGR5
+ celler i doble fargingsforsøk for CD44 (rød farge) og LGR5 (brun farge) i friske (I) og neoplastiske (J) gastrisk mucosa. Doble positive celler er angitt med piler, pilspisser markere spredte enkelt fargede celler. Originale forstørrelser × 400 (A-J); × 600 (E).
Immunofluorescensanalyse farging av HEK293 EBNA celler med LGR5 spesifikt antistoff (grønn) og anti-myc tag antistoff (rød). Celler ble motfarget med DAPI for å vise cellekjernen (blå). Celler transfektert med myc-merket LGR5 cDNA (første panel) sammenlignet med kontroll-celler, transfektert med tom vektor (kontroll tom vektor); forlater utransfekterte (kontrollere utransfekterte); eller inkubert uten de primære antistoffer, henholdsvis. Originale forstørrelser × 400.
spesifisitet LGR5-immunomerking ble ytterligere validert ved hjelp av formalinfiksert og parafininnstøpte MKN45 magekreftceller. Cellene ble fremstilt og farget på en måte som paralleller til behandling av kliniske humane vevsprøver. Immunocytokjemisk analyse på parafinsnitt viste en positiv farging med anti-LGR5-antistoff på MKN45 celler som er stabilt transfektert med cDNA LGR5 (LGR5 /MKN45). I stedet tom vektor-transfekterte MKN45 celler (vektor /MKN45), så vel som den negative kontroll (utelatelse av det primære antistoff) og peptidet kontroll (pre-inkubering av antistoffet med sin immuniserende blokkerende peptid) av LGR5 /MKN45 celler viste ingen binding av antistoff (Figur S1).
LGR5 protein er spesielt oppdaget av anti-LGR5-antistoff i menneskelig transfektert MKN74 celler
den menneskelige mage kreft cellelinjer MKN74, kjent å besitter en moderat LGR5-mRNA-ekspresjon (data ikke vist) og human ikke-neoplastisk mage, som utviser meget lav LGR5 uttrykket (figur 1) ble valgt for å karakterisere reaktiviteten og spesifisiteten av anti-LGR5-antistoff på proteinnivå.
i western blot-analyse ble LGR5 protein gjenkjent spesifikt av den monospesifikt anti-LGR5-antistoff i en fortynning på 1:20,000. Det identifisert et bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 100 kDa i MKN74 cellelysater (figur 4), som samsvarer med molekylmasse beregnet for LGR5 protein. I motsetning til dette ble ingen bånd påvist i lysater av humane ikke-neoplastisk vev magesekken, noe som utelukker en kryssreaktivitet av anti-LGR5-antistoff med cellulære proteiner. I tråd med mRNA-ekspresjon av data, ble sterkere ekspresjon av LGR5 protein observert i MKN74 celler som er stabilt transfektert med cDNA LGR5, sammenlignet med MKN74 kontrollceller transfektert med den tomme vektoren. LGR5 protein uttrykk i menneskets ikke-neoplastisk mageslimhinnene var utenfor deteksjonsgrensen av western blotting, viser ingen band. Utelatelse av den anti-LGR5-antistoff eller tidligere inkubering av antistoffet med sin immuniserende peptid-blokkerende viser ingen proteinbånd, henholdsvis. Påvisning av β-aktin protein (ca 43 kDa, figur 4) fungerte som en lasting kontroll og bekreftet jevnt lastet protein mengder i alle baner
Coomassieblå farging (Coomassie) viser kvaliteten av lastet totale proteinlysatene.. I western blot analyse av anti-LGR5-antistoff (1:20,000) oppdager en enkelt band i proteinlysatene av stabilt transfekterte MKN74 celler, overekspresjon LGR5 (MKN74 + LGR5), en svakere bånd av celler transfektert med kontroll tom vektor (MKN74 + tom vektor), og ikke bandet i lysatene av human ikke-neoplastisk mageslimhinnene, henholdsvis. På en parallell blot ingen mål- bånd er synlige når anti-LGR5-antistoff ble pre-inkubert med immuniserende blokkerende peptid (peptid blokkering). De beste bandene (100 kDa, pil) viser LGR5 protein, mens de nederste band (~43 kDa, pil) viser β-aktin, brukt som en lasting kontroll.
LGR5 er uttrykt i ikke -neoplastic og neoplastisk vev i hepato-mage-tarmkanalen
uttrykket og histoanatomical fordeling av LGR5 ble deretter undersøkt ved immunhistokjemi i en serie av 127 vev lysbilder som oppnås fra tilsvarende ikke-neoplastiske og neoplastisk vev av den hepato-gastrointestinal tarmkanalen, omfattende spiserør (14 pasienter), mage (32), lever (24), bukspyttkjertel (17), tykktarm (20), og rektum (20; tabell 1). Ut fra denne kohort neoplastisk og tilsvarende vevsprøver på 105 pasienter som ikke-neoplastiske ble også undersøkt på transkripsjonsnivået (se ovenfor).
LGR5 uttrykk for den samlede kullet var positiv i 65 tilfeller (51%) av alle ikke-maligne vev og 103 tilfeller (81%) av alle kreftvevet. Lokalisering av LGR5 uttrykk ble observert som hovedsakelig cytoplasmatic, mens også en sporadisk membran eller kjernemembranen aksentuert uttrykk skjedde. En LGR5-immunoreaktivitet ble funnet i alle vevskomponenter, dvs. stromaceller, endotelceller, celler i den ikke-neoplastisk epitel og kreftceller (figur 5). LGR5-immunoreaktivitet i stromaceller ble observert i 49 (39%) av alle ikke-maligne vev og i 80 tilfeller (63%) av alle kreftvevet. En endotelial immunreaktiviteten av LGR5 ble observert i 42 tilfeller (33%) av alle vev.
LGR5 ekspresjon i normalt colonic slimhinne (A), membranøs (B) og cytoplasmiske (C) farging i tilsvarende tykktarmskreftceller. Piler mark spredt immunreaktive celler i krypten basen. Asterisk (*) markerer det luminale området. Variable LGR5-immunoreaktivitet av endoteliale celler ble funnet i kreftvevet: Tilstedeværelsen av LGR5-immunonegative endotelceller (D) ble bekreftet ved CD34 (E) ved hjelp av seriesnitt. Merk sterk endothelial LGR5-immunoreaktivitets i et annet tilfelle av kreft i tykktarmen (F). (G) Uttrykk for LGR5 i desmoplastic stromaceller. Originale forstørrelser × 200 (A); × 400 (B-G).
I den ikke-ondartet epitel, ble LGR5 vanligvis finner i noen spredte celler nær kjelleren membran av mage mucosal enhet, bukspyttkjertelen kanaler, og kolorektal krypter . LGR5 ble ikke funnet i plateepitel i spiserøret, intrahepatisk galleganger, og hepatocytter (figur 6). For alle typer vev bortsett fra i spiserøret vev middelverdien av IRS var signifikant høyere for tumorvevet i forhold til den samsvarende ikke-ondartet vev, noe som bekrefter våre funn på transkripsjonsnivået (tabell 1).
Ekspresjon av LGR5 i normal spiserørsslimhinnen (A) sammenlignet med et adenokarsinom (B) og en plateepitelkarsinom (C). LGR5 ekspresjon i normal lever (D) sammenlignet med hepatocellulært karsinom (E), normal (F) og ondartet (G) epitelet i gallegangen, så vel som ikke-neoplastisk (H) og neoplastiske (I) pankreatisk vev. Originale forstørrelser × 400.
LGR5 er til stede i spredte celler i normal mageslimhinnen
Eksistensen av multipotente stamceller innenfor murine magen ble demonstrert av klonale merking studier. Den definitive identifisering av disse cellene sviktet så langt på grunn av utilgjengelighet av spesifikke endogene markører [14]. Ved hjelp av seriesnitt hentet fra en ermet reseksjon prøven, som vanligvis oppnås for behandling av overvekt, og viste ingen histologiske tegn på magekreft eller kronisk gastritt, vi søkte etter LGR5
+ epitelceller. Interessant, spredte LGR5
+ celler ble funnet i slimete nakkeregionen mellom foveolae og kjertler (figur 7).
Distribusjonsmønstre LGR5
+ celler i sunn mageslimhinnen (A, E) , en intestinal metaplasi (B, F), og et gastrisk adenokarsinom (C, G) med sin fremre invasiv (D). Det øvre panelet viser representative immunhistokjemisk farging med et anti-LGR5-antistoff på hele monterings deler av tarm typen gastrisk kreft. Nedre felt viser den tilsvarende skjematisk modell av den fordelte endringene i forskjellige stadier av gastrisk tumorgenesen. Piler markere LGR5
+ celler. Asterisk (*) markerer det luminale området. Den svarte linjen markerer svulsten vertsgrensesnittet (invasjon front). Originale forstørrelser × 200.
LGR5 er koekspresjon med andre potensielle mage stamcelle eller stamcellemarkører
Stamceller av ikke-neoplastisk vev og cscs er vanligvis identifisert og validert av uttrykket av mer enn en enkelt stamme cellemarkør [15]. Ved hjelp av immunhistokjemi, vi neste analyserte koekspresjon av LGR5 med andre antatte CSC markører, dvs. ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] – [21]. ADAM17 ble valgt, da tidligere studier identifisert ADAM17 som en antatt stamcelle markør i magen [8]. Farging (enten dobbelt flekker eller flekker av seriesnitt) ble utført på en magekreft prøven og på sunn uninflammed mageslimhinnen oppnås ved sleeve gastrectomy. Generelt er bare noen få spredte celler som viste positiv farging for en og /eller den andre antatte stamcelle markør.
