Abstract
Eggstokk og bukspyttkjertel kreft er to av de mest aggressive og dødelige kreftformer, som ledelse ansikter bare begrenset terapeutiske muligheter. Vanligvis spre disse svulstene snikende ledsaget først med atypiske symptomer, og vanligvis skifte til en legemiddelresistens fenotype med dagens farmasøytiske armamentarium. Således representerer utvikling av nye legemidler som virker via en annen virkningsmekanisme en klar prioritet. Heri, rapporterer vi for første gang at aminosteroid derivat RM-133, som er utviklet i vårt laboratorium, viser lovende aktivitet på to modeller av aggressive kreftformer, nemlig eggstokkene (ovčar-3) og bukspyttkjertel (Panc-1) kreft. IC
50 verdien av RM-133 var 0,8 uM og 0,3 uM til OVCAR-3 og PANC-1-cellelinjer i kultur, respektivt. Basert på farmakokinetiske studier på RM-133 ved hjelp av 11 forskjellige biler, valgte vi to hoved biler: vandig 0,4% metylcellulose: etanol (92: 8) og solsikkeolje: etanol (92: 8) for
in vivo
studier . Ved hjelp av subkutan injeksjon av RM-133 med methylcellulose basert kjøretøy, vekst av PANC-1 tumorer xenopodet til nakne mus ble inhibert med 63%. Ganske interessant, RM-133 injisert subkutant med en metylcellulose-baserte eller solsikkebaserte kjøretøyer redusert OVCAR-3 xenograft vekst ved 122% og 100%, henholdsvis. Etter slutten av RM-133 behandling ved hjelp av methylcellulose basert kjøretøy, ble OVCAR-3-tumorvekst-inhibering ble opprettholdt i ≥ en uke. RM-133 ble også godt tolerert i hele dyret, etter å ha noen åpenbar tegn på toksisitet blitt påvist i xenograft studier
Citation. Kenmogne LC, Ayan D, Roy J, Maltais R, Poirier D (2015) de aminosteroid Derivative RM-133 Shows
in vitro Hotell og
in Vivo
antitumoraktivitet i human Ovarian og bukspyttkjertel kreft. PLoS ONE 10 (12): e0144890. doi: 10,1371 /journal.pone.0144890
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 25 september 2015; Godkjent: 24 november 2015; Publisert: 14.12.2015
Copyright: © 2015 Kenmogne et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institutes of Health Research (CIHR, POP-i), Quebec Breast Cancer Foundation (QBCF), Société de valorisation de la recherche ved Québec City (SOVAR), Det medisinske fakultet fra Université Laval, og Centre de Recherche en Endocrinologie Moléculaire et Oncologique et Génomique Humaine (CREMOGH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfattere JR, RM, og DP av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: 2 – (N-substituerte l) steroidderivater: patent 13/130 621 (US); Patentsøknader 2744369 (Canada) og 09.828.506,7 (Europa). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Som en stor folkehelseproblem over hele verden, er ansvarlig for en av fire dødsfall i USA kreft og Canada [1,2]. Eggstokkreft og bukspyttkjertel kreft er to aggressive kreftformer som deler egenskapene til å spre snikende mens du viser atypiske symptomer, og lett å skifte til et legemiddelresistens fenotype. Eggstokkreft er en heterogen sykdom som rammer årlige 225.000 kvinner verden [3-5]. Det er den mest dødelige blant de gynekologiske kreftformer, på grunn av sin natur asymptomatisk i sin tidlige etiologi, og mangel på effektive diagnostiske verktøy [2,5]. Som et resultat, 75% av kvinnene allerede presentere seg med avanserte stadier av kreft i eggstokkene (iscenesetter III- IV av International Federation of gynekologi og fødselshjelp klassifisering) når først diagnostisert [3,6-9]. For disse kvinnene, varierer fem-års overlevelse fra 25% til 35% [3,10] og gullstandard behandling er kirurgisk debulking og kjemoterapi basert på en kombinasjon av paclitaxel- og platinabaserte regimer [6,11-13 ]. Selv om første reaksjon til eggstokkreft behandling er gunstig, de fleste av pasientene blir resistente mot tiden brukes behandlinger og mer enn 90% er gjenstand for tilbakefall etter 18 måneder [14,15]. På den annen side, kreft i bukspyttkjertelen, som er den fjerde mest dødelige kreft, er en aggressiv neoplasme presentere med en svært dårlig prognose [1,2,16]. Sin 5-års overlevelse er på kun 6% [1] på grunn av sen første diagnose, rask progresjon av sykdommen, og motstand mot kjemoterapiregimer i dagens bruk [17]. Som pankreastumorer er preget av omfattende lokal invasjon og tidlig lymfatiske samt hematogene metastaser [18], bare noen få pasienter er kandidater til reseksjon, og derfor systemisk gemcitabin-basert kjemoterapi er den mest tiden brukte formen for behandling [19]. Til tross for nylige forbedringer i narkotika utvikling, har lengden og livskvalitet for kreft i bukspyttkjertelen pasienter ikke bedret [20]. Det er derfor et stort behov for å utvikle nye metoder for behandling av disse sykdommene, som er blant de aggressive og dødelige kreft og har begrenset terapeutiske muligheter, særlig for pasienter med inoperabel kreft i bukspyttkjertelen, hvis allmenntilstanden forverres raskt [16,20, 21].
de ovenstående betraktninger viser at utvikling av nye terapeutiske midler som virker gjennom forskjellige virkningsmekanismer er kritisk nødvendig for å overvinne de store problemet med legemiddelresistens man støter på med disse to krefttyper, og derfor, for å forbedre total overlevelse av pasienter. Forbindelsen RM-133 (figur 1) er et aminosteroid som har blitt utviklet i vårt laboratorium [22]. Det har vist antiproliferativ aktivitet på flere kreftcellelinjer (HL60 human promyelocytisk leukemiceller, T-47D humane brystkarsinomceller, WEHI-3 mus myelomonocytiske leukemiceller, og LNCaP humane prostatakreftceller) med IC
50 verdier i området fra 0,1 2 mikrometer [23]. RM-133 viste også en lav til moderat risiko for legemiddelinteraksjoner basert på sin svake hemming av leverenzymer CYP3A4 og CYP2D6 [23]. I en foregående
in vivo
analysen, RM-133 blokkert av 57% vekst av HL60 svulst xenopodet i nakne mus [22]. I en forstudie av virkningsmekanismen av denne familien av aminosteroids, en analog av RM-133 blokkert HL60 celler i G0 /G1 fase og indusert apoptose [24].
Heri, rapporterer vi lovende anticancer aktivitet av RM-133 på humane adenokarsinomceller OVCAR-3-celler, som er en modell for legemiddelresistens undersøkelse i eggstokkreft [25], og for human pankreatisk karsinom (PANC-1) celler. Vi rapporterer også farmakokinetiske studier på RM-133 som involverer ulike kjøretøy, samt dens antitumor aktivitet i modeller av eggstokkene og bukspyttkjertel kreft, nemlig OVCAR-3 og Panc-1 svulster xenopodet inn nakne mus.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og cellekultur
Menneskelig eggstokkene (OVCAR-3) og bukspyttkjertelen (Panc-1) kreftceller ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og holdt i eksponensiell vekst i en 5% CO
2 fuktet atmosfære ved 37 ° C. OVCAR-3-celler ble rutinemessig dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma, St. Louis, MO) supplementert med 20% FBS, L-glutamin (2 mM), antibiotika (100 IU penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml) insulin (50 ng /ml) og østradiol (1 nM). For OVCAR-3 celle proliferasjonsanalyser, det medium som ble anvendt var identisk, med unntak av utelatelse av østradiol. PANC-1-celler ble opprettholdt i DMEM-høy glukose (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) inneholdende L-glutamin (2 mM) og antibiotika (100 IU penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml), og supplert med 10% FBS . For Panc-1 celleproliferasjonsprosesser analyser, ble sistnevnte vedlikehold medium erstattet med DMEM /F12 inneholder de samme tilskudd.
Celleviabilitet analyser
Analysen celleproliferasjon ble utført med en kolo metode med tre – (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) 2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium (MTS) (Cell Titer Aqueous 96, Promega, Madison, WI). Mikrotiter 96-brønners plater (Becton-Dickinson Company, Lincoln Park, NJ) ble podet med 1 x 10
4 celler /brønn suspendert i 100 ul medium og pre-inkubert i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. En stamløsning av RM-133 ble fremstilt i EtOH (1 x 10
-2 M) og er fortynnet i forsøksmedium, som ble tilsatt til hver brønn ved tid null. Etter en 72-timers inkubering, ble MTS (20 ul av oppløsningen som leveres av produsenten) tilsatt til hver brønn og platen ble inkubert i 4 timer. MTS blir omdannet til vannoppløselige fargede formazan ved dehydrogenaser som er tilstede i metabolsk aktive celler, og derfor, tillater MTS analysen umiddelbar bestemmelse av absorbans av det oppløselige formazan direkte i cellemediet og således måling av levedyktige celler.
En
490 av mediet ble bestemt ved hjelp av en 96-brønns mikroplateleser INFINITE 200 PRO-serien (TECAN, Männedorf, Sveits). IC
50 Verdien av RM-133 ble bestemt for hver av de to cellelinjene ved hjelp av GraphPad Prism 7-programvaren (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).
Dyr
Alle
in vivo
eksperimenter ble godkjent av vår Institutional Animal Care og bruk Committee (comites de beskyttelse des Animaux de l’Université Laval) og utført i henhold til retningslinjene for den kanadiske Council on Animal Care. For xenografter, homozygot ♀
nu /nu
hårløse mus (24-42 dager gamle) ble kjøpt fra Charles River Inc. (Saint-Constant, QC, Canada) og huset (04:56) i vinyl mikro- isolerte ventilerte bur, utstyrt med air lokk, som ble holdt i laminære luftstrømmen hetter og vedlikeholdes i henhold til patogen begrensende forhold. Under akklimatiserings og studieperioden ble dyrene holdt under et kontrollert miljø ved 22 ± 3 ° C, med 50 ± 20% relativ fuktighet og lys satt til 12 t /dag (lys på ved 7:15). Gnager mat (gnager diett # T.2018.15, Harlan Teklad, Madison, WI) og vann ble gitt
ad libitum
. For
nu /nu nakne mus
, mat og vann ble sterilisert før avgivelse til dyrene. Standard Balb /c mus ble benyttet for farmakokinetiske studier. Dyrene ble bedøvet med isofluran og drept ved halshugging.
Effekt av RM-133 på OVCAR-3 xenograft og narkotika plasmakonsentrasjon hos hårløse mus
Første del.
Twenty -To ♀
nu /nu
hårløse mus (22-24 g) ble inokulert sc med 5 × 10
6 ovčar-3 celler (i 0,1 ml vekstmedium som inneholder 30% Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA)) i begge flanker i hver mus via en 2,5 cm lang 22-gauge nål. Etter 11 dager, ble tumorbærende mus tilfeldig inndelt i to grupper på 11 mus hver i henhold til tumorstørrelsen, dvs. en kontrollgruppe (
n
= 12 tumorer) og en behandlet gruppe (
n
= 15 svulster). RM-133 ble administrert subkutant daglig 60 mg /kg i 0,1 ml propylenglykol: EtOH (92: 8). Dyrene i kontrollgruppen mottok 0,1 ml bærer alene. Tumorstørrelse ble målt to ganger ukentlig ved hjelp av en caliper. To vinkelrette diametre (
L Hotell og
W
) ble målt, og tumorområdet (i mm
2) ble beregnet ved hjelp av formelen (
L Twitter /2 ) x (
W Twitter /2) x rc. Dyrene ble veid ved forskjellige intervaller i løpet av eksperimentet.
Andre del.
Ved slutten av den xenograft eksperiment, og for å oppnå foreløpige farmakologiske data ble mus i behandlede grupper separert i fire undergrupper av 2-3 mus hver, injiseres sc med RM-133 (60 mg /kg) og avlivet etter 3, 7, 12 eller 24 timer. Parallelt ble mus i kontrollgruppen også delt inn i 4 undergrupper, behandlet med RM-133 (60 mg /kg) som for-behandlede mus, og avlivet ved de samme intervaller. Blod ble samlet opp fra mus ved hjertepunktering, og plasmakonsentrasjonen av RM-133 bestemt ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS /MS) som tidligere rapportert [23]. Tumorer i mus i den behandlede gruppe ble samlet ved obduksjon, samlet, homogenisert i henhold til en kjent fremgangsmåte [26] og mengden av RM-133 ble bestemt ved LC-MS /MS.
Plasmakonsentrasjon av RM -133 i mus ved forskjellige injeksjonsdoser
Åtte ♀ Balb /c-mus som veide ca. 20 g ble separert i 4 grupper. Mus i hver gruppe fikk en enkel s.c. injeksjon av RM-133 (30, 60, 120, eller 480 mg /kg). Bæreren som ble benyttet var propylenglykol: EtOH (92: 8) og injeksjonsvolumet var 0,1 ml for alle konsentrasjoner, bortsett fra at 480 mg /kg, hvor 0,2 ml ble brukt. Blodprøve ble tatt av hjertestans punktering etter 12 timer, og plasmakonsentrasjonen av RM-133 bestemmes av LC-MS /MS som ovenfor.
Analyse av ulike kjøretøyer for RM-133 administrasjon
Eleven forskjellige biler ble undersøkt ved sc injeksjon [27-35]. Disse kjøretøyene ble formulert slik: kjøretøy # 1 [propylenglykol: EtOH (92: 8)]; kjøretøy # 2 [vandig 0,4% metylcellulose: EtOH (92: 8)]; kjøretøy # 3 [ricinusolje: EtOH: benzylalkohol: benzylbenzoat (65: 10: 10: 15)]; kjøretøy # 4 [solsikkeolje: EtOH (92: 8)]; kjøretøy # 5 [solsikkeolje: tetrahydrofuran (92: 8)]; kjøretøy # 6 [vandig 25% β-cyklodekstrin: EtOH (92: 8)]; kjøretøy # 7 [sesamolje: EtOH: benzylbenzoat: benzylalkohol: Tween 80 (89,8: 7,8: 1: 1: 0,5)]; kjøretøy # 8 [soyaolje: EtOH (92: 8)]; kjøretøy # 9 [RPMI medium: EtOH (92: 8)]; kjøretøy # 10 [saltvann: dimetylsulfoksid (DMSO): Tween 80 (89,5: 10: 0,5)]; og kjøretøy # 11 [saltvann: benzylalkohol: natriumkarboksymetylcellulose: Tween 80 (98,2: 0,9: 0,5: 0,4)]. De åtte biler som produserer den beste RM-133 løselighet (# 1-8) ble injisert subkutant (0,1 ml) uten testforbindelsen (RM-133) for toleranse og atferdsevalueringsstudier, ved å observere mus ved 0,25, 1, 3, 7, 23, 26, 28, 30, og 96 timer etter injeksjon. Til slutt ble RM-133 injisert s.c. en gang ved 120 mg /kg /0,1 ml av de beste syv tolereres kjøretøy (# 1,2,4-7) i ♀ Balb /c-mus (4 per gruppe), og musene ble deretter overvåket med blodprøvetaking ved hjertepunktering etter tre og 12 timer. Plasmakonsentrasjonen av RM-133 ble deretter bestemt ved LC-MS /MS som ovenfor.
Effekt av gjentatt s.c. injeksjoner av RM-133 ved hjelp av 3 biler
Ten ♀ Balb /c mus som veide ca. 23 g ble separert i 3 grupper. Gruppe 1 (3 mus) ble behandlet s.c. med RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, to ganger om dagen (AM og PM), annenhver dag) i vandig 0,4% metylcellulose: EtOH (92: 8). Gruppe 2 (3 mus) ble behandlet s.c. med RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml, to ganger om dagen (AM og PM), annenhver dag) i solsikkeolje: EtOH (92: 8). Gruppe 3 (4 mus) mottok bare en injeksjon av RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml) i vandig 25% β-cyklodekstrin: EtOH (92: 8), og ble avlivet 24 timer senere. Mus i gruppe 1 og 2 mottok totalt 8 injeksjoner i løpet av 4 dager, og ble avlivet på dag 8. mus oppførsel ble overvåket under hele varigheten av forsøket, og makroskopisk observasjon av organer ble utført ved obduksjon.
effekt av RM-133 på ovčar-3 xenografter ved hjelp av de to valgte Katalog kjøretøy
Førti ♀
nu /nu
hårløse mus (22-24 g) ble inokulert med 5 × 10
6 OVCAR-3 celler pr flanke, i 30% matrigel-inneholdende kulturmedium (0,1 ml). Etter 23 dager, ble tumorbærende mus randomisert i 4 grupper på 8 til 9 mus hver. Gruppe 1 (12 svulster) ble behandlet subkutant med RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, en gang (AM) annenhver dag) i solsikkeolje: EtOH (92: 8), og gruppe 2 (13 svulster) ble behandlet subkutant med RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml, to ganger om dagen (AM og PM), annenhver dag) i vandig 0,4% metylcellulose: EtOH (92: 8). To kontroll mus grupper, som hver representerer 12 svulster, fikk bare kjøretøyene. Som nevnt ovenfor, ble tumorområdet målt to ganger ukentlig, og kroppsvekt overvåkes.
Effekt av RM-133 på PANC-1 xenotransplantater
Twenty hunn
nu /nu nakne
mus (22-24 g) ble inokulert med 5 x 10
6 PANC-1 celler per flanke, i 30% matrigel-inneholdende kulturmedium (0,1 ml). Ti dager etter inokulering, ble tumorbærende mus randomisert i 2 grupper på 10 mus hver. Mus i den første gruppen (
n
= 16 svulster) ble behandlet subkutant med RM-133 (240 mg /kg, to ganger om dagen (AM og PM), annenhver dag) i 0,2 ml vandig 0,4% metylcellulose: EtOH (92: 8). Mus i den andre (kontroll) gruppe (
n
= 18 tumorer) som mottok bare bæreren. Som med tidligere xenografter, ble tumorområdet målt og mus kroppsvekt overvåkes.
Syntese og utarbeidelse av RM-133
aminosteroid RM-133 (2β- [1- (kinolin-2 karbonyl) -pyrrolidin-2-karbonyl]
N
-piperazin-5α-androstan-3α, 17β-diol) ble syntetisert, karakterisert og renset som tidligere beskrevet [22]. Renheten av RM-133 ble funnet å være 99,5% som bestemt ved høyytelsesvæskekromatografi (Apparat: Shimadzu (Kyoto, Japan), Kolonne: Altima, HP, C18-AQ, 4,6 x 250 mm, 5 um; Løsemidler: A gradient fra metanol /vann (70:30) til 100% metanol; UV-deteksjon ved 190 nm). For
in vivo
behandlinger, ble RM-133 suspendert i bilen en dag før sin injeksjon i mus og lagret ved 4 ° C under konstant omrøring inntil bruk.
statistikker
Duncan-Kramer test ble brukt til å analysere data, og statistisk signifikans akseptert på
P
0.05 [36].
Diskusjon
Resultater og
RM-133 er cytotoksisk mot menneske OVCAR-3 og Panc-1 celler
For å evaluere effekten av RM-133 på spredning av OVCAR-3 og PANC-1 cancerceller, den sistnevnte ble inkubert med økende konsentrasjoner av RM-133 i 72 timer, og IC
50 av medikamentet deretter målt. RM-133 hadde klart en antiproliferativ aktivitet på de testede cellelinjer, med IC
50-verdier på 0,8 og 0,3 uM til OVCAR-3 og PANC-1, henholdsvis (figur 2). IC
50 verdier i 0,1-1 mikrometer utvalg oppnådd her var lik de tidligere målt i et panel av humane kreftcellelinjer med denne familien av aminosteroids [23].
IC
50-verdier ble beregnet som 0,8 um (OVCAR-3) og 0,3 um (PANC-1). Data representerer gjennomsnittet ± S.D. Feilstolpene er mindre enn symbolene.
OVCAR-tre cellelinjen ble avledet fra en pasient ildfast å cytotoksisk kjemoterapi, og er derfor en interessant modell for å undersøke legemiddelresistens [25]. Det faktum at RM-133 utstilt potent antiproliferativ aktivitet på en modell (OVCAR-3) som er kjent for sin chemoresistance, samt på Panc-1 celler, bedt oss om å undersøke
in vivo
aktivitet av RM videre 133 i to svulst xenograft modeller ved hjelp av disse to kreftcellelinjer.
RM-133 hemmer vekst av OVCAR-3 tumorxenotransplantater
Kvinner nakne mus ble inokulert i begge flankene med OVCAR-3 celler. Mus som har svulster ble randomisert i 2 grupper: en gruppe ble behandlet med RM-133 (60 mg /kg) og den andre (kontroll) mottok bæreren eneste (propylenglykol: EtOH (92: 8)). Svulster i kontrollgruppen ble klart raskere enn de som ble behandlet med den aminosteroid (figur 3A). Å starte fra dag 15 av medikamentterapi og til slutten av den eksperimentelle perioden, RM-133-behandlede tumorer ble vesentlig mindre enn i kontrollgruppen, med en 60% forskjell mellom de to gruppene, målt ved slutten av behandlingen. Siden toksisk potensial av en gitt forbindelse er avhengig av dens konsentrasjon og eksponeringstid [37], og som dødelighet, kliniske symptomer, og kroppsvektendring er blant de viktigste indikatorene på sin giftighet [38], er det verdt å merke seg at i løpet av en 21- dagers behandlingsperiode med RM-133, var det tilsynelatende ingen effekt på kroppsvekt (figur 3B) eller åpenbar toksisitet av medikamentet (f.eks unormal atferd, død).
OVCAR-3 celler (5 × 10
6 celler blandet med 30% matrigel) ble inokulert sc i begge flanker hos mus. Mus med en svulst ble injisert én gang daglig subkutant med RM-133 (0 eller 60 mg /kg kroppsvekt) i 0,1 ml propylenglykol: EtOH (92: 8), i 21 dager. Tumorstørrelse (A) og kroppsvekt av mus (B) ble registrert. Data representerer gjennomsnittet ± SEM. **: RM 133-behandlede gruppe er signifikant forskjellig fra kontroll (P 0,01)
Ved slutten av OVCAR-3 xenograft eksperiment, både kontroll og RM-133-behandlede grupper separat. mottatt en eneste sc dose av RM-133 (60 mg /kg). Blod ble oppsamlet etter 3, 7, 12 og 24 timer, og den medikamentplasmakonsentrasjon målt ved LC-MS /MS. Tidsforløpet for RM-133 plasmakonsentrasjonen var lik i gruppene A og B. Stoffet oppviste en klassisk medikament-avgivende profil [39], med en bolus levering av RM-133 etterfulgt av en vedvarende reduksjon i dens plasmakonsentrasjon (Fig 4 ). Den maksimale gjennomsnittlige plasmakonsentrasjon (460 ng /ml) ble observert i 3 timer etter bolusinjeksjon, og var redusert til 81 ng /ml etter 24 timer. Disse resultater viser at RM-133 ikke akkumuleres i blodet i løpet av 21 dagers-xenograft eksperiment. Tumorer i mus behandlet med RM-133 ble også samlet ved obduksjon for å måle mengden av RM-133. Det ble senere tilstede inne i tumoren i en konsentrasjon på 1,2 pM (773 ng /g), som svarer omtrent til konsentrasjonen av RM-133 som inhiberer 50% av OVCAR-3-celleproliferasjon (IC
50 = 0,8 uM) . Dette resultatet er i samsvar med den 60% reduksjon av tumorstørrelse progresjon observert i den første OVCAR-3 xenograft eksperiment. Således blir RM-133 ikke er tilstrekkelig konsentrert inne i svulsten til fullt ut å hemme veksten
RM-133 (60 mg /kg) i 0,1 ml propylenglykol.: EtOH (92: 8) ble injisert s.c. i
nu /nu
hårløse mus. Gruppe A: mus ble tidligere behandlet daglig i 21 dager med RM-133 ved 60 mg /kg; gruppe B:. mus som ikke tidligere er eksponert for stoffet
RM-133 plasmakonsentrasjon viser en logaritmisk avhengighet av mengden injisert
I tidligere eksperimenter, RM-133 hadde vist en maksimal antitumor-aktivitet på 57% mot HL60 xenotransplantater [32], som er sammenlignbart med 60% inhibering målt i denne rapporten til OVCAR-3-xenografter. Ved slutten av OVCAR-3 xenograft eksperiment, RM-133 plasmakonsentrasjon målt 12 timer etter en enkelt bolus-injeksjon på 60 mg /kg (i 0,1 ml) i gruppene A og B (figur 4) var 178 og 91 ng /mL hhv. Dette resultatet bedt oss om å undersøke den doseplasmanivået forhold til en enkelt subkutan injeksjon av RM-133 ved anvendelse av en rekke forskjellige doser av forbindelsen. Som vist i figur 5, plasmakonsentrasjonen (167 ng /ml) oppnådd etter injeksjon av 30 mg /kg bare utgjør 17% av den injiserte mengde, og denne prosentandelen reduseres ytterligere med høyere doser av RM-133. Således er utviklingen av den dosenivå forhold antyder at økning av RM-133 dose fører til et platå, sannsynligvis som et resultat av lav løselighet plasma eller av den dårlige biotilgjengeligheten av RM-133 i kjøretøyet brukes (propylenglykol: EtOH ( 92: 8)). Imidlertid dose på 480 mg /kg i 0,2 ml av kjøretøyet ble ikke tolerert av mus (figur 5), som manifesterer seg med bevegelse ubehag. Etter disse observasjoner, bærer alene (0,2 ml propylenglykol: EtOH (92: 8)) ble administrert til musene. Som mistenkt, reaksjoner var det samme hos dyrene, noe som indikerer at kjøretøyet selv (propylenglykol: EtOH (92: 8), ved 0,2 ml) ble den skyldige. Maksimalt volum tolerert var neste bestemt som 0,1 ml. Disse observasjonene førte oss til å undersøke alternative kjøretøy som ville tillate å gi høyere RM-133 plasma nivåer med minimale bivirkninger.
RM-133 ble målt ved LC-MS /MS 12 timer etter en enkelt subkutan injeksjon i Balb /c-mus ved bruk av propylenglykol: EtOH (92: 8) som kjøretøy. Volumet av injeksjonen er 0,1 ml, unntatt for den høyeste dosen som brukes (480 mg /kg), hvor 0,2 ml ble brukt. Volumet på 0,2 ml, med og uten RM-133, produsert noen bevegelse ubehag
Vehicle optimalisering. Screening av alternative kjøretøy for optimal RM-133 administrasjon
Ikke-vandige løsningsmidler slik som dimetylsulfoksid og polyetylenglykol, detergenter (for eksempel Tween, vegetabilske oljer, etc.) og oppløsningsmidler (f.eks β-syklodekstrin, metylcellulose) gir strategiske muligheter for å øke løseligheten i forbindelse drug discovery prosessen [30, 39]. Av denne grunn ble 11 forskjellige kjøretøyer med tidligere anvendte steroide derivater undersøkt. For det første, på grunnlag av oppløseligheten av RM-133 i hvert kjøretøy (tabell A i S1 fil), ble åtte kjøretøyer valgt for en andre runde av undersøkelser. I de sistnevnte eksperimenter, mus mottok en enkelt s.c. injeksjon av hvert stoff-fri bil for toleranse og atferdsvurdering (tabell B i S1 File). Basert på våre observasjoner på ulike etter injeksjon ganger (0,25 til 96 h), fjernet vi kjøretøyet # 3 (lakserolje basert). Faktisk, etter administrasjon av kjøretøy # 3 alene, mus viste mange ubehag symptomer (kløe, hopping, og microphtalmia), og i de påfølgende fire dager, mus present sår i snitt ~ 24 mm
2 på injeksjonsstedet.
I et tredje forsøk, de syv beste tolerert biler inneholder RM-133 ble injisert sc i mus (120 mg /kg) og blodprøver tatt etter 3 og 12 timer for RM-133 plasmakonsentrasjonsmåling (tabell 1). Den høyeste RM-133 plasmakonsentrasjon nås etter 3 timer ble det oppnådd med bærer # 6, etterfulgt (i nevnte rekkefølge) av kjøretøyer # 5, # 2, # 1, # 7, # 4 og # 8. Som forventet, hadde RM-133 plasmakonsentrasjon redusert etter 12 timer, men kjøretøy # 6 fremdeles ga de høyeste nivåene etter at sistnevnte intervall. I motsetning til dette kjøretøy # 8, ga den laveste plasmakonsentrasjonen i begge tidsintervaller. Basert på resultatene fra de tre forsøkene beskrevet ovenfor (tabell A og B i S1 File, Tabell 1), konkluderte vi med at (i) RM-133 var dårlig løselig i bilen # 5 (små klumper), (ii) at kjøretøy # 1 og # 7 førte til hudskader og kjøretøy # 8 ga de laveste plasmakonsentrasjonen av den analyserte settet. På den annen side, kjøretøy # 6 førte til de høyeste plasmakonsentrasjoner av settet, mens kjøretøy # 2 og # 4 ikke viste noen ugunstig effekt på mus. Vi har derfor valgt kjøretøy # 2, # 4 og # 6 for å utføre en ytterligere toleransetest.
Effekt av gjentatte subkutane injeksjoner av RM-133 i 3 valgte kjøretøy (toleransetest)
RM-133 ble administrert til mus hver dag ved hjelp av kjøretøyer # 2, # 4 og # 6. Dyrene ble behandlet i en uke med kjøretøyer # 2 og # 4, men bare en gang med kjøretøyet # 6. Mus oppførsel ble overvåket i løpet av eksperimentet, og makroskopisk observasjon av organer ble utført ved nekropsi (Tabell C i S1-fil). Ti timer etter subkutan injeksjon av den første dose av RM-133 (120 mg /kg /0,1 ml) i vandig 25% β-cyklodekstrin: EtOH (92: 8) (kjøretøy # 6), ble mus mobilitet betydelig redusert. Tjuefire timer senere, deres generelle tilstand hadde forverret seg ytterligere, sett med isolasjon, dehydrering, mikroftalmi, strittende, akselerert pustefrekvens, og magen oppblåst. Basert på disse observasjonene, vi brått avsluttet forsøket med kjøretøy som nr 6, 24 timer etter injeksjon. Ved obduksjon alle mus i den gruppen viste hemoragisk lungene, lastet mager sammen med tomme tarmer, og 75% viste litt forstørret nyrer. Når korrelert med musen dødsfall tidligere nevnt ved administrasjon av kjøretøy # 6 alene, disse observasjonene klart indikerte at syklodekstrin-baserte bilen ikke ble tolerert av mus, og kjøretøy som nr 6 ble derfor eliminert fra våre screeningstudier.
Interessant , og i samsvar med observasjonene fra forsøket utføres med kjøretøyer bare var noen ugunstig effekt bemerket når mus ble behandlet med RM-133 ved bruk av kjøretøy # 2 og # 4. Fordi fet bil # 4 (solsikkeolje: EtOH (92: 8) generert blemmer på injeksjonsstedet, begrenset vi behandling til en enkelt injeksjon av RM-133 (240 mg /kg /0,2 ml /annenhver dag) for xenograft eksperimenter er imidlertid den vandige bæreren # 2 (vandig 0,4% metylcellulose: EtOH (92: 8)). lov til å utføre flere injeksjoner (240 mg /kg /0,2 ml, BID /annenhver dag) uten skadelig virkning på mus Ved obduksjon. , organer viste ingen påviselig abnormitet. Dermed både kjøretøy # 2 og # 4 ble tatt med for sammenligning for
in vivo
studier på RM-133 antitumor aktivitet.
Antitumor aktivitet av RM -133 på OVCAR-3 xenotransplantater ved hjelp av to forskjellige kjøretøyer
Med solsikke-baserte bærer (figur 6A), begynte RM-133 for å hemme tumorvekst etter 20 dager, men effekten ble signifikant bare på dag 28 . ved slutten av behandlingen (40 dager), RM-133 hadde fullstendig hemmet (dvs. ved 100%) OVCAR-tre tumorvekst. Men fet natur kjøretøy # 4 generert store blemmer, som også hemmet tumormålinger. Når RM-133 behandling ble avsluttet på dag 40 på grunn av kjøretøy-induserte effekter, tumorvekst gjenopptatt, og ingen signifikant forskjell subsisted mellom de to gruppene syv dager etter avsluttet behandling (figur 6A). De sistnevnte resultater viser at den aminosteroid RM-133 var ansvarlig for tumorvekst inhibering. Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i kroppsvekt mellom ubehandlet (kontroll) og behandlet (RM-133) gruppe (Fig 6B). Videre ingen toksisitet symptom ble enten observert i løpet av studien eller ved obduksjon.
OVCAR-3 celler (5 × 10
6 celler blandet med 30% matrigel) ble inokulert subkutant i begge flanker hos mus. Tumor-bærende mus ble injisert s.c. med RM-133 (240 mg /kg kroppsvekt) eller bærer bare (0,2 ml solsikkeolje: EtOH (92: 8)) annen hver dag. Tumorstørrelse (A) og kroppsvekt av mus (B) ble registrert. Data representerer gjennomsnittet ± SEM **: RM-133-behandlede gruppe er signifikant forskjellig fra kontroll (P 0,01). *. RM-133-behandlede gruppen er vesentlig forskjellig fra kontroll (P 0,05)
Med methylcellulose baserte kjøretøy, ble tumorvekst signifikant forskjellig mellom de behandlede og kontrollgruppene så tidlig som på dag 15 (figur 7A), og denne forskjellen varte til slutten av forsøksperioden (dag 35). Faktisk, RM-133 behandling effektivt avskaffet den raske veksten av OVCAR-3 svulster, hvis areal ble redusert med den aminosteroid. Etter 28 dager, RM-133 hadde fullstendig hemmet (ved 100%) tumorvekst, og hadde ytterligere redusert tumorstørrelse til 78% av sin opprinnelige verdi ved slutten av behandlingen (35 dager). Etter behandlingen ble avbrutt, RM-133 fortsatt opprettholdt sin fullstendig blokade av tumorprogresjon før minst 12 dager etter avsluttet behandling (figur 7A). Interessant nok ble verken unormal atferd eller død registrert over 35-dagers behandlingsperiode med RM-133. Videre gjorde kjøretøy # 2 ikke påvirke kroppsvekt (figur 7B) eller føre til noen åpenbar toksisitet symptom over hele forsøksperioden samt ved obduksjon.
OVCAR-3 celler (5 × 10
6 celler blandet med 30% matrigel) ble inokulert sc i begge flanker hos mus. Tumorbærende mus ble injisert s.c. med RM-133 (240 mg /kg kroppsvekt) eller bærer bare (0,2 ml av en vandig 0,4% metylcellulose: EtOH (92: 8)) to ganger daglig, annenhver dag.
