Abstract
Artonin E er en prenylated flavonoid isolert fra stammen bark av
Artocarpus elasticus
Reinw (. Moraceae). Denne studien hadde som mål å undersøke apoptotiske mekanismene indusert av artonin E i en metastatisk menneskelig eggstokkreft cellelinje Skov-3
in vitro
. MTT-analysen, klonogene assay, akridinorange og propidium jodid dobbeltfarging, cellesyklus og annexin V-analyser ble utført for å utforske modus for artonin E-indusert celledød ved forskjellige tidspunkter. DNA ladde, aktivering av caspases-3, -8 og -9, multi-parametrisk cytotoksisitet-3analysis av high-innhold screening, måling av reaktive oksygen arter generasjon, og Western blot ble ansatt for å studere stier involvert i apoptose. MTT-resultatene viste at artonin E hemmet veksten av SKOV-3-celler, med IC
50 verdier på 6,5 ± 0,5 ug /ml etter 72 timer behandling, og viste mindre giftighet overfor en normal human ovarie celle lineT1074, med IC
50 verdi på 32,5 ± 0,5 ug /ml. Resultatene viste at artonin E indusert apoptose og cellesyklus-stans i S-fasen. Denne forbindelsen også fremmet aktivering av caspases-3, -8 og -9. Videre etterforskning uttømming av mitokondriemembranen potensial og frigjøring av cytokrom
c
avdekket at artonin E behandling indusert apoptose via regulering av uttrykk for pro-overlevelse og pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlemmer. Uttrykket nivåer av survivin og HSP70 proteiner ble også nedregulert i Skov-3 celler behandlet med artonin E. Vi foreslår at artonin E indusert en antiproliferativ effekt som førte til S-fasen cellesyklus og apoptose gjennom feilregulering av mitokondrielle veier, spesielt pro – og anti-apoptose signalveier
Citation: Rahman MA, Ramli F, Karimian H, Dehghan F, Nordin N, Mohd Ali H, et al.. (2016) Artonin E induserer apoptose via mitokondrie feilregulering i Skov-3 eggstokkreft celler. PLoS ONE 11 (3): e0151466. doi: 10,1371 /journal.pone.0151466
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 05.02.2015; Godkjent: 29 februar 2016; Publisert: 28 mars 2016
Copyright: © 2016 Rahman et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er inkludert i papir
Finansiering:. forfatterne ønsker å takke Malaya-universitetet for å gi forsknings tilskudd under UMRG prosjekt (RG077- 12BIO), institutt for forskning Management and Monitoring stipend (PG162-2014B) og departementet for høyere utdanning Malaysia henhold High Impact stipend (UM-Mohe UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /09) for sin økonomiske støtte til å gjennomføre denne forskningen.
Konkurrerende interesser .: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er regnet som den mest dødelige gynekologisk kreft [1]. Globalt er mer enn 230.000 nye tilfeller av eggstokkreft rapportert hvert år, med ca 140 153 dødsfall årlig [2]. Epidemiologiske studier viste at forekomst av kreft i eggstokkene er høyest i de vestlige og utviklingsindustrialiserte land. I 2012 ble nesten 22 280 nye tilfeller av eggstokkreft diagnostisert i USA, med om lag 15 520 forventede dødsfall [3]. I Malaysia, spesielt i Peninsular Malaysia, er eggstokkreft den fjerde vanligste kreftformen blant kvinner, som utgjør 5% av alle kvinnelige krefttilfeller [4].
Nesten 75% av eggstokkreft pasienter til stede med spredning sykdom utover eggstokken på grunn av kreft plassering [5, 6]. Ingen screening tester er for tiden tilgjengelig for tidlig deteksjon av eggstokkreft. Derfor, etter cytoreduktive kirurgi, har kjemoterapi vært den viktigste tilnærmingen for eggstokkreft behandling. De fleste av de nåværende terapeutiske prosedyrer for ovarian kreftpasienter er basert på platina-avledet legemidler i kombinasjon med paclitaxel [7, 8]. Cisplatin og karboplatin er de mest potente platina-avledet kjemoterapi narkotika brukes i behandling av eggstokkreft. Selv om kjemoterapi og cytoreduserende kirurgi er tilgjengelige for å behandle kreft i eggstokkene, disse metodene er betydelig ineffektiv og svært giftig med lav overlevelse. I tillegg til utvikling av medikamentresistens som oppstår over tid gjør behandling av eggstokkreft mer utfordrende. Toksisitet og motstand mot dagens cellegifter har oppfordret forskere til å utforske nye legemiddelkandidater fra naturlige produkter, med fokus på apoptose som fysiologisk prosess som gir en kraftig, ikke-brann tilnærming til å utvise skadet celler fra vev, og dermed sikre vev homeostase [9]. Gitt at kreftcellene har utviklet seg til flere veier for å motstå induksjon av apoptose, utnytter naturlige produkter som kan ha evnen til å undertrykke, drepe, blokk, og reversere tumorigenesis prosessen kan tilveiebringe nye muligheter for kreftlegemiddelutvikling, spesielt for behandling av eggstokkreft [ ,,,0],10].
slekten
Artocarpus plakater (Moraceae) omfatter nesten 55 arter, som er utbredt over hele tropiske og subtropiske områder, blant annet Malaysia, Indonesia, New Guinea, og det sørlige Stillehavet [11 ]. Visse arter av denne slekten gi viktig, deilig mat, for eksempel
Artocarpus chempeden plakater (Chempedak),
A
.
heterophyllus plakater (jackfrukt), og
A
.
altilis plakater (brødfrukt) Mange medlemmer er kjent for å ha medisinsk verdi i behandling av en rekke sykdommer, blant annet malaria, betennelser, sår og diaré [12, 13]. Spesielt
Artocarpus elasticus
Reinw. Ex Blume er en betydelig kilde til smakfull mat, tømmer og tradisjonell folkemedisin for mange sykdommer.
Artonin E er et kjent prenylated flavonoid. Denne forbindelsen er funnet i flere
Artocarpus
planter, for eksempel
A
.
elasticus
,
A
.
nobilis product: [14],
A
.
gomezianus product: [15], og
A
.
communis product: [16]. Tidligere studier på virkningen av artonin E mot utvalgte kreftcellelinjer, inkludert MCF-7 (bryst adenokarsinom), HCT-8 (ileocøkal), MDA-MB-231 (bryst adenokarsinom), KB (human oral epidermoid carcinoma), Vero celle linje, og P388 (leukemi) cellelinjer, viste interessante resultater antiproliferative [11, 17, 18]. Denne forbindelse oppviste også sterke radikal fjernende egenskaper mot DPPH radikal [19] og viste seg å være en potent arachidonat 5-lipoksygenase-inhibitor med en IC
50 verdi av 0.36μM [20]. I tillegg artonin E forbedrer anoikis (løsgjøring-indusert apoptose) av H460-celler (lunge cancer) på en doseavhengig måte [21]. Denne forbindelsen også lysfølsomt cellene ved downregulating anti-apoptotiske myeoloid leukemi celle-sekvens-1 (MCL1) protein [21]. Flere nylig, artonin E utstilt lovende anti-migrasjon og anti-invasjons eiendommer i humane lungekreftceller H460 [15]. Så langt vi kjenner til, har mekanismen av artonin E som en kreft og apoptose-induserende agent i menneske eggstokkreft celler ikke er klarlagt. Dermed blir denne studien forsøkte å undersøke apoptose-induserende egenskaper artonin E i menneske eggstokkreft celler og de mulige mekanismene som er involvert.
Materialer og Metoder
Plantemateriale
stammen bjeffer av
A
.
elasticus
ble samlet inn fra Ulu Langat, Selangor, Malaysia i 2010. Samlingen av plantematerialet ikke krever tillatelse fra en hvilken som helst kommune fordi anlegget er ikke en truet art. Prøvene ble identifisert ved Dr. Rusea Go fra Institutt for biologi, Fakultet for naturvitenskap, Universitetet Putra Malaysia. En kupong prøven (S94408) ble deponert ved instituttet herbarium [22].
Plante utvinning
Den tørkede bark av
A
.
elasticus plakater (1,5 kg) ble pulverisert og deretter ekstrahert ved romtemperatur ved anvendelse av heksan, EtOAc, og metanol som løsningsmidler. Den høye oppløsningsmidlene ble konsentrert ved anvendelse av en rotasjonsfordamper for å gi 1,55 g, 40,22 g og 30,52 g mørk brunt halvfast stoff ekstrakt, respektivt. EtOAc-råekstrakt (38,22 g) ble belagt med silikagel og underkastet fraksjonering ved hjelp av vakuum-væskekromatografi. Kolonnen ble eluert med blandinger av heksan, heksan /CHCI
3, CHCI
3 /EtOAc, EtOAc /MeOH, og MeOH for å gi 60 fraksjoner på 200 ml hver. Lignende fraksjoner ble kombinert basert på TLC profilen. Krystallisering av fraksjonene 26-36 ga 2,3 g (0,06%) av et gult pulver. Forbindelsen ble deretter rekrystallisert i heksan og aceton, hvorved man artonin E med smeltepunkt (smp) på 232-233 ° C, [23] og m.p.of 231-232 ° C, respektivt. Metanol ekstrakt ble fraksjonert ved hjelp av vakuum kolonne chromatoghraphy (ligner støvsuge kolonnekromatografi) for å produsere en annen gruppe av artonin E produkt (0,6 g, en gul solid).
Isolering av artonin E
Artonin E ble isolert som et gult pulver (3 g), Sm.p. 232-233 ° C, [23], smp 231-232 ° C, fra metanol og etylacetat-ekstrakter av bark
A
.
elasticus
. Isolatene ble utsatt for identifikasjon og videre analyse, og ga følgende resultater: IR
v
maks cm
-1 i 3417 (OH), 2979 (mettet CH), 1644 (C = O), 1462, og 1354; UV λ
max nm, (log ε) av 351 (0,35), 268 (1,29), 209 (1,01);
1 H-NMR (400 MHz, aceton
-d
6
) av δ 13.19 (
s
, 1 H, OH-5), 6,82 (
s
, 1H, H-6 «), 6,57 (
d
,
J
= 11 Hz, 1H, H-14), 6,54 (
s
, 1H, H-3 «), 5,62 (
d
,
J
= 10,1 Hz, 1H, H-15), 5,08 (
t
,
J
= 6,3 Hz, 2 H, H-10), 3,1 (
d
,
J
= 7.36Hz, 2H, H-9), 1,52 (
s
, 3H, H-13), 1,41 (
s
, 3H, H-12), 1,39 (
s
, 3H, H-17), og 1.39 (
s
, 3 H, H-18); APT-NMR (100 MHz, aceton
-d
6
) av δ 182,4 (C = O), 161,8 (C-2), 161,4 (C-7), 159,1 (C-5), 152,4 (C-8a), 148,9 (C-2 «), 148,6 (C-4»), 138,2 (C-5 «), 131,5 (C-11), 127,2 (C-15 ), 121,6 (C-10), 120,8 (C-3), 116,2 (C-6), 114,6 (C-14), 110,5 (C-1 «), 104,7 (C-4a), 103,8 (C- 3 «), 100,7 (C-6), 98,8 (C-8), 77,9 (C-16), 29,1 (C-18), 29,1 (C-17), 27,4 (C-13), 23,7 (C- 9), og 16,8 (C-12); EIMS
m /z plakater (% intensitet) av 436 (M
+, 45), 421 (100), 393 (24), 203 (66), 182 (22), og 69 (15 ). Basert på ovennevnte fysiske og spektrale data ble forbindelsen identifisert som en kjent flavone heter artonin E (fig 1) [23].
Cell kultur
Metastatisk eggstokkene adenokarsinom (SKOV- 3) og normale kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinjer ble opprinnelig erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). SKOV-3-celler ble dyrket i McCoys 5A medium og CHO-celler ble dyrket i F12K-medium. Et menneske periodontal ligament fibroblast-cellelinjen ble anskaffet fra Lonza, USA og opprettholdt i stroma celle basal medium [24]. T1074 (normal immortalisert menneskelig eggstokkreft overflaten epithelial cellelinje) ble opprinnelig kjøpt fra Applied biologisk materiale (abm
®) Canada og dyrket i Prigrow en medium [25, 26].
Celleviabilitet analysen
De inhiberende virkninger av artonin E og to positive kontroller paclitaxel og karboplatin ble undersøkt ved MTT-analyse. -Celler ved en tetthet på 5 x 10
3cells /brønn ble anbrakt i en 96-brønns plate og satt hen i 24 timer for å feste. De vedlagte Cellene ble utsatt for artonin E, paclitaxel og karboplatin ved forskjellige konsentrasjoner og inkubert i 24, 48 og 72 timer. Deretter ble 20 ul av 5 mg /ml MTT-oppløsning ble tilsatt etter behandling, og den resulterende blanding ble inkubert i 4 timer for å danne lilla formazan. Etterpå ble 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) overført til hver brønn for å oppløse formazanet lilla, og resultatene ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Tecan Infinite M 200 PRO, Männedorf, Sveits) ved en absorbans på 570 nm. Halv-maksimal konsentrasjon som forårsaket cellevekst hemming (IC
50 verdier) ble innhentet fra MTT levedyktighet vekstkurve.
Morfologisk studie ved hjelp av en normal invertert mikroskop
Skov-3 cellene ble plassert i en 6-brønns plate og satt hen i 24 timer for å feste. IC
50 av artonin E ved 48 timer etter behandlingen (8 ug /ml) basert på resultatene av MTT-cellelevedyktighet-analysen ble brukt til å behandle cellene gjennom eksperimenter, med unntak av klonogene analysen. De festede celler ble behandlet med artonin E i 24, 48 og 72 timer og observert under et vanlig invertert mikroskop ved 200 x forstørrelse. De cellulære morfologiske forandringer ble vurdert og sammenlignet med de ubehandlede levedyktige celler.
klonogene assay
SKOV-3-celler ble trypsinert, sentrifugert, og supplert med friskt medium. Cellene ble umiddelbart telles og sådd (300 celler /plate) i en 60 mm petriskål, og igjen over natten for å feste. De festede celler ble behandlet med 0, 1, 5, 10, 15, og 20 ug /ml av artonin E i 24 timer. Etter inkubering ble de behandlede mediet fjernet og friskt medium ble tilsatt. Cellene ble inkubert i tre uker for å danne kolonier. Overlevende kolonier ble fiksert med 90% etanol og farget med krystallfiolett.
Morfologisk vurdering av apoptotiske celler ved acridinoransje og propidiumjodid- dobbel flekker
Effekten av artonin E i celledød i SKOV -3 celler ble bestemt ved bruk acridinoransje (AO) og propidiumjodid (PI) dobbel farging. Skov-3 celler ble sådd på 5 × 10
5cells i en T75cm
2 kolbe og inkubert over natten for å tillate vedlegg. Cellene ble deretter eksponert for 8 ug /ml av artonin E for 24, 48 og 72 timer. Etter inkubering ble de behandlede cellene ble vasket med PBS, og deretter trypsinert og sentrifugert ved 1500 rpm i 5 min. Cellene ble deretter resuspendert i kald PBS og sentrifugert to ganger for å oppnå friske, rene pellets. De friske pellets ble blandet med et likt volum av fluorescerende fargestoff fargeløsning (1: 1), omfattende 10 ug /ml AO og 10 ug /ml PI (oppløst i PBS). Den ferske farget cellesuspensjon ble droppet på et objektglass og observert under en UV-fluorescens mikroskop (Leica festet med Q-Flora programvare) innen 30 min, før falming av fluorescens. De morfologiske kriteriene for klassifisering av sunne, apoptotiske og nekrotiske celler er som følger: (i) levedyktige celler viser en grønn kjerne med runde intakt struktur; (Ii) tidlig apoptose viser en tett lys-grønn kjerne med kromatin kondens; (Iii) sent apoptose viser en tett oransje område på grunn av kondensering av kromatin; og (iv) sekundær nekrose viser en oransje /rød intakt kjerne [27].
Annexin V analysen
En Annexin V Analysen ble utført ved hjelp av en BD Pharmingen
TM Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (ApoAlert Annexin V, Clontech, California, USA). Cellene ble plassert i en 6-brønns plate og fikk stå over natten for å feste. Cellene ble deretter behandlet med 8 ug /ml av artonin E for 24, 48 og 72 timer. De behandlede celler ble trypsinert og sentrifugert ved 1500 rpm i 10 min for å fjerne gjenværende medier. Deretter ble 1 x bindingsbuffer tilsatt for å skylle de ferske pellets før deres resuspensjon i 200 ul bindingsbuffer. Cellene ble deretter blandet med 5 ul av Annexin V og 10 ul av PI og inkubert i 15 minutter i mørket ved romtemperatur. De fremstilte celler ble umiddelbart analysert ved hjelp av flowcytometrisk analyse (FACS Canto 11 Becton-Dickson). Deretter ble 300 ul av bindingsbuffer tilsatt til hver prøve for å justere reaksjonsvolumet til minst 500 mL for flowcytometrisk analyse. Cellene ble behandlet med DMSO (0,1%, v /v) ble anvendt som kontroll.
cellesyklusanalyse
SKOV-3-celler ved en konsentrasjon på 5 x 10
5-celler ble belagt i en T75cm
2 kolbe og inkubert over natten for å tillate vedlegg. De festede celler ble behandlet med 8 ug /ml av artonin E ved forskjellige tidspunkter. Etter behandling ble cellene trypsinert og sentrifugert ved 1500 rpm i 10 min. De friske Pelletene ble vasket to ganger med PBS, fiksert med 500 pl av 70% kald etanol, og inkubert ved -20 ° C over natten. Den gjenværende etanol ble deretter fjernet og cellene ble resuspendert i PBS som inneholdt 20 ul av RNase A (10 ug /ml) og 2 ul av PI (2,5 ug /ml). Den resulterende blanding ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. Prøvene ble umiddelbart analysert ved hjelp av FACS Canto 11 Becton-Dickinson flowcytometri. For hver prøve ble 10.000 celler målt. ModFit LT programvare (Verity Software House, Topsham, ME) ble brukt til å analysere hvor stor prosentandel av celler i ulike faser.
Påvisning av reaktive oksygen arter generasjon
2 «, 7»-Dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) ble anvendt for å undersøke fremstillingen av intracellulære reaktive oksygenforbindelser i SKOV-3-celler behandlet med artonin E. SKOV-3-celler ble sådd i 96-brønns sort plate og inkubert over natten for å feste. Cellene ble deretter behandlet med 8 ug /ml av artonin E for 24, 48 og 72 timer. Hanks balanserte saltoppløsning uten serum ble anvendt for å vaske cellene. Deretter ble 100 ul av DCFH-DA-løsning tilsatt til hver betegnet brønn, og platen ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Resultatene ble analysert ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser (Tecan Infinite M 200 PRO, Männedorf, Sveits) ved 485 nm eksitasjon og 520 nm emisjon.
Multiparametric Cytotoksisitet tre high-innhold screening
Cellomics Multiparameter cytotoksisitet 3 kit (Thermo Scientific
TM, Pittsburgh, PA, USA) ble anvendt for å utføre simultan deteksjon av de avgjørende apoptotiske hendelsene i SKOV-3-celler behandlet med artonin E. Kort, SKOV-3-celler ble sådd ut ved en densitet på 5000 celler /brønn i en svart flatbunnede 96-brønners plater (PerkinElmer, Inc., Wellsley, MA, USA) og venstre over natten for å feste. De festede celler ble behandlet med 8 ug /ml artonin E for 24, 48 og 72 timer. De behandlede cellene ble deretter utsatt for 50 ul av levende celle fargeløsning i 30 minutter. Det overskytende medium og levende celle fargeløsning ble forsiktig fjernet, og cellene ble deretter fiksert med 16% paraformaldehyd. Etter fiksering ble cellene eksponert med permeabiliseringsbuffer fulgt av blokkeringsbuffer i 15 minutter ved romtemperatur. Primær Cytokrom
C
antistoffer og sekundære DyLight 649-konjugert geite-antimuse-IgG ble tilsatt og tillatt å reagere i 1 time hver. Hoechst 33342 fargestoff ble anvendt for å farge kjerner i SKOV-3-celler. Farget SKOV-3-celler i 96-brønners plater ble analysert ved hjelp av ArrayScan høyt innhold screening (HCS) system. Alle forsøkene ble utført i tre paralleller og eksperimenter ble gjentatt to ganger.
Cytokrom c frigjøre apoptose analysen
Cytokrom c frigjøre apoptose analysesett (ab65311) ble kjøpt fra Abcam
® (Cambridge, UK ). Analysen ble utført i henhold til produsentens anvisninger. Kort sagt ble SKOV-3-celler indusert med artonin E ved forskjellige tidspunkter. De induserte og un-induserte celler ble samlet og sentrifugert ved 6,00 x
g
i 5 minutter ved 4 ° C. Cellene ble vasket to ganger med 10 ml iskald PBS, sentrifugert og oppsamlet pelleten. De friske Pelletene ble deretter resuspendert med 1,0 ml 1X cytosol ekstraksjonsbuffer blanding inneholdende DTT og proteasehemmer og inkubert på is i 10 minutter. Cellene ble deretter Dounce-homogenisert før sentrifugering ved 7000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble samlet opp og lagret som cytosoliske fraksjoner. De gjenværende pelletene ble resuspendert i 0,1 ml mitokondriell ekstraksjonsbuffer, vortex-blandet i 10 sekunder og lagret som mitokondrielle fraksjoner. Begge cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner ble søkt om protein analyse og fortsatte med standard Western blot prosedyre.
Aktivering av caspases-3, -8 og -9 analysen
Kalorimetrisk analyse av aktivering av caspases -3, -8 og -9 ble utført ved bruk av R D system kit, USA. I korthet, i en T75cm
2 kolbe 90% konfluente SKOV-3-celler ble indusert med artonin E for 24, 48 og 72 timer. De induserte celler ble trypsinert og sentrifugert ved 1800 rpm i 10 min. De friske Pelletene ble vasket med kald PBS og umiddelbart lysert med protein lyseringsbuffer. Cellelysatet ble så holdt på is i 10 minutter, sentrifugert ved 10 000 g i 15 minutter og overført til et nytt rør. Den friske cellelysat (50 ul), som inneholdt 100 til 200 ug av protein, ble tilsatt til en 96-brønns plate i tre eksemplarer. Femti mikroliter av reaksjonsbuffer og 5 ul av caspase ble deretter overført til hvert utpekt vel før inkubering av platen i en CO
2 inkubator ved 37 ° C i 2 timer. En mikroplateleser (Tecan Infinite M 200 PRO, Männedorf, Sveits) ble anvendt for analyse ved en bølgelengde på 405 nm.
DNA fragmenteringsanalyse
SKOV-3-celler ble behandlet med artonin E i forskjellige tidspunkter, og høstet ved å legge trypsin for å fremme avløsning. De frigjorte cellene ble spunnet ned og vasket to ganger med kald PBS. DNA fra celler i suspensjonen ble ekstrahert ved hjelp av selvmords Spor
TM DNA stige isolasjonskit (Calbiochem, EMD Bioscience, Tyskland). Cellene ble deretter lysert ved å blande 55 pl TE (Tris og EDTA) lysebuffer, og 20 pl av enzym A (RNase A). Den resulterende blanding ble inkubert ved 37 ° C i 1 time. Deretter ble 25 ul av enzym B (proteinase K) tilsatt, og lysatet ble holdt i et vannbad ved 50 ° C over natten. Etter inkubering ble 2 ul av Pellet Paint, 60 ul 3 M natriumacetat, og 662 ul 2-propanol tilsatt til lysatet, og løsningen ble kort blandet ved inversjon og inkubert ved romtemperatur i 2 min. DNA ble deretter felt ut ved sentrifugering av prøvene ved 16000 x
g
i 5 min. Supernatanten ble fjernet, og den ferske pellets ble skyllet to ganger med 70% og 100% iskald etanol. Pelletene ble lufttørket ved romtemperatur i noen få minutter for å forkaste etanol og resuspendert med 50 ul av DNA resuspensjon buffer. De fremstilte DNA ladder prøver ble lastet på en 1,5% gel elektroforese sette opp og kjøre 50 konstant volt i 3 timer. Når elektroforese var fullført, ble gelen umiddelbart farget med SybrGreen ™ og båndet som ble oppnådd ble visualisert ved hjelp av UV-Gel dokumentasjonssystem (Biospectrum 410, UVP).
Western blot
Skov-3 celler ble sådd ut i en 75 cm
to kulturflaske og utsatt for artonin E for 24, 48 og 72 timer. Lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 120 mM NaCl, 0,5% NP-40; og 1 mM PMSF) ble anvendt for å ekstrahere det totale protein. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av en BCA-proteinanalyse-reagens-sett (Bio-Rad, USA). Like mengder av protein (40 ug) ekstrakt ble underkastet SDS-PAGE og elektroblottet på en polyvinylidenedifluoride membran (Bio-Rad). Blottene ble deretter blokkert med 5% ikke-fettmelk i TBS-Tween-buffer 7 (0,12 M Tris-base, 1,5 M NaCl, og 0,1% Tween 20) i 1 time ved romtemperatur. Etter inkubering med det passende primære antistoff over natten ved 4 ° C, ble blottene vasket og deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Proteinbåndene ble påvist ved anvendelse av pico eller femto kjemiluminescens (ECL-system) og visualisert ved anvendelse av en UV-gel dokumentasjonssystem. De etterfølgende primære antistoffer, som inkluderer de for β-aktin (1: 10.000), Bax (1: 10.000), Bcl-2 (1: 10.000), HSP-70 (1: 10.000), Survivin (1: 10.000), caspase -3 (1: 10.000), caspase -8 (1: 10.000), caspase -9 (1; 10 000) og cytokrom c (1: 200). ble kjøpt fra Abcam, Cambridge, Storbritannia
statistisk analyse
Gjennomsnittlig datafrom minst tre målinger for hver testede prøve ble normalisert til de ubehandlede resultater. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS-16,0 pakke og GraphPad prisme 5.0. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD og
p .. 0
05
ble betraktet som signifikant
Resultater
Artonin E selektivt hemmer veksten av kreft celler og normale celler
in vitro
antiproliferative virkninger av artonin E på forskjellige cellelinjer ble evaluert ved anvendelse av MTT-analysen, som vist i tabell 1. Dette forsøk ble etablert basert på evnen den NADP (H) -avhengig cellulær oksidoreduktase-enzym for å redusere den gule tetrazolium fargestoff til sin uoppløselig lilla formazan som gjengir andelen av levedyktige celler er tilstede. Blant de cellelinjer som ble testet, ble de laveste IC
50-verdier observert for SKOV-3-celler etter 24 timers behandling. IC
50 verdier på SKOV-3-celler behandlet med artonin E merkbart redusert etter 48 og 72 timers behandling, henholdsvis, slik som vist i tabell 2. I motsetning til normale humane ovarie-celler (T1074), normale humane periodontal ligament fibroblastceller , og normale CHO celler behandlet med artonin E var mindre giftig. IC
50 verdier på SKOV-3-celler behandlet med artonin E var noe lavere enn det som ble behandlet med karboplatin, som er et velkjent kjemoterapeutisk middel (tabell 2). Paclitaxel og karboplatin ble anvendt som positiv kontroll. Begge disse stoffene redusert celleviabilitet i Skov-3 celler i en tidsavhengig måte (tabell 2).
Artonin E reduserer celleoverlevelse
De morfologiske endringer i SKOV-3-celler behandlet med artonin E ble observert under normale invertert mikroskop (figur 2). De dissosierte morfologiske struktur av de behandlede cellene var synlig etter 24 timers eksponering for artonin E. cellemembranen blebs ble observert med en skarp reduksjon i celletall, noe som indikerer at veksthemming hadde funnet sted. Dannelsen av apoptotiske legemer ble observert etter en lengre eksponeringstid. I motsetning til vanlige Skov-3 celler forble sunt med en intakt struktur.
(A) Ubehandlede celler. (B) celler etter 24 timers behandling. (C) celler etter 48 timers behandling. (D) celler etter 72 timers behandling. IC: Intakt cellestruktur; DC: distansere cellestruktur; MB: membran blebbing; og AB. apoptotisk kroppen
Artonin E hemmer kolonidannelse i Skov-3 celler
klonogene Analysen ble utført for å undersøke den langsiktige effekten av Skov-3 celler behandlet med artonin E . resultatene i figur 3 viser at artonin E hemmer kolonidannelse i en doseavhengig måte. Ved 5 ug /ml av artonin E, var nesten halvparten av koloniene redusert, reduseres kraftig ved en konsentrasjon på 10 mikrogram /ml. Det er ingen kolonier ble dannet etter at cellene hadde blitt behandlet med 15 og 20 ug /ml av artonin E, således som tyder på at denne forbindelse har en anti-proliferative effekter i SKOV-3-celler.
Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av artonin E i 24 timer og deretter inkubert i tre uker for å danne kolonier. Koloniene dannet ble fiksert med etanol og farget med krystallfiolett.
Kvantifisering av apoptose ved hjelp av AO-PI dobbel farging
AO-PI analyse ble brukt for å undersøke endringer i atom morfologi i SKOV-3-behandlede celler. De apoptotiske celler ble evaluert basert på kjernekraft kondens og fragmentering. I denne studien ble 200 celler fra hvert forsøk scorte og kvantifisert tilfeldig. Resultatene viser (figur 4) som artonin E utløste morfologiske endringer som er knyttet til apoptose så tidlig som 24 timer etter behandling. ble observert Kjennetegnet av tidlig apoptose med AO Pilgrim innenfor fragmentert DNA. På dette tidspunktet, ble membran blebbing og margination av kjernen tydelig. I ytterligere 48 timer med eksponering viste at de behandlede celler hadde gjennomgått sent apoptose med den observerte blebbing og rød /orange farge. Sekundær nekrose med karakteristisk lys rød farge ble observert 72 timer etter behandlingen på grunn av PI binding til DNA av de døde cellene. I motsetning til de ubehandlede celler utviste en grønn intakt atomstruktur. En statistisk signifikant
(p . 0
05)
forskjell i induksjon av apoptose i de behandlede celler (figur 5) ble observert. I tillegg ble det observert en samtidig økning i celledød (sekundær nekrose)
(p . 0
05)
etter langvarig eksponering tid, det vil si 72 timer etter behandlingen (fig 5) . Disse resultatene viste tidsavhengige typiske genererte morfologiske egenskaper assosiert med apoptose ved artonin E behandling i SKOV-3-celler.
De behandlede celler ble eksponert for 8 ug /ml av artonin E for 24, 48 og 72 h . (A) Ubehandlede celler. (B) celler etter 24 timers behandling. (C) celler etter 48 timers behandling. (D) celler etter 72 timers behandling. VI: levedyktige celler; BL: blebbing av cellemembranene; LA: lateapoptosis; . Og SN: sekundær nekrose
(EA: tidlig apoptose, LA: sent apoptose, og SN: sekundær nekrose). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre replikater. * Indikerer signifikant forskjell fra kontroll av hver fase (
p
0,05).
Artonin E induserer apoptose i Skov-3 celler
apoptose har to forskjellige morfologiske og biokjemiske karakteristikk. Endringer i morfologiske apoptotiske celler slik som tap av plasmamembranen asymmetri og vedlegg, plasmamembran blebbing, kondensasjon av cytoplasma og cellekjernen, er alltid ledsaget av flere biokjemiske endringer [28]. Våre resultater så langt vist de typiske morfologiske trekk ved apoptose i artonin E behandlet Skov-3 celler. Dobbeltfarging Annexin V /PI flowcytometri ble anvendt for å undersøke de biokjemiske forandringer i artonin behandlet SKOV-3-celler. En av tidligere biokjemiske forandringer i apoptose hendelser er en annen kinetikken for fosfatidylserin (PS) eksponering på den ytre paknings av plasmamembranen. Annexin V, en Ca
2 + -avhengig fosfolipid-bindende protein er kjent for å interagere spesifikt og sterkt med PS og kan anvendes for å påvise apoptose ved å målrette tap av plasmamembranen asymmetri [29]. Den AV- /PI- farging indikerer levedyktige celler på grunn av PI gjør ikke gjennomtrengelig inn i intakt cellemembran, mens AV + /PI- farging representerer begynnelsen av apoptotiske celler, på grunn av tap av plasmamembranen asymmetri og sterk affinitet av AV-FITC PS. I stedet AV + /+ PI representerer slutten av apoptotiske og AV- /PI + representerer nekrotisk trinn som er på grunn av reduksjon av plasmamembranen og nukleær membranintegritet som tillater PI til å passere gjennom membranene og inn i intercalate nukleinsyre. Som illustrert i figur 6, mer enn 40% av cellene i de tidlige og sene stadier av apoptose etter 24 og 48 timer etter behandling, henholdsvis, noe som indikerer tidsavhengig signifikant
(p . 0
05 )
økning sammenlignet med ubehandlede celler. I tillegg er behandling med artonin E viste også tidsavhengig reduksjon i levedyktige celler med samtidig økning i nekrotiske celler. Derfor er dagens resultater tyder på at antiproliferation og apoptose i SKOV-3-behandlede celler er nært beslektet.
[A] Kontroll (ubehandlet), [B] 24 timers behandling, [C] 48 h behandling, og [D ] 72 h behandling. [E] Histogram. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre replikater.
