Abstract
microRNAs er en klasse av naturlig forekommende små ikke-kodende RNA som er rettet mot protein-kodende mRNA på post-transkripsjonsnivået og regulere komplekse mønstre av genuttrykk. Våre tidligere studier har vist at i menneskelig prostatakreft miRNA
MIR-125b
er sterkt uttrykt, fører til en negativ regulering av noen tumorsuppressorgener. I denne studien, vi utvider våre studier ved å vise at
MIR-125b
undertrykker proteinproduktet av ink4a /ARF locus, P14
ARF, i to prostata kreft cellelinjer, LNCaP (wild type p53) og 22R
v
1 (både villtype og mutert p53), så vel som i PC-346C prostatakreft xenograft modell som lentivirally overuttrykt
MIR-125b
. Våre resultater høydepunkt som
MIR-125b
modulerer p53 nettverk ved å hemme nedregulering av MDM2, og dermed påvirke p53 og dens målgener p21 og Puma i tilstrekkelig grad til å hemme apoptose. Motsatt, behandling av prostata kreft celler med en hemmer av
MIR-125b plakater (anti-
MIR-125b
) resulterte i økt uttrykk av p14
ARF, redusert nivå av MDM2, og induksjon av apoptose. I tillegg har overekspresjon av
MIR-125b
i p53-manglende PC3-celler indusert nedregulering av p14
ARF, noe som fører til økt celleproliferasjon gjennom en p53-uavhengig måte. Dermed konkluderer vi med at
MIR-125b
fungerer som et onkogen som regulerer P14
ARF /MDM2 signalering, stimulere spredning av prostata kreft celler gjennom en p53-avhengig eller p53-uavhengig funksjon. Dette forsterker vår tro på at
MIR-125b
har potensial som et terapeutisk mål for behandling av pasienter med metastatisk prostatakreft
Citation. Amir S, Ma AH, Shi XB, Xue L, Kung HJ, Devere Hvit RW (2013) Oncomir
MIR-125b
Undertrykker P14
ARF å modulere p53-avhengig og p53-uavhengige apoptose i prostatakreft. PLoS ONE 8 (4): e61064. doi: 10,1371 /journal.pone.0061064
Redaktør: Matthew L. Anderson, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 22 oktober 2012; Godkjent: 06.03.2013; Publisert: 09.04.2013
Copyright: © 2013 Amir et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av NCI tilskuddet CA136597 og Department of Defense stipend PC080488. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Metastatisk prostatakreft (CAP), ved å komme videre til kastrering-resistente CAP (CRPC), representerer en stor trussel mot livet av amerikanske menn, noe som resulterer i anslagsvis 28,170 dødsfall fra denne sykdommen i 2012 [1]. Pasienter med metastatisk Cap blir vanligvis behandlet med androgen deprivasjon (ADT). Dessverre, svikt i ADT oppstår uunngåelig og pasientens svulst blir CRPC. Det er kjent at under CRPC progresjon netting cellene bruke en rekke forskjellige androgen reseptor (AR) -avhengig og uavhengige retninger for å overleve og blomstre i en androgen-fattig miljø [2]. Selv om flere forsøk har vært gjort for å karakterisere molekyl signaturen til CRPC, blir de nøyaktige mekanismer som fører til CRPC ikke helt forstått. I de senere år har oppdagelsen av microRNAs (miRNAs) avdekket et nytt lag av kompleksitet som regulerer mekanismene som er involvert i regulering CRPC [3], [4].
microRNAs er små ikke-kodende RNA som fungerer som sekvensspesifikke regulatorer av genuttrykk gjennom translasjonsforskning undertrykkelse og /eller karakter cleavage [5]. Studier har vist at mirnas spiller sentrale roller i cellulære prosesser for differensiering, proliferasjon, apoptose og metabolsk homeostase [6]. Videre kan mirnas fungere enten som tumor-suppressorer eller onkogener, avhengig av om de spesifikt rettet mot onkogener eller tumorsuppressorgener [7]. I denne forbindelse, tumorundertrykkende mirnas er vanligvis under uttrykt mens onkogene mirnas har en tendens til å være over-uttrykt i kreft [8]. Studier har vist at
MIR-125b
er onkogene. Overekspresjon av
MIR-125b
ble rapportert i tykktarmskreft [9], blærekreft, [10], eggstokk-kreft [11] og leukemi [12]. Vi har tidligere rapportert at kliniske Cap svulster uttrykkelig økte nivåer av
MIR-125b
forhold til godartet vev [13]. I tillegg har flere studier antydet at
MIR-125b
er sterkt uttrykt i Cap, særlig i metastatisk og invasive Cap svulster [14], [15]. Nylig undersøkte vi funksjonen til
MIR-125b Hotell og observert at overekspresjon av
MIR-125b
forfremmet xenograft tumor vekst i både intakte og kastrerte mus [16]. Videre viste vi at
MIR-125b
direkte rettet mot flere svulst undertrykkende og proapoptotiske gener inkludert p53, Bak1 og Puma [13], [16].
cellenivå og aktivitet av p53 er vedlikeholdes av en kompleks krets består av P14
ARF /MDM2 /p53 [17]. P14
ARF ble bekreftet å være en potent tumor suppressor både
in vitro Hotell og
in vivo product: [18] og har blitt foreslått å være det viktigste medlemmet av denne overvåkingen krets. Ekspresjon av p14
ARF blir indusert i respons til aktiverte onkogener slik som Ras [19], c-Myc [20], Abl [21] og E2F-1 [22] så vel som under replikative senescens [23]. P14
ARF medierer lagring og etterfølgende nedbrytning av p53-antagonist MDM2 via ubikvitin /proteasom-reaksjonsveien, noe som resulterer i stabilisering (økt halveringstid) av p53 [17] og den påfølgende aktivering av dens nedstrøms målgener, slik som p21 (cyklin-avhengig kinase inhibitor 1A), Puma (p53-oppregulert mediator av apoptose), og Bax (BCL2-assosiert protein X) [24], [25]. Siden disse molekylene er nøkkelkomponenter i p53-nettverk, kan modulering av deres ekspresjon forstyrre den normale balansen mellom apoptose og celleproliferasjon. Denne observasjonen er ytterligere underbygget av våre studier som viser at inaktivering eller nedregulering av p53, Puma og Bak1 av
MIR-125b
er assosiert med CRPC [13], [16].
Å ytterligere belyse rollen som
MIR-125b
i utviklingen av CRPC og dens underliggende molekylære mekanismer, i denne studien undersøkte vi involvering av
MIR-125b
i moduler p53 nettverk ved å målrette P14
ARF, som er støttet av vår identifikasjon av en potensiell
MIR-125b
bindingsstedet i 3’UTR av
P14
ARF
genet. Vi forventer at våre studier for å gi ny innsikt i de molekylære mekanismene knyttet til tumorigenesis og kastrering motstandsdyktig vekst på capsen og hjelp i å tilrettelegge anvendelsen av
MIR-125b
som et mål for Cap behandling.
materialer og metoder
Antistoffer og reagenser
For Western blotting-analyse, anti-P14
ARF (sc-8340), anti-MDM2 (sc-965), ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA); anti-Bak1 (3814), anti-Mcl-1 (4572), anti-Bcl-X
L, anti-caspase 3 (9662), anti-SMAC (2954) og anti-p21 (DCS60) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-Puma (PC686), anti-p53 (OP43) fra Calbiochem (Billerica, MA); anti-β-aktin (klone AC-15) fra Sigma (St. Louis, MO). Syntetisk
MIR-125b
ligne (MIR-125bm), miRNA negativ kontroll (MIR-NC), anti-
MIR-125b Hotell og anti-miRNA negativ kontroll (anti-MIR-NC) samt pMIR-RAPPORT Luciferase-vektoren ble anskaffet fra Ambion (Grand Island, NY). Begge
p14ARF
siRNA (sip14) og
Bak1
siRNA (siBak) ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California).
Cellelinjer og transfeksjon
Humant netting cellelinjer PC3, 22R
v
1 og LNCaP ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle cellelinjene ble rutinemessig opprettholdt i RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum inneholdende antibiotika og multivitaminer. For transient transfeksjon ble cellene sådd ut på 6-brønners plater én dag før transfeksjon og opprettholdt i serumholdig medium uten antibiotika. Dagen etter ble cellene transfektert med enten miRNA eller siRNA hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen, Grand Island, New York) i henhold til produsentens instruksjoner.
Western blot analyse
Celler ble dyrket til 70-80 % konfluens og lysert ved bruk av cellelyseringsbuffer (Cell Signaling Technology) supplert med fenylmetylsulfonylfluorid (1 mmol /L). Etter 20 min inkubering på is, ble lysatene sentrifugert ved 13000 rpm i 20 min og proteinkonsentrasjoner i supernatanten ble bestemt ved bruk av BCA-kit (Pierce, Rockford, IL). Totalt protein (50 ug per prøve) i 3 x proteinprøvebuffer [50 mmol /L Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol, 0,25% β-merkaptoetanol, bromfenol blå (1 mg /ml)] ble separert på SDS-polyakrylamid-gel (Bio-Rad, Hercules, CA), og deretter overført til Immobilon PVDF-membran (Millipore, Billerica, Massachusetts). Etter blokkering med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann /0,05% Tween 20 (TBST), ble membranen inkubert med en bestemt primært antistoff, etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Proteinbånd ble vist av forsterket kjemiluminescens. Uttrykket nivået av protein ble målt ved kvantitativ densitometrisk analyse.
Luciferase assay
Den menneskelige
P14
ARF
3′-UTR sekvens som inneholder den antatte
MIR-125b
bindingssetet ble forsterket av PCR fra LNCaP cDNA og klonet inn i pMIR-RAPPORT luciferase vektor nedstrøms av luciferase genet.
P14
ARF
3′-UTR mangler dette
MIR-125b
bindingssetet ble brukt som kontroll. PCR-produktene klones inn i plasmid ble verifisert ved DNA-sekvensering. For luciferase-assay,-celler (4 x 10
4 per brønn) ble sådd ut i 24-brønners plater og dyrket i 24 timer. Cellene ble deretter co-transfektert med reporter plasmider og 100 nM syntetisk Mir-125bm eller MIR-NC. PRL-SV40 Renilla luciferase plasmid (Promega, Madison, WI) ble anvendt som en intern kontroll. To dager senere ble cellene høstet og lysert med passiv lyseringsbuffer (Promega). Luciferase-aktivitet ble målt ved å bruke en dobbel luciferase reporter-analyse (Promega). Luciferase aktiviteten ble normalisert ved Renilla luciferase aktivitet.
Co-immunoprecipitation analysen
Protein samspillet mellom P14
ARF og MDM2 ble oppdaget av co-immunoprecipitation analysen. Totalt proteinlysatene fra MIR-125bm- eller MIR-NC-transfektert 22R
v
1 celler ble utarbeidet i cellelyse buffer. Protein (1,0 mg /0,5 ml) ble pre-klarert ved blanding med 20 pl protein A-kuler og supernatanten ble immunpresipitert ved 4 ° C over natten med et kanin anti-P14
ARF polyklonalt antistoff eller normalt kanin-IgG (Cell Signaling Teknologi). De utfelte proteiner ble fraksjonert på en 12% SDS-PAGE-gel, etterfulgt av Western blotting påvisning av MDM2-protein ved hjelp av anti-MDM2-antistoff.
TUNEL assay
TUNEL-analysen ble utført ved anvendelse av en
in situ
celledød deteksjon kit (Roche, Indianapolis, iN) i henhold til produsentens anvisninger. Kort, p53-positive 22R
v
en eller p53-null PC3 celler (1 x 10
5 /brønn) ble sådd i individuelle brønner av 4-brønn kammer lysbilder. Etter 24 timer ble cellene transfektert med 50 nM
MIR-125b
, 50 nM anti-
MIR-125b Hotell og 100 nM sip14, alene eller i forskjellige kombinasjoner. Ubehandlede og bestrålte celler ble anvendt som negative og positive kontroller. Mediet ble fjernet 72 timer etter transfeksjon og Glassene ble skylt to ganger med PBS, fiksert i en fikseringsoppløsning (4% paraformaldehyd i PBS, pH 7,4) i 1 time ved RT. Etter fiksering ble objektglass renset to ganger med PBS og inkubert i permeabiliseringen oppløsning (0,1% Triton X-100) i 2 minutter på is. 50 ul av den TUNEL reaksjonsblandingen (50 pl enzymoppløsning + 450 pl av etikett-løsning) ble tilsatt til hvert objektglass. For den negative kontrollen, ble bare 50 ul av etiketten tilsatt. DAPI ble anvendt som en kjernefysisk counterstain. Platene ble inkubert i en fuktig atmosfære i 60 minutter ved 37 ° C i mørket. Fluorescens mikroskopi ble utført for å visualisere celler og skaffe digitale bilder ved bruk av en eksitasjonsbølgelengde i området 450-500 nm og detekteres i området 515-565 nm.
WST-1-analysen
celler (4,5 x 10
3 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater i RPM1 medium inneholdende 10% FBS. Etter å ha vært dyrket i 24 timer ble cellene transfektert med 50 nM
MIR-125b
eller anti-
MIR-125b
. Etter fem timer ble cellene behandlet med friskt medium. Tetrazolium-basert celleproliferasjonsanalyse (WST-1, Promega) ble utført i henhold til produsentens protokoll.
Colony analysen
22R
v
1 (3 x 10
3 /brønn) og LNCaP (4 × 10
3 /brønn) ble separat belagt i seks-brønns plater og transfektert med
MIR-125b
eller anti-
MIR-125b
i en konsentrasjon på 100 nM ved hjelp lipofektamin 2000. etter to uker, ble cellekolonier talt etter farging i 20% metanol og krystallfiolett.
Resultater
MIR-125b
nedregulerer P14
ARF i Cap celler
Tidligere studier viste at svulsten suppressor genet p14
ARF er betydelig nedregulert i Cap vev [26]; Men hvordan P14
ARF er nedregulert forble dårlig forstått. Bruke TargetScan algoritme, en potensiell
MIR-125b
bindingssetet ble identifisert i 3-«UTR av
P14
ARF
mRNA. Vi undersøkte derfor effekten av
MIR-125b
om regulering av p14
ARF i Cap celler. For å gjøre dette, LNCaP og 22R
v
1 celler ble transfektert med syntetisk Mir-125bm å heve den cellulære
MIR-125b
overflod, eller med anti-
MIR-125b
for å undertrykke
MIR-125b
aktivitet. Som vist ved Western blot og kvantitative densitometriske analyser, sammenlignet med MIR-NC behandling, MIR-125bm indusert reduksjon av p14
ARF-ekspresjon ved 80% i LNCaP-celler (figur 1A, toppfelt), og 60% i 22R
v
1 (figur 1A, nedre panel). Omvendt, anti-
MIR-125b
økte P14
ARF nivå med 40% i LNCaP (figur 1A, topp panel) og 30% i 22R
v
1 (figur 1A, bunnfelt) sammenlignet med anti-MIR-NC. Vår tidligere studie viste at androgen opp-regulerer
MIR-125b
i Cap celler [13]. Således ble LNCaP og 22R
v
1-celler behandlet med 5,0 nM R1881 androgen og ekspresjonsnivået av p14
ARF ble bestemt. Det ble funnet at R1881 behandling induserte en 80% reduksjon av p14
ARF i LNCaP og 20% reduksjon i 22R
v
1 (figur 1A). Vi undersøkte også nivået av p14
ARF i en
MIR-125b
-overexpressed PC-346C mus xenograft tumor [16], og fant at nivået av p14
ARF protein ble redusert med 60 % i
MIR-125b
-overexpressed svulst i forhold til Mir-NC-kontroll svulst (figur 1B). For å avgjøre om den antatte
MIR-125b
bindingsstedet i 3′-UTR av P14
ARF mRNA er ansvarlig for regulering av p14
ARF av
MIR-125b
, luciferaserapportørplasmid vektorer som inneholder 3′-UTR fragment av
P14
ARF
genet ble ko-transfektert med MIR-125bm inn LNCaP celler. Som vist på figur 1C, kotransfeksjon resulterte i en omtrent 50% reduksjon av enzymaktiviteten i LNCaP-celler. Vi har også utført luciferase-analysen i 22R
v
1-celler, og et lignende resultat ble observert (data ikke vist). Til sammen resultatene vist i figur 1 validere regulering av p14
ARF av
MIR-125b
i Cap celler.
A
) Western blot analyse av uttrykk nivåer av P14
ARF i LNCaP (
toppen
) og 22Rv1 celler (
nederst
). Celler dyrket i 10% FBS media ble transfektert med 50 nM av MIR-125bm eller anti-
MIR-125b plakater (anti-125b) i 72 timer eller behandlet med 5,0 nM R1881 androgen i 48 timer. Deretter ble 50 ug protein per prøve analysert. Både MIR-negativ kontroll (MIR-NC) og anti-MIR negativ kontroll (anti-NC) ble benyttet som kontroller, og β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
B
) Western blot analyse av uttrykket nivåer av P14
ARF, MDM2 og p53 i lenti-
MIR-125b
-overexpressed PC-346C xenograft tumor. Både ubehandlet xenograft (untreat.) Og lenti-miRNA kontroll vektor-infisert PC-346C xenograft (vektor) ble anvendt som kontroller. I begge
A Hotell og
B
, tallene under gels er den gjennomsnittlige fold endringer av P14
ARF protein fra tre uavhengige gels i forhold til tilsvarende kontroller. Brett endringer ble beregnet ved å skanne P14
ARF band og normalisering for beta-aktin band.
C
) Luciferase assay av
MIR-125b
binding til 3′-UTR av
P14
ARF
mRNA i LNCaP celler. Analysen ble gjentatt tre ganger med hver analyse blir utført i tre brønner og lignende resultater ble oppnådd hver gang. De representative Resultatene er vist som en gjennomsnittlig ± SD (n = 3).
MIR-125b
-p14
ARFsignaling regulerer p53 nettverk
studier har vist at p14
ARF akselererer MDM2 degradering, noe som resulterer i p53 oppregulering [27]. Vi derfor spurte: gjør nedregulering av P14
ARF av
MIR-125b
påvirke uttrykket av MDM2 og p53 i Cap celler? For å løse dette problemet, ble LNCaP og 22R
v
1 celler behandlet med MIR-125bm og nivåene av MDM2 og p53 ble deretter undersøkt. Sammenlignet med MIR-NC, behandling LNCaP celler med
MIR-125b
induserte en dramatisk økning i MDM2 uttrykk og en betydelig reduksjon av p53 nivå (figur 2A, topp panel). Tilsvarende i 22R
v
1 celler,
MIR-125b
behandling også forbedret MDM2 uttrykk og redusert p53 nivå (figur 2A, nedre panel). Som forventet, MIR-125bm-mediert nedregulering av p53 induserte signifikant reduksjon av to like p53-effektorer, p21 og Puma. Tilsvarende, i
MIR-125b
-overexpressed PC-346C xenograft tumor, MDM2-ekspresjon ble øket tre-ganger og p53-protein ble nedregulert ved 83% sammenlignet med vektor kontroll (figur 1B). For å bekrefte nedstrømsresultater fra hemming av P14
ARF, vi brukte
P14
ARF
siRNA (sip14) til taushet P14
ARF i LNCaP og 22R
v
1 celler. Som vist ved immunoblotting, sip14 behandling signifikant redusert ekspresjon av p14
ARF protein og deretter oppregulert MDM2 nivå og downregulated ekspresjon av p53 (figur 2B). Siden P14
ARF binder direkte til C-terminalen av MDM2, undersøkte vi effekten av
MIR-125b
på protein interaksjon mellom P14
ARF og MDM2 av co-immunoprecipitation i 22R
v
en cap celler. Vi observerte at MDM2 kan oppdages fra anti-P14
ARF antistoff-utfelte proteiner, ikke fra kontroll IgG-koblede proteiner, noe som indikerer at endogent p14
ARF er i stand til å danne et kompleks med MDM2. Behandling med
MIR-125b
nedregulert P14
ARFprotein, noe som resulterer i en reduksjon av immunopresipitert MDM2 (figur 2C). Til sammen dataene vist i figur 2 gir bevis for at
MIR-125b
regulerer P14
ARF /MDM2 /p53 signalveien.
A
) Western blot analyse av MDM2 og p53 i MIR-125bm behandlede LNCaP (
toppen
) og 22R
v
1 celler (
nederst
). Cellene ble transfektert med 50 nM av MIR-125bm eller MIR-negativ kontroll (MIR-NC) i 72 timer. Like mengder av protein (50 ug) ble benyttet for å påvise ekspresjon nivåene av MDM2, p53, p21 og Puma.
B
) Western blot analyse av p14
ARF, MDM2 og p53 i
P14
ARF
siRNA (sip14) -behandlet LNCaP (
toppen
) og 22R
v
1 celler (
nederst
). Cellene ble behandlet med sip14 og de cellulære nivåer av P14
ARF, p53 og MDM2 ble analysert. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
C
) Samtidig immunpresipitasjonsanalyse av protein interaksjon mellom P14
ARF og MDM2 i 22R
v
1 celler. -Celler ble transfektert med MIR-125bm og 1,0 mg protein ble immunopresipitert med anti-P14
ARF antistoff eller kanin IgG. De resulterende immunecomplexes ble anvendt for å detektere nivået av MDM2 ved Western blot-analyse ved anvendelse av anti-MDM2 antistoff. Inngang: 50 mikrogram protein fra total cellelysat. IP: immunoprecipitation. IB:. Immunoblotting
MIR-125b
stimulerer spredning av Cap celler
Etter å ha fastslått regulering av p14
ARF /MDM2 /p53 signalveien etter
MIR-125b
, vi neste undersøkt effekten av reguleringen av P14
ARF av
MIR-125b
på Cap celleproliferasjon. For å gjøre dette, både LNCaP celler og 22R
v
1 celler ble transfektert med syntetisk Mir-125bm og celleproliferasjon ble bestemt av WST-1-analysen. Som vist i figur 3A og 3B, sammenlignet med den MIR-NC behandling, transfeksjon med MIR-125bm resulterte i en 1,5 gangers økning i celle-proliferasjon i begge cellelinjene som ble testet. I tillegg utførte vi klone formasjons analyser. I likhet med de WST-1 resultater,
MIR-125b
stimulert en 1,0 ganger økning i klonogene overlevelse av LNCaP celler og 2,5 ganger forbedring i 22R
v
1 celler, og tillegg av anti-
MIR-125b
forårsaket en dramatisk reduksjon i antall kolonier sammenlignet med de ubehandlede og anti-MIR-NC-celler (data ikke vist). Disse data støtter at nedregulering av p14
ARF av
MIR-125b
muliggjør vekst av Cap celler.
Celler ble transfektert med 50 nM av MIR-125bm eller 50 nM av miRNA negativ kontroll (MIR-NC) i 5 dager. Celleproliferasjon ble målt ved hjelp av WST-1-assay.
P14
ARF
siRNA (sip14) ble brukt som kontroll. Resultatene er uttrykt som spredning i forhold til at av MIR-NC-behandlede celler, og vist som gjennomsnitt ± SD (n = 4).
Anti
MIR-125b
Induced apoptose i Cap celler som uttrykker funksjonell p53
Siden
MIR-125b
regulerer P14
ARF /MDM2 signalering og deretter påvirker p53 nettverk, vurderte vi effekten av nedregulering av p14
ARF av
MIR-125b
på apoptose i p53-positive Cap celler. Først testet vi utgivelsen av mitokondriell SMAC (andre mitokondriene-avledet aktivator av caspase) og aktivert caspase 3 (Cas-3) i LNCaP og 22R
v
en cellelinjer som uttrykker funksjonell p53. Sammenlignet med MIR-NC behandling, forårsaket MIR-125bm 10% reduksjon av SMAC og 40% reduksjon av aktivert Cas-3 i LNCaP celler, og reduksjonen var 20% og 30% i 22R
v
1 celler henholdsvis (figur 4A). Disse cellelinjene ble også behandlet med anti
MIR-125b
. Sammenlignet med anti-MIR-NC behandling, nedregulering av
MIR-125b
aktivitet indusert omtrent en dobling i SMAC og aktivert Cas-3 (Figur 4A). Siden anti-
MIR-125b
oppregulerer SMAC og aktivert caspase 3, og dermed analyserte vi anti-
MIR-125b
indusert apoptotisk celledød ved hjelp av en TUNEL analysen. 22R
v
1 celler ble transfektert med MIR-125bm eller anti-
MIR-125b
. Ingen apoptotisk celledød ble observert i MIR-125bm-behandlede 22R
v
1 celler. I kontrast til behandlingen av 22R
v
1 celler med anti-
MIR-125b
forårsaket 63% av celler til å gjennomgå apoptose (figur 4B). For å bekrefte at
MIR-125b
modulerer p53-avhengig apoptose gjennom P14
ARF, 22R
v
1 celler ble behandlet med anti
MIR-125b
, etterfulgt av
P14
ARF
lyddemping. Det ble funnet at antisense til
P14
ARF plakater (sip14) dramatisk redusert apoptotisk død i
MIR-125b
-inactivated 22R
v
1 celler (Figur 4C) . Som forventet,
P14
ARF
stanse stimulert spredning av disse 22R
v
1 celler (data ikke vist). I tillegg ble uttrykket nivåer av flere pro-apoptotiske faktorer vurderes med Western blot-analyse. Faktisk behandling med anti
MIR-125b
indusert en oppregulering av P14
ARF protein i 22R
v
1 celler, mens tillegg av sip14 resultert i åpenbare nedregulering av p14
ARF (60%), p53 (30%) og Bak1 (70%), sammenlignet med krafse siRNA behandling (figur 4D). Disse dataene antyder sterkt at
MIR-125b Twitter /P14
ARF signal mål p53 nettverk, som regulerer p53-avhengige spredning og apoptose i Cap celler.
A
) Påvisning av SMAC og aktivert caspase 3 (Cas-3) i LNCaP (
venstre
) og 22R
v
1 (
midt
) celler. Cellene ble transfektert med 50 nM MIR-125bm eller 50 nM anti-
MIR-125b plakater (anti-125b) i 5 dager, og nivåene av SMAC og Cas-3 ble målt ved Western blot analyse. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. Tallene under gels er den gjennomsnittlige fold endringer av SMAC og Cas-3 fra tre uavhengige gels i forhold til tilsvarende kontroller.
B
) Påvisning av anti
MIR-125b
indusert apoptose i 22R
v
1 celler. Cellene ble transfektert ved hjelp av 50 nM anti-
MIR-125b
i 72 timer og apoptotisk celledød ble oppdaget ved hjelp TUNEL analysen. Den grønne atom fluorescens indikerer apoptotiske spalting av nukleært DNA (
forlot
). For kvantifisering av apoptotisk celledød, ble 400 celler tellet, og apoptose er uttrykt som% apoptose (apoptotiske celler /400 x 100%). Kvantitative analyser ble utført tre ganger, og resultatet ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3) (
høyre
). Celler behandlet med bestråling (IR, 6 Gy) ble anvendt som en positiv kontroll.
C
) TUNEL analyse av apoptotisk død 22R
v
1 celler som ble behandlet med anti
MIR-125b
fulgt av
P14
ARF
antisense (sip14). Resultatet ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3).
D
) Western blot analyser av P14
ARF, p53 og Bak1 nivåer i 22R
v
1 celler.
Venstre
: 22R
v
1 celler ble transfektert med anti-
MIR-125
;
midt
: anti-
MIR-125
-transfected 22R
v
1 celler ble behandlet med sip14. Både anti-MIR-NC (anti-NC) og krafse siRNA ble brukt som kontroller.
MIR-125b Twitter /P14
ARF signale formidler p53-uavhengig veksthemming
i de ovennevnte eksperimenter, validert vi at
MIR-125b Twitter /P14
ARF signalering er involvert i p53-avhengige mekanismer i Cap celler. Men studier har vist at inaktivering av p53-funksjon skjer i en del av pasienter med metastatisk netting [28], [29]. Har
MIR-125b Twitter /P14
ARF signale regulere cellevekst og apoptose i disse p53-mangel caps? Vi brukte p53-null PC3 cap celler for å løse dette problemet. Vi undersøkte påvirkning av endret
MIR-125b
aktivitet på uttrykket nivåer av P14
ARF og MDM2 proteiner. I likhet med at i p53-funksjonell LNCaP og 22R
v
1 celler, redusert MIR-125bm transfeksjon uttrykk for P14
ARF med 36% og økt MDM2 med 43% i PC3 cellene mens anti-
MIR-125b
indusere en åpenbar oppregulering av P14
ARF og en svak undertrykkelse av MDM2 (figur 5A). Vi neste testet om
MIR-125b
påvirker spredning og apoptose av PC3 celler. For dette formål ble PC3-celler behandlet med anti-
MIR-125b
og apoptotiske celler ble påvist med den TUNEL-analysen. Det ble funnet at behandling med anti-
MIR-125b
forårsaket 50% av disse cellene til å gjennomgå apoptose (figur 5B). Siden Bak1 ble rapportert å megle P14
ARF-indusert apoptose i p53-mangel celler [30], vurderte vi effekten av
Bak1
lyddemping på spredning av MIR-125bm-transfekterte PC3 celler. Det ble funnet at Mir-125bm induserte en 1,6 ganger økning i overlevelse av disse PC3 celler (figur 5C), støtter tidligere observasjon at P14
ARF /MDM2 signalering bidrar til en p53-uavhengig mekanisme [31]. For å bekrefte regulering av p53-uavhengige apoptose av
MIR-125b Twitter /P14
ARF signalering,
MIR-125b
aktivitet ble undertrykt med anti-
MIR-125b
og
P14
ARF
ble brakt til taushet av RNAi. Vi observerte at
P14
ARF
stanse betydelig redusert apoptotisk død av
MIR-125b
-inactivated PC3 celler (figur 5D), og også stimulert deres spredning (data ikke vist). I tillegg er uttrykk nivåer av P14
ARF og Bak1 ble analysert. Det ble funnet at
MIR-125b
inaktive indusert en oppregulering av P14
ARF, mens
P14
ARF
stanse reverserte oppregulering av P14
ARF (60%) og også induserte en nedregulering av Bak1 (figur 5E). En tidligere studie rapporterte at både Bcl-X
L og Mcl-1 medierer P14
ARF-indusert p53-uavhengige apoptose. Disse to anti-apoptotiske faktorer ble dermed analysert. Vi har ikke observere deres endring i
MIR-125b
-inactivated,
P14
ARF
-silenced PC3 celler (figur 5D). Samlet utgjør disse dataene viser at
MIR-125b Twitter /P14
ARF signalering er i stand til å regulere vekst og apoptose i p53-mangel Cap celler.
A
) deteksjon av P14
ARF og MDM2 nivåer i p53-null PC3 celler. Cellene ble transfektert med 50 nM av MIR-125bm eller anti-
MIR-125b
i 72 timer. Uttrykket nivåer av både p14
ARF og MDM2 ble analysert ved hjelp av Western blot-analyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
B
) Påvisning av anti
MIR-125b
indusert apoptose i PC3 celler. Cellene ble transfektert ved hjelp av 50 nM anti-
MIR-125b
i 72 timer og apoptotisk celledød ble oppdaget ved hjelp TUNEL analysen. Den grønne atom fluorescens indikerer apoptotiske spalting av nukleært DNA (
forlot
). For kvantifisering av apoptotisk celledød, ble 400 celler tellet, og apoptose er uttrykt som% apoptose (apoptotiske celler /400 x 100%). Kvantitative analyser ble utført tre ganger, og resultatet ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3) (
høyre
). Celler behandlet med bestråling (IR, 6 Gy) ble anvendt som en positiv kontroll.
C
)
MiR-125b
fremmer veksten av p53-null,
Bak1
-silenced PC3 celler. Celler ble behandlet med 50 nM MIR-125m i 5 dager, og celleformering ble målt ved bruk av WST-1-assay. Resultatene er uttrykt som veksthemning i forhold til den for MIR-NC (gjennomsnitt ± SD, n = 4). Innfelt: Bak1 uttrykk i
Bak1
-silenced PC3 celler.
D
) TUNEL analyse av apoptotisk død av PC3 celler som ble behandlet med anti
MIR-125b
fulgt av
P14
ARF
anti (sip14). Resultatet ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3).
E
) Western blot analyser av P14
ARF og Bak1 nivåer i PC3 cellene.
Topp
: PC3 celler ble transfektert med anti-
MIR-125
;
nederst
: anti-
MIR-125
-transfected PC3 celler ble behandlet med sip14. Både anti-MIR-NC (anti-NC) og krafse siRNA ble brukt som kontroller.
Diskusjoner
Nye observasjoner av avvikende miRNA uttrykk i ulike kreft hos mennesker har understreket viktigheten av mirnas i mange biologiske prosesser [5].
MiR-125b
er en bredt konservert miRNA og ble funnet å være forhøyet i flere typer kreft, inkludert CAP [14], [15]. Vi har tidligere rapportert at kliniske caps med høy Gleason score høyt uttrykte
MIR-125b product: [13], og at
MIR-125b
direkte rettet mot p53, Puma og Bak1, viser en anti-apoptotisk effekt
