Abstract
4-methylthiobutyl isothiocyanate (MTBITC), en alifatisk, svovelsyre sammensatte fra
Brassica
grønnsaker, besitter
in vitro Hotell og
in vivo
antitumoraktivitet. Nylig har vi demonstrert potent hemmende vekstpotensial av DNA-ødeleggende middel MTBITC i humane leverkreftceller. Her viser vi nå at MTBITC ned regulerer telomerase som sensitizes celler til apoptose induksjon. Dette blir mediert av MAPK-aktivering, men uavhengig av produksjon av reaktive oksygenarter (ROS). Innen en time, MTBITC indusert DNA-skader i kreftceller samkjøre til en forbigående økning i hTERT mRNA uttrykk som deretter omgjort til telomerase undertrykkelse, tydelig på mRNA samt enzymaktivitetsnivå. For å klargjøre hvilken rolle MAPK for telomerase regulering, leverkreftceller ble forbehandlet med MAPK-spesifikke hemmere før MTBITC eksponering. Dette viste tydelig at forbigående økning av hTERT mRNA uttrykk ble hovedsakelig mediert av MAPK familiemedlem JNK. I kontrast aktivert ERK1 /2 og P38, men ikke JNK, signaliserte til telomerase oppheving og påfølgende apoptose induksjon. DNA skade ved MTBITC ble også sterkt avskaffet av MAPK hemming. Oksidativt stress, som analysert ved hjelp av DCF fluorescens-analyse, elektronspinn-resonansspektroskopi og dannelse av 4-hydroxynonenal ble funnet som ikke er relevante for denne prosessen. Videre fikk N-acetylcystein forbehandling ikke påvirke MTBITC-indusert telomerase undertrykkelse eller depolarisering av mitokondriemembranen potensial som markør for apoptose. Våre data antyder derfor at ved DNA-skade ved MTBITC, MAPK er avgjørende for telomerase regulering og påfølgende veksthemming i levertumorceller, og denne detalj spiller sannsynligvis en viktig rolle i å forstå den potensielle kjemoterapeutiske effekten av ITC
Citation.: Lamy E, Herz C, Lutz-Bonengel S, Hertrampf A, Márton MR, Mersch-Sunder V (2013) The MAPK Pathway Signaler Telomerase Modulation i Response til Isothiocyanate-indusert DNA Damage of human Liver kreftceller. PLoS ONE 8 (1): e53240. doi: 10,1371 /journal.pone.0053240
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 02.07.2012; Godkjent: 27 november 2012; Publisert: 31 januar 2013
Copyright: © 2013 Lamy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. E.L. er finansiert av en akademisk stipend fra European Social Fond og departementet for vitenskap, forskning og kunst Baden-Württemberg, Tyskland. M-R.M. ble delvis finansiert dette prosjektet ved Sectorial Handlingsprogrammet «Human Resources Development 2007-2013» av rumenske Arbeidsdepartementet, Familie og sosial beskyttelse gjennom finansavtaleloven POSDRU /88 /1.5 /S /60203. Studien ble delvis støttet av en bevilgning fra Mattern Foundation, Tyskland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Telomerase gir et lovende mål for en
selektiv
terapeutisk tilnærming av malignitet i at 80 til 90% av kreftceller stabilt (re) uttrykker dette enzymet mens den er undertrykt i de fleste normale somatiske vev [ ,,,0],1]. hTERT, den katalytiske subenhet av enzymet, er kjent for å utøve anti-apoptotiske virkninger og samhandle med den DNA-skade respons pathway. Som en følge av kreftceller er mer motstandsdyktig mot kjemoterapeutiske midler eller strålebehandling [2], [3], [4], [5].
Isothiocyanates (ITC), naturlig forekommende sekundære anlegget bestanddeler av familien
Brassicaceae, etter er kjent for sin chemopreventive og -therapeutic handlinger både
in vitro Hotell og
in vivo product: [6], [7], [8]. En rekke studier har rapportert vekst undertrykkende og apoptose som induserer potens av denne gruppen i kreftceller og undersøkt liggende signalveier [9]. ITC er blitt vist å interferere med mange faktorer som er endret i kreftceller, for eksempel interaksjon med Bcl-2-familien, men de har også vist seg å selektivt redusere HDAC aktivitet [10]. Nylig ITC ble vist som potente telomerase-inhibitorer i løpet av induksjon av apoptose i forskjellige kreftceller [11], [12], [13], [14]. Sulforaphane (SFN), e. g. trykkes telomerase under sin spredning inhibering av MCF-7 samt MDA-MB-231 brystcancerceller [11]. Telomerase oppheving av SFN eller fenyletyl ITC ble også korrelert med programmert død i HeLa cervical samt PC-tre prostatakreftceller [13], [14]. SFN videre hemmet telomerase i humane Hep3B leverkreftceller som sin parallell programmert celledød [12]. Denne inhibering ble deretter foreslått å være formidlet av produksjon av reaktive oksygenarter (ROS). Andre studier har vist så langt at oksidativt stress og aktivering av mitogen-aktivert (MAPK) signalveien var involvert i drapet på kreftceller ved ITC [15]. Men data publisert så langt tilsier at ROS avhengighet av celledød samt MAPK engasjement kan være cellespesifikk.
I tidligere studier har vi allerede demonstrert effektiv vekst nedsatt leverkreftceller ved ITC [16]. Vi dermed rettet i denne studien å undersøke relevansen av MAPK-aktivering og oksidativt stress for celledød og telomerase regulering i menneskelige leveren kreftceller. Derfor brukte vi telomerase positiv HCC cellelinjer (HepG2, Huh7 og Hep3B) forskjellige i sin tumor suppressor p53 (TP53) status så vel som primære friske humane hepatocytter, blottet for telomerase. Våre resultater bekrefter aktivering av alle tre MAPK (JNK, ERK1 /2 og P38) ved behandling MTBITC uavhengig fra TP53 eller malignitet status av cellene. Vi kunne dessuten viser at veksthemming samt endringer i telomerase nivå ble signalisert av MAPK men ikke relatert til ROS produksjon. DNA-skade utløst av MTBITC ble hemmet i cellene når MAPK ble spesifikt blokkert.
Materialer og metoder
Kjemi
N-acetylcystein (NAC), menadione, 2 «, 7 «dichlorofluorescein diacetat (DCF-DA), deksametason, Tween 20, benzo [a] pyren (B (a) P og propidiumjodid (PI) ble kjøpt fra Sigma Aldrich (Steinheim, Tyskland) DMSO (renhet . 99% ) var fra Applichem (Darmstadt, Tyskland). β-merkaptoetanol og valinomycin ble kjøpt fra Fluka (Buchs, Sveits). Dulbeccos minimale essensielle medium (DMEM), kalvefosterserum (FCS), trypsin 10 x (25 mg /ml), trypsin-EDTA 10 x (5 mg /ml, henholdsvis 2,2 mg /ml), L-glutamin og fosfatbufret saltløsning (PBS uten Ca og mg) var fra PAA Laboratories GmbH (Coelbe, Tyskland). penicillin-streptomycin (P /S) løsning, RPMI-1640, 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid (JC-1), insulin-transferrin-selen (ITS) og SYBR gull 10,000 × var fra livets teknologier Invitrogen (Darmstadt, Tyskland) ,. 4-Hydroxynonenal (HNE) ble kjøpt fra Cayman Europa (Tallinn, Estland). 4-methylthiobutyl isothiocyanate (MTBITC, erucin) ble syntetisert ved Inst. for organisk kjemi, Universitetet i Giessen, Tyskland som beskrevet tidligere [17].
p38 inhibitor SB203580, JNK inhibitor SP600125 og JNK inhibitor V ble kjøpt fra Santa Cruz (California, USA). Den ERK1 /2 inhibitor U0126, p38 inhibitor SB202190 og ERK1 /2 inhibitor PB98059 ble erholdt fra Cell Signal (Boston, USA). Følgende primærinnsidere antistoffer ble brukt for immunoblotting: anti-p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr201, 1:2000), anti-p-JNK (Thr 183 /Tyr185, 1:2000, klone G9), anti-pc-Jun Ser73 og anti-p-p38 (Thr180 /Tyr182, 1:500) fra Cell Signal, anti- 4-Hydroxynonenal (1:250; klone 198960) fra R D Systems EUROPE (Abingdon, England) og anti-beta-aktin (1:10000, klone AC-74) fra Sigma Aldrich. Pepperrot peroksidase (HRP) -merket sekundære antistoffer anti-mus og anti-kanin ble kjøpt fra Cell Signal. Nukleasefritt fritt vann var fra Qiagen (Hilden, Tyskland). Caspase 3/7 GLO reagens var fra Promega (Mannheim, Tyskland). MTBITC, menadion og MAPK-inhibitorer ble oppløst i sterilt DMSO. HNE ble oppløst i etanol.
HCC Cellelinjer
HepG2 (vill-type p53) og Hep3B (null-p53) cellelinjer ble oppnådd fra den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ) , Braunschweig, Tyskland. Huh-7 celler (mut-p53) opprinnelig etablert av Nakabayashi et al. [18] ble vennlig levert av H. Blum (University Medical Center Freiburg, Tyskland). Cellene ble dyrket i lav glukose DMEM supplementert med 15% (HepG2) eller 10% (Huh7, Hep3B) FCS og 1% P /S i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C inntil 70% av konfluens og deretter høstet med trypsin. Cellelinje Verifikasjonen ble gjort ved mikroskopisk sjekke morfologi av cellene og utføre vekstkurve analyse på en jevnlig basis. Kun celler i passasje nummer 4-10 ble anvendt. Cellekulturen ble videre testet negativt for mycoplasma forurensning.
Primær humane hepatocytter
Normal hepatocytter ble isolert innen to timer fra materiale hentet fra pasienter som hadde gjennomgått delvis hepatectomy og fra hvem skriftlig samtykke hadde blitt oppnådd. Denne delen ble godkjent av etisk komité ved Universitetet i Freiburg. Vurdering av ikke-tumorous leveren parenchyma ble utført av en erfaren patolog med kompetanse i leveren patologi. Hepatocytter ble isolert ved anvendelse av den to-trinns kollagenase perfusjon teknikk i henhold til en modifisert protokoll fra guguen-Guillouzo
et al.
[19] og Strom
et al.
[20]. Cellene ble til slutt resuspendert i RPMI-1640 supplert med 15% FCS, 2 mM L-glutamin 1% P /S, 1% ITS, 100 nM deksametason og dyrket i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C for 20 timer.
Fastsettelse av medisineffekt
Drug effekt ble testet ved tidlige passasjer (P4-P10). For eksperimentene ble cellene sådd, supplert med kulturmedium og inkubert i 48 timer ved 37 ° C, 5% CO
2 atmosfære. Etter dette ble de subsammenflytende cellene eksponert for MTBITC i 1 til 48 timer og deretter bearbeides for analysene. I noen eksperimenter, subsammenflytende-celler ble forbehandlet med antioksydant-N-acetylcystein (NAC) i konsentrasjoner mellom 1,25 til 10 mm i 1 time. Deretter ble cellene grundig vasket med PBS før tilsetning av MTBITC i ytterligere 24 timer og påfølgende analyse forberedelse. I andre forsøk, subsammenflytende celler ble forbehandlet i en time med spesifikke MAPK-inhibitorer, enten 10 uM SB203580, 2,5 uM eller 5 uM SP600125 eller 40 uM PB98059 eller forbehandlet i 2 timer med 10 uM U0126, 20 uM JNK inhibitor V eller 20 mikrometer SB202190. En kombinasjon av inhibitorer ble også testet. Deretter ble cellene vasket grundig med PBS før du legger MTBITC eller 0,1% DMSO som løsemiddel kontroll og påfølgende analyse forberedelse.
Enkelt Cell Gel elektroforese (SCGE) Analyse
SCGE analysen også kjent som komet analysen ble utført som beskrevet tidligere [21]. Det% Tail-DNA ble beregnet som indikator for DNA-skade. For hver prøve, ble 102 systematisk screenet celler evaluert.
SubG1 DNA innhold og Cell Cycle Distribution
Cellular DNA ble målt etter permeabilization av høstet HCC celler ved fiksering med 70% iskald etanol for minst 24 timer og farging av DNA med PI konsentrat-blanding (40 ug /ml propidiumjodid, 100 ug /ml RNase (DNase fri), PBS), slik at for analyse av en DNA-innhold frekvens histogram. Analyse ble utført ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en FACSCalibur (BD). Den Modfit
© programvare ble brukt til å deconvolute histogrammene for å estimere andelen av celler i bestemte faser av cellesyklusen; Cell quest Pro
© programvare og FlowJo programvare (Treestar Inc, Ashlandd, USA) ble brukt til å kvantifisere andelen av apoptotiske celler i «sub-G1» eller «hypoploid» peak.
caspase 3 /7 cleavage analysen
caspase 3/7 cleavage ble brukt som bestemt parameter for apoptose induksjon. Dette ble bestemt i HepG2 celler ved hjelp av Caspase3 /7-Glo analyse (Promega, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner.
Vurdering av mitokondriemembranen potensial (MMP)
For deteksjon av endringer i MMP på celle-nivå, ble den lipofile kation JC-en brukes. Behandlede prøvene ble høstet ved trypsination, vasket to ganger med PBS og resuspendert i 1 ml av dyrkingsmedium supplert med proben JC-1 ved en endelig konsentrasjon på 2,5 ug /ml. Prøvene ble resuspendert og inkubert i henhold til celledyrkningsbetingelser i 30 minutter. Før analysen ble cellene vasket to ganger med kald PBS og deretter direkte analysert av en FACSCalibur (BD, Heidelberg, Tyskland).
Påvisning av Cell Senescence av ß-galaktosidase Farging
Senescence ble oppdaget bruker senescence ß-galaktosidase flekker kit (Cell Signaling Technology, Boston, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter cellen behandling med MTBITC eller kontrollerer Bildene ble tatt med et sterkt lys mikroskop (kompakt mikroskop system 8100E, Keyence, Osaka, Japan) med en objektiv Plan Apo 4 × /0.2 og en optisk forstørrelse på 4 × (Nikon, Japan).
Protein Analyse av immunoblotting
Proteiner ble analysert ved immunoblotting etter en modifisert protokoll fra Burnette [22]. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt som beskrevet av Bradford [23]. For immunoblotting ble 20 ug av proteinet blandes med ferdige SDS-prøvebuffer inneholdende, supplementert med 1% beta-merkaptoetanol. Elektroforese ble utført i henhold til metoden til Laemmli [24]. Gelen ble så overført til en nitrocellulosemembran ved våt-blotting (0,7 mA /cm
2, 90 min.), Blokkert med 5% lettmelk i TBS /Tween 0,1% og inkubert med primært antistoff i 1 time ved RT eller over natten ved 4 ° C, og deretter pepperrot peroksidase (HRP) -merket sekundært antistoff i 1 time ved RT, hver. Etter antistoff inkubering ble proteiner av interesse påvist ved kjemiluminescens teknikk. Et digitalt bilde av den vestlige blot ble tatt til fange av gel dokumentasjonssystem Molecular Imager® ChemiDoc ™ XRS sytem (Bio-Rad, München, Tyskland). Størrelse tilnærmelser ble tatt ved å sammenligne de fargede båndene som for et protein standard lastes under elektroforese. Prosessen ble gjentatt for det strukturelle proteinet beta-aktin. Mengden av målproteinet kan deretter bli indeksert til den strukturelle proteinet for å styre mellom gruppene.
telomeraseaktivitet Måling av TRAP-analyse
Telomerase-aktivitet ble detektert ved å bruke TeloTAGGG ELISA Kit, tilgjengelig i handelen fra Roche (Mannheim, Tyskland). Analysen ble utført etter produsentens instruksjoner med små modifikasjoner. For fullprotein lysater celler ble lysert ved bruk av celle-lytiske reagens fra Sigma Aldrich inneholdende 10 mM PSMF og 5 mM beta-merkaptoetanol i 30 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt etter fremgangsmåten beskrevet av Bradford [23]. For telomerase reaksjonen ble et totalt reaksjonsvolum på 50 ul med like mengder av protein og 2 x TeloTAGGG reaksjonsblandingen inkubert ved 25 ° C i 20 min, etterfulgt av denaturering ved 94 ° C, 5 min, 30 sykluser (ved 94 ° C i 30 s, ved 50 ° C i 30 s, og ved 72 ° C, 90 s). Endelig forlengelse ble utført ved 72 ° C, 10 min. Som negative kontroller, et likt volum av lyseringsløsning, nuklease fritt vann og varme-inaktivert 0,1% DMSO ble behandlet prøven (95 ° C i 5 min) ble benyttet. 5 pl eller 2,5 ul PCR-produktene ble anvendt for ELISA ifølge fremstilling protokoll. 30 pl av PCR-produktene ble lastet med 1 x ladningsbuffer på en TBE /12,5% polyacrylamid-gel; Elektroforesen ble utført ved 50 V i 30 minutter og etterfølgende 180 V i 5-6 timer. Gelen ble farget med en × SYBR gull /TBE løsning for 20 min og oppdaget under UV-lys. For molekylvekt besluttsomhet, ble 1 mikrogram av 50 bp DNA ladder (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) brukes.
Kvantitativ Real Time PCR av full lengde hTERT transkripsjon
Total RNA ble isolert med RNeasy mini Isolation kit fra Qiagen (Hilden, Tyskland) etterfulgt av et rensetrinn ved hjelp av RNase-fri DNase kit fra Qiagen. Revers transkripsjon av 1 ug total RNA fra hver prøve ble utført i 20 pl ved bruk av First Strand cDNA Synthesis Kit fra Fermentas. Et 168 bp fragment av hTERT cDNA ble amplifisert ved anvendelse av følgende oligonukleotider ved den angitte sluttkonsentrasjon: sense 5’GACACCATCCCCCAGGAĆ3 (50 nM) og antisense 5’TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 (50 nM). Kvantitativ sanntid (QRT -) – PCR-reaksjon ble utført i et totalvolum på 25 pl inneholdende Maxima SYBR grønn qPCR Master Mix 2 x (Fermentas), indikerte konsentrasjon av forover og revers primer og 2,5 pl cDNA ved anvendelse av 96-brønn 0,2 ml tynne veggen PCR-plater og MyIQ real time PCR System (Bio-Rad, München, Tyskland). QRT-PCR-betingelsene var: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 10 s, 54 ° C i 60 sek. Data ble samlet inn under forlengelsen trinn. Etterpå et smeltekurve ble utført for å bekrefte spesifisiteten av primerparene. Å normal beløpene ble referansen genet PBDG med følgende oligonukleotider brukt: sans 5’AGGATGGGCAACTGTACCTG3 (150 nM) og antisense 5’TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 (150 nM). Et 116 bp fragment ble produsert. Den komparative ct-metoden ble brukt for å beregne relative mengder av hTERT mRNA [25]. Hver QRT-PCR reaksjonen ble utført i tre eksemplarer.
Påvisning av ROS Produksjon av DCF-DA og elektronspinn resonans spektroskopi
For ROS deteksjon ved hjelp av DCF-DA, MTBITC-eksponerte celler ble høstet, resuspendert i friskt kulturmedium og straks inkubert med DCF-DA ved en konsentrasjon på 5 nM i 15 minutter. ved 37 ° C i mørket. Deretter ble DCF fluorescens målt med et FACSCalibur.
For ROS deteksjon ved hjelp av elektronspinn-resonans (ESR) spektroskopi med høy cellegjennomtrengelige spinnsonden 1-hydroksy-3-metoksy-karbonyl-2,2,5,5 -tetramethylpyrolidine hydroklorid (CMH, Noxygen Science Transfer Diagnostics GmbH, Elzach, Tyskland) og elektronspinn resonans (ESR) spectroscope E-Scan utstyrt med temperatur og gasskontroller BioIII (Noxygen) ble brukt. Holdes voksende celler ble inkubert i 1 til 6 timer med MTBITC, 100 uM menadion eller 0,1% DMSO i dyrkningsmedium. Etterpå ble cellene vasket en gang med Krebs-HEPES-buffer supplert med 25 uM deferoksamin (DFO) og 5 uM diethyldithiocarbonate (DETC, Noxygen) og inkubert med 100 pM CMH spinnsonden i Krebs-HEPES-buffer i 15 minutter ved 37 ° C. Supernatanter ble overført i nye reaksjonsrørene og holdt på is. ESR-spektra ble målt i 50 ul glasskapillærer. Etter instrument innstilling ble brukt: mikrobølgeovn frekvens 9.772GHZ og kraft 21,120 mW, mottaker gain 1.00e + 003, fase 0,20 ° C, harmonisk og modifisert amplitude 2,32 G, signalkanal konverterings 10.240 ms, tid konstant 40.960 ms og feie tid 5.24 s. Antallet skanninger var 5 til 20.
flowcytometrisystemer og Nedfall av enkeltceller
Enkeltceller (HepG2) ble avsatt i individuelle brønner i 96-brønners plater (Thermo Scientific, Bonn, Tyskland ) med en MoFlo celle sorter (Dako, Glostrup, Danmark). Cellene ble sortert ved hjelp fremover (lav vinkel, FSC) versus side scatter (90 ° -scatter, SSC) signaler å skille mellom levende og døde celler og rusk og området fremover scatter versus pulsbredde å skille mellom enkeltceller og celler festet til hverandre. Ingen celler ble plassert på rad 12, og disse flekker ble anvendt for 4 PCR-positive og 4 negative kontroller, respektivt.
Behandling av cellene med UV-bestråling
avdekket 96-brønners plater innehold enkeltceller ble utsatt for UV-bestråling i 10 min. ved hjelp av en ultrafiolett rensekammer. UV-kilden var en 30 watts Osram bakteriedrepende lampe (UVC utstrålt effekt 200-280 nm 13,4 W). Effektiviteten av UV-bestråling for å ødelegge dobbeltkjedet DNA ble analysert ved amplifisering av DNA-fragmenter av fire størrelser fra 143 bp til 1337 bp.
mtDNA Amplification
amplifikasjon av mtDNA fra behandlede og ubehandlede celler ble utført i 96-brønners plater som er mottatt fra én celle deponeringsteknikk. Til hver brønn 5 ul av PCR masterblanding inneholdende 1 x Advantage to PCR-buffer (Clontech, BD Biosciences, CA, USA), 0,1 pl av Advantage 2-polymerase blanding (Clontech), 200 uM hver dNTP (Bioline, Luckenwalde, Tyskland) og 0,4 mikrometer hver primer (F14816 /R16152, F16197 /R00293, F00314 /R00639 og F08294 /R08436, jf tabell 1) (Biomers, Ulm, Tyskland) ble tilsatt. PCR-amplifikasjon ble utført på en PTC 200 termosykler (MJ Research, Waltham, MA, USA) med følgende termisk sykling betingelser: 95 ° C i 2 minutter, 38 sykluser av 95 ° C i 15 s, 56 ° C i 30 sek , 72 ° C i 90 s etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. Hele reaksjonen ble visualisert under standardiserte betingelser på en 2% agarosegel (50 ml agarose med 4 mL SybrSafe (Invitrogen Carlsbad, CA), elektroforese i 25 min ved 60 V, etterfulgt av eksponering for UV-lys i 160 millisekunder).
data Analysis
Resultatene ble analysert ved hjelp Graphpad Prism 5-programvaren (GraphPad Software Inc., LaJolla, USA). Statistisk signifikans (p≤0.05, p≤0.01) av MTBITC behandling på de undersøkte parametrene i HCC celler ble beregnet mot løsemiddel kontroll, 0,1% DMSO. For å finne ut betydningen av MAPK spesifikk hemming på de undersøkte endepunkter, ble MTBITC-behandlede prøver avregnes mot respektive inhibitor-behandlet motstykke med enveis ANOVA etterfulgt av Bonferronikorreksjon.
Resultater
nDNA er skadet av MTBITC som utløser Transient hTERT mRNA uttrykk
Vi først undersøkt skadene av nDNA i HepG2 celler etter 25 mikrometer MTBITC eksponering. Etter 1 time ble nDNA av MTBITC-behandlede celler vesentlig skadet, som bestemmes av komet analysen (figur 1a). Dette ble korrelert med en rask respons av celler i form av forbigående hTERT mRNA uttrykk som registreres innen 1 time (figur 1b). hTERT mRNA-ekspresjon var tilbake til kontrollnivåer etter 6 timers eksponering for MTBITC (figur 1b) og celle eksponering til ITC i mer enn 6 timer, resulterte i en betydelig undertrykkelse av hTERT mRNA transkripsjon, som også kan observeres ved langvarig lav- dose eksponering (figure1b).
a) Celler ble eksponert for 25 uM MTBITC eller oppløsningsmidlet kontroll (0,1% DMSO) i 1 time og deretter analysert for deres DNA-skade i kometsystemet. Det% hale-DNA ble anvendt for skade kvantifisering. Barer er gjennomsnitt ± SD, n = 3. Celler eksponert for 100 uM benzo (a) pyren (B (a) P) i 1 time, ble anvendt som positiv kontroll. b) Ekspresjon av full lengde hTERT mRNA etter eksponering for MTBITC eller løsningsmiddelkontroll i 1 time til 96 timer ble analysert ved RT-PCR. PBDG ble anvendt i alle forsøk som referanse genet. mRNA-ekspresjon ble beregnet i forhold til løsningsmiddelkontroll; barer er gjennomsnitt ± SD (n = 3).
MTBITC Behandling Årsaker Aktivering av MAPK Pathway
MAPK signaltransduksjonsbane fortrinnsvis aktivert i respons til miljømessige og gentoksiske påkjenninger og inntar en sentral rolle i celle spredning og overlevelse [26]. Veksthemming av ITC er blitt tilskrevet aktivering av MAPK-reaksjonsveien i forskjellige cellemodeller for [27]. Vi har derfor neste undersøkt responsen av MAPK i leveren kreftceller til MTBTIC. Vi observerte at i alle tre cellelinjene MTBITC behandling resulterte i betydelig aktivering av ERK1 /2 på Thr202 /Tyr204, JNK på Tyr183 /Tyr185 og P38 på Thr180 /Tyr182 ved fosforylering i en tids (figur 2a), men også konsentrasjonsavhengig måte ( figur 2b). Interessant, i friske humane hepatocytter blottet for telomerase, denne veien ble også aktivert (figur 2c). Å deretter finne ut om denne aktiveringen blir reflektert av cellefunksjon, vi neste adressert levedyktigheten til normale primære humane hepatocytter. Som vist på figur 2d, selv etter 72 timers eksponering for MTBITC, kunne noen ugunstig effekt skal detekteres, som bestemt ved mikroskopisk observasjon av cellemorfologi.
Cellene ble lysert og lysatet total utsatt for immunblotting. a) HCC celler ble behandlet med 25 uM MTBITC eller oppløsningsmidlet kontroll (0,1% DMSO) i de angitte tidspunkter. HepG2-celler (b) eller humane hepatocytter (c) ble behandlet med MTBITC i 3 timer ved de angitte konsentrasjoner. Representative blottene er vist. Hver blot ble reprobed med anti-β-actin-antistoff for å sikre lik protein lasting. d) Primære normale humane hepatocytter ble ikke negativt påvirket av MTBITC, som tydelig i representative bilder, tatt av lysmikroskopi. SC: løsemiddel kontroll = 0,1% DMSO. +, Positiv kontroll = 0,01% triton X-100. Bar = 100 mikrometer. Alle panelene har samme forstørrelse.
Rolle MAPK i MTBITC-mediert Telomerase forordning
For å bestemme relevansen av den observerte MAPK-aktivering i telomerase modulasjon samt celleproliferasjon, vi forbehandlede HepG2-celler med JNK-inhibitor (SP600125 eller JNK inhibitor V), P38 inhibitor (SB203580 eller SB202190), ERK1 /2 inhibitor (U0126 eller PB98059) eller en kombinasjon, etterfulgt av behandling med MTBITC. Aktivering av MAPK gjennom MTBITC ble nesten fullstendig fjernet ved pre-inkubering med inhibitorer, som vist i figur 3a. Forbehandling av HepG2-celler med enten av inhibitorene – med unntak av JNK inhibitor V – mislyktes i å vesentlig påvirke MTBITC-utløste hTERT mRNA-ekspresjon ble observert etter 1 time (figur 3b). Interessant, en kombinasjon av alle tre MAPK-inhibitorer (SP600125, SB203580, U0126 eller SB202190, JNK inhibitor V og U0126) redusert MTBITC-utløste hTERT mRNA-ekspresjon høyde (figur 3b). Dette kan meget vel være grunn av hemming av JNK-aktivering, som enten forbehandling med SP600125 eller JNK inhibitor V alene avskaffet hTERT mRNA nivå ekstrautstyr (figur 3b). Til slutt fant vi ut relevansen av MAPK for MTBITC-indusert enzymet telomerase aktivitet undertrykkelse. En konsentrasjonsavhengig nedregulering av enzymaktivitet var tydelig allerede etter 3 timers eksponering for MTBITC, vurdert ved TRAP-ELISA (figur 3c). Dette kunne klart avskaffet av MAPK blokkering. Videre, ved å selektivt blokkere MAPK, kunne vi vise at p38 samt ERK1 /2, men ikke JNK var minst delvis ansvarlig for telomerase enzymet hemmes av MTBITC som vurderes etter 24 timers eksponering (figur 3d).
For spesifikk inhibering av p38-aktivering, 10 uM SB203580 eller 20 uM SB202190, av JNK-aktivering, 5 uM SP600125 eller 20 uM JNK inhibitor V ble anvendt, respektivt. 10 uM U0126 eller 40 pM PB98059 ble brukt til ERK1 /2-hemming. Celler ble forbehandlet med inhibitorene og deretter utsatt for MTBITC eller oppløsningsmidlet kontroll (0,1% DMSO). a) Immunoblot-analyse viser effektiv inhibering av målproteinene. β-actin ble brukt som lasting kontroll b) Pre-behandlede celler ble analysert for full lengde hTERT mRNA uttrykk etter en time eksponering til 25 mikrometer MTBITC. PBDG ble anvendt som referanse-genet. mRNA-ekspresjon ble beregnet i forhold til det tilsvarende løsningsmiddel kontroll (n = 3). c + d) Pre-behandlede celler ble analysert for telomeraseaktivitet enzymaktivitet etter 3 h (d) eller 24 timer (e) MTBITC eksponering ved hjelp av TRAP-ELISA-analysen. Telomeraseaktivitet ble beregnet i forhold til det tilsvarende løsningsmiddel kontroll; stolpene er gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Hemmere 3 ×. Kombinasjon av SB203580, SP600125 og U0126
Rolle MAPK i MTBITC-mediert Vekst Demping
I et neste trinn, forsøkte vi å finne ut om MAPK kan også konto for MTBITC-indusert cellesyklus arrest i HepG2 celler. Men alle hemmere som eneste komponent eller i kombinasjon mislyktes i å beskytte cellene fra MTBITC-mediert G2 /M stans (figur 4a). Denne observasjonen ble bekreftet ved anvendelse av en kombinasjon av det andre settet inhibitor (data ikke vist). Når man studerer apoptose av subG1 DNA innholdsanalyse, kunne ingen relevans av MAPK for MTBITC-utløst celledød bli sett (figur 4b). Imidlertid kvantifisering av apoptose i forhold til den mer spesifikke caspase 3/7 spalting viste at blokkering av alle tre MAPK vesentlig oppheves MTBITC-utløste celledød. Dette kan tilbakeføres til ERK1 /2-signalering, som inhibering av ERK1 /2 aktivisering sterkt avskaffet apoptose (figur 4b). For ytterligere å etablere foreningen av apoptose og DNA-skader med MAPK signalering, kvantifisert vi effekten av MAPK hemmere på MTBITC-indusert DNA trådbrudd. Som begge ble HCC celler samt sunne hepatocytter aktivert i deres MAPK signal av MTBITC, men bare kreftcellene ble sendt til apoptose, hevet vi spørsmål om det kan være en forskjell i mengden av DNA-skader mellom normal og ondartet celler. Som vist i figur 4c, DNA-strengbrudd var faktisk mye lavere hos friske hepatocyes i forhold til HepG2-celler. Når cellene ble deretter forbehandlet med en kombinasjon av alle tre inhibitorer ble skadene redusert til reguleringsnivå (figur 4c).
forbehandlet HepG2-celler ble eksponert for 25 uM MTBITC eller 0,1% DMSO i 24 h og deretter preparert for a) DNA-innhold og b) subG1 DNA innholdsanalyse (markør for apoptose) ved hjelp av flow cytometri og PI farging av DNA bildene viser representative DNA-innhold histogrammer av HepG2-celler. c) Caspase 3/7 spalting ble anvendt som spesifikke parameter for apoptose-induksjon. Kaspase 3/7 aktiviteten ble beregnet i forhold til det tilsvarende løsningsmiddelkontroll; barer er gjennomsnitt ± SD (n = 3). d) DNA-skader i HepG2 celler eller primære humane hepatocytter ble vurdert etter 24 timers eksponering til MTBITC hjelp kometen analysen. For å sammenligne mellom de to celletyper, ble DNA-skade beregnet i forhold til løsningsmidlet kontroll (SC, 0,1% DMSO). Barer er gjennomsnitt ± SD, n = 2. hemmere 3 ×. Kombinasjon av SB203580, SP600125 og U0126
ROS er ikke involvert i MTBITC-mediert Telomerase Modulation eller veksthemming
noen andre naturlige stoffer har nylig blitt foreslått å formidle telomerase undertrykkelse i kreftceller via ROS produksjon [28], [29]. Videre er en rekke studier som undersøker ITC i forbindelse med kreftcellevekst undertrykkelse foreslått ROS produksjon som oppstrøms arrangement for MAPK-aktivering og celledød og /eller vekststans [15]. I sammenheng med vår studie, vi derfor søkt å finne ut om ROS var involvert i telomerase modulering av MTBITC eller kunne fungere som celledød effektorer. Intracellulær ROS i kontroll- og MTBITC-behandlede celler ble først vurdert av flowcytometri etter farging av tilhenger voksende HepG2 celler med H
2DCFDA. Innen en time av MTBITC-eksponering, kan ingen endring i ROS nivå oppdages (data ikke vist).
