Abstract
hemmere av poly [ADP-ribose] polymerase 1 (PARPis) lovende for behandling av kreft som mangler kapasitet for homolog rekombinasjon reparasjon (HRR). Imidlertid er nye terapeutiske strategier som kreves for å overvinne medfødt og ervervet resistens mot disse stoffene og dermed utvide utvalget av kreftformer som kan dra nytte av dem. Vi viser at menneskelige kreftcellelinjer som reagerer dårlig på ABT-888 (en PARPi), blir følsomme for det ved samtidig behandling med vorinostat (en histondeacetylase inhibitor (HDACi)). Vorinostat også sensibiliserte PARPis ufølsomme kreftcellelinjer til 6-tioguanin (6-TG) -en narkotika som er rettet mot PARPis sensitive celler. Den sensibiliserende virkning av vorinostat var assosiert med økt fosforylering av eukaryote initiering Factor (EIF) 2α som i seg selv øker følsomheten av kreftceller til ABT-888. Viktigere, gjorde disse legemiddelkombinasjoner ikke påvirke overlevelsen av normale fibroblaster og bryst celler, og betydelig økt inhibisjon av xenograft tumorveksten i forhold til hvert medikament alene, uten å påvirke musene vekt eller deres lever- og nyrefunksjon. Våre resultater viser at kombinasjonen av vorinostat og ABT-888 kan potensielt være nyttige for behandling av cancer med medfødt motstand mot PARPis grunn av aktiv HRR maskineri, mens kombinasjonen av vorinostat og 6-TG kan potensielt overvinne medfødt eller ervervet resistens mot PARPis på grunn sekundære eller reversering BRCA mutasjoner, til redusert PARP-1 nivå eller til økt uttrykk av flere legemiddelresistente proteiner. Viktigere, kan legemidler som øker fosforylering av eIF2α ligne sensibiliserende virkning av vorinostat på cellulær respons til PARPis eller 6-TG, uten å aktivere alle sine nedstrøms effektorer
Citation. Yalon M, Tuval-Kochen L, Castel D, Moshe jeg, Mazal jeg, Cohen O et al. (2016) vinne motstand av kreftceller til PARP-1-hemmere med tre ulike legemiddelkombinasjoner. PLoS ONE 11 (5): e0155711. doi: 10,1371 /journal.pone.0155711
Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA
mottatt: 5 juli 2015; Godkjent: 03.05.2016; Publisert: May 19, 2016
Copyright: © 2016 Yalon et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. https://ec.europa.eu/research/mariecurieactions/Grant # PCIG10-GA-2011-303795. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det har nylig blitt oppdaget at bryst, ovarier og prostata kreft celler som bærer bi-allele mutasjoner for brystkreft mottakelighet genet (BRCA) 1 eller BRCA 2, eller som er fosfatase og tensin homolog mangelfull (og derfor ikke kan uttrykke RAD51), er ekstremt følsomme for hemmere av PARPis og til sletting av PARP-1 [1,2]. Disse funnene forsterket forestillingen om at nedsatt kapasitet for HRR resultater i følsomhet for PARPis.
Den menneskelige PARP-familien består av 17 enzymer som hver er et produkt av en annen genet. Enzymene alle har bevart katalytiske domener og DNA-bindende domener. PARP-1 binder seg til fastlåste replikasjonsgafler samt til enkelttrådbrudd (SSBs) som kan dannes spontant, under basis excision reparasjon eller i respons til DNA-ødeleggende midler. Binding til DNA-lesjoner aktiverer PARP-1 fører til tilsetning av poly (ADP-ribose) grupper fra NAD
+ til proteiner involvert i DNA reparasjon og replikasjon inkludert PARP-1 seg selv og til histoner i nærheten av PARP-1-bindingsseter . Opphopning av poly (ADP-ribose) fører til rekruttering av DNA reparasjonsproteiner. På SSBs hovedrollen PARP-1 er å rekruttere røntgen reparasjon kryss utfyller protein 1 (XRCC1), mens fastlåste replikering gafler sin aktivitet innebærer rekruttering av sjekkpunkt kinase 1 (CHK1) [3-5]. PARP-2 blir også aktivert av DNA-skade og har en rolle i å undertrykke spontan dannelse av DNA-toksiske lesjoner, men dens relative overflod og katalytiske aktivitet er lavere enn de av PARP-1 [3]. Mens PARP-1 – /- eller PARP-2 – /- mus er levedyktig og sunn, dobbelt-knockout mus dør i livmoren, noe som tyder på at noen av rollene spilles av hver av disse PARPs er avgjørende og redundant [1,3] . Farmakologisk inhibering av PARP-1-aktivitet eller dets delesjon hemmer reparasjon av SSB, som i fravær av funksjonell HRR kan føre til dannelse av unrepaired dobbeltstrengbrudd (DSB) i løpet av replikasjon, til replikering gaffel sammenbrudd og celledød [1,3,4 ]. Det er derfor klart hvorfor PAPRis målceller med muterte BRCA eller som på annen måte svekket i sin evne til HRR. Dessverre, i tillegg til deres begrensede mål befolkning, er utvikling av resistens mot PARPis et stort problem. Sekundære BRCA mutasjoner, som gjenopprette BRCA åpen leseramme (ORF) og funksjonell C terminal samt økt uttrykk av multiresistens (MDR) en eller redusert uttrykk av PARP-1 alle føre til tap av følsomhet for PARP-1-hemmere [1 , 3]. Også redusert ekspresjon av 53BP1 har vist seg å oppheve følsomheten av BRCA1 muterte celler til PARPis [6]. Det er derfor viktig å finne måter å overvinne motstanden mot PARPis uavhengig av det som blir kjøpt opp eller medfødt.
Relevant for denne forestillingen er de funn som HDACis reduserer nivået av HRR proteiner og ved 5 mikrometer, vorinostat (den første HDACi godkjent av FDA for behandling av kreft) dramatisk reduserer nivået av disse proteiner i kreftcellene, men ikke i normale celler [7,8]. Derfor er vorinostat forventes å sensibilisere kreftceller for behandling med PARPis, uavhengig av deres iboende evne til DNA-reparasjon. Også aktiviteten av NF-kB og CHK1 som er assosiert med resistens mot vorinostat [7] er avhengig av PARP-1-aktivitet [5,9]. Derfor er vorinostat og PARPis forventes å forbedre gjensidig det anti-neoplastiske effekt av hverandre. Faktisk, mens dette arbeidet pågikk flere laboratorier rapportert at HDACis lysfølsomt dyrkede kreftceller til PARPis [10-14].
I tillegg til PARPis, anti-metabolitten 6-tioguanin (6-TG) også mål celler med BRCA mutasjon eller med andre mangler i deres kapasitet for HRR [15]. 6-TG i dag brukes i behandling av akutt lymfatisk leukemi. I cellene 6-TG blir metabolisert til 6-TG nukleotid som er innlemmet i DNA i løpet av replikasjon. Etter sin innlemmelse i DNA 6-TG nucleotide gjennomgår S-metylering, aktivere mismatch reparasjon (MMR) og utløser dannelsen av DSB sin som krever HR for reparasjon [16]. I tillegg, 6-TG-avhengig akkumulering av reaktive oksygenforbindelser fører til oksydasjon av det inkorporerte 6-TG og til MMR-uavhengig dannelsen av inter-trådkryssbindinger (ICL) [17] som krever den kombinerte virkningen av Fanconi anemi ( FA) og HRR trasé for deres reparasjon [17,18]. Interessant, celler som ble resistente overfor PARPis på grunn av sekundære BRCA2-mutasjon var fortsatt følsomme for 6-TG [15]. Angivelig, til sekundære mutasjoner ikke gjør BRCA proteiner reparere MMR uavhengige lesjoner etter dannelsen av ICL [15,18]. Som det viste seg, har BRCA1 en unik rolle i FA-avhengige reparasjon av ICL, som ikke kan oppfylles av BRCA1 med en sekundær mutasjon som avskaffet følsomhet for PARPis [18]. Evnen til vorinostat å dramatisk redusere nivået av DNA-reparasjons proteiner inkludert som BRCA1 er egnet til å forsterke effekten av 6-TG ved å redusere både FA-avhengige og HR reparasjon. Også, verken vorinostat eller 6-TG er flere resistente (MDR) 1 substrater [7,15] og derfor deres samlede tiltak bør ikke bli berørt av en eventuell økning i nivået av MDR1. Endelig er vorinostat-indusert økning i fosforylering av eIF2α også forventes å bidra til inhibering av HRR [19] og dermed fører til forbedret cellulær respons overfor både PARPis og 6-TG.
Forsøkene som er presentert her viser at celler som reagerer dårlig på PARP-1 inhibitor-ABT- 888 -Bli følsomme for det i nærvær av vorinostat. Tilsvarende vorinostat forsterket responsen av kreftceller til 6-TG. Under våre eksperimentelle forhold den kombinerte behandlingen av vorinostat og ABT-888 viste bare en moderat effekt på nivået av BRCA1 og ingen på RAD51, men gjorde føre til økt fosforylering av eIF2α. Eksperimenter med den farmakologiske inhibitor av eIF2α defosforylering-salubrinal-så vel som med phosphomimetic S51D og de ikke-phosphorylatable S51A varianter av eIF2α viste at økt fosforylering av eIF2α -i seg selv-sensitizes kreftceller til ABT-888.
til slutt, den kombinerte behandlinger av vorinostat og ABT-888 eller vorinostat og seks-TG betydelig økt hemming av xenografttumorer vekst i forhold til hvert medikament alene uten å påvirke nyre- eller leverfunksjon eller forårsake noen betydelig vekttap.
Materialer og metoder
Cell kultur
menneskelig bryst MDA-MB-231, BT-549 og MCF-7 og menneskelig glioblastom U-87 kreftcellelinjer samt primære humane celler bryst var fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Dermal humane fibroblaster ble oppnådd ved skriftlig samtykke fra to givere (godkjent av Institutional Review Board ved Sheba Medical Center, protokoll # 7044). MDA-MB-231, MCF-7, ble BT-549 og U-87 godkjent av kort tandem repeat profilering.
vekstvilkår
MCF-7 celler ble dyrket i lav glukose Dulbecco modifisert eagle medium (DMEM), ble U87-celler dyrket i høy glukose DMEM, MDA-MB-231 og BT-549-celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640. cellelinje media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin fra biologisk Industries Kibbutz Beit-HaEmek, Il. Vekstmedium av BT-549 ble også supplert med 0,023 IU /ml humant rekombinant insulin (Sigma, St. Louis, MO.). Fibroblaster ble dyrket i høy glukose DMEM supplert med 20% FBS, penicillin-streptomycin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 0,2% β-merkaptoetanol (Invitrogen, Life Technologies Grand Island, NY). Primære normale humane bryst-celler ble dyrket i mammary epitelcelle basal medium inneholdende rekombinant humant insulin, og TGFa, L-glutamin, adrenalin, apo-transferrin, hypofyse-ekstrakt og hydrokortison hemisuccinat alt fra ATCC. For western blot-analyse av cellulære proteiner celler ble sådd ut ved en tetthet på 4 x 10
3 per cm
2 og legemidler ble tilsatt 48 timer etter utsåing fra stamløsninger i dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma, St. Louis MO). Kontrollene mottok bæreren. Konsentrasjonen av DMSO i vekstmediet ikke overstige 0,08%.
Drugs
Salubrinal var fra Calbiochem-Merck4Biosciences (Darmstadt, Tyskland), vorinostat fra LC laboratorier (Boston, MA), ABT -888 fra SelleckChem eller APExBIO (Houston, Texas), 6-TG fra Tocris biovitenskap (Bristol, UK) eller Sigma, (St. Louis, MO.), ble Z-VAD-FMK kjøpt fra APExBIO og senescence β-galaktosidase farging settet ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Boston, MA).
Colony overlevelse analyse
plating for kolonien overlevelse analyse, kolonitelling, og beregning av prosent klonogene død (CD) ble utført i tre paralleller som beskrevet tidligere [19-21]. Koloniene ble fiksert, farget og telte 10-14 dager etter plating, når 90-95% av koloniene i kontrollgruppen besatt mer enn 50 celler. Eksperimentelle kombinasjons indekser (KI) og simulerte de på ED50, ble ED75, ED90 og ED95 oppnås ved å benytte dataprogrammet CompuSyn ifølge Chou [21]. CI 0,9 indikerer synergistisk interaksjon. Primære bryst celler ikke danner kolonier. Cellene ble derfor platet ved en tetthet på 300 celler /cm
2 og de forskjellige medikamenter ble tilsatt en dag senere i ytterligere fem dager. Celledød ble bestemt ved trypan blå eksklusjon analysen ble utført in triplo og uttrykkes som prosent celledød (CD). Konsentrasjonene av stoffene som benyttes i vår koloni overlevelse analysen var på omfanget av plasma Cmax oppnådd i prekliniske studier med forsøksdyr [22,23] og i kliniske studier med human [24].
Western blot analyse
Klargjøring av cellelysatene og analyse av behandlingsinduserte endringer i proteinnivå og fosforylering ble gjort som vi beskrev før [19]. Proteininnholdet ble bestemt med en bicinchoninic syre-reagens (Bio-Rad, Hercules, CA), og lik belastning ble bekreftet ved å måle absorbansen ved 520 nm av Ponceau S (Sigma, St-Louis, MO) ble ekstrahert med fosfatbuffer (2,67 mM KCl, 1,47 mM KH
2PO
4, 8,1 mM Na
2HPO
4 og 1,125 M NaCl) fra individuelle strimler av et dobbelt løp [19,20]. Blottene ble eksponert for røntgenfilm for kjemiluminescens etter behandling med West Pico ECL-reagens (Thermo Scientific Rockford, IL). Verdier for integrerte lys tetthet av autoradiogrammene ble oppnådd med bilde J NIH programvare og ble anvendt for bestemmelse av behandlings-induserte endringer i proteinnivåer, og i forholdet av fosforylert eIF2α (p-eIF2α) til det totale nivå av proteinet. Kaninantistoffer som gjenkjenner enten p-eIF2α (# 9721) eller begge deler (# 9722) i fosforylert og ikke-fosforylert eIF2α, kanin anti-RAD51 (# D4B10), kanin-anti-53BP1 (# 4937), kanin-anti-PARP (# 46D11) og kanin monoklonale antistoffer mot c-IAP1, c-IAP2, survivin og XIAP (# 9770) var fra cellesignalisering Technologies (Boston, MA). Mus monoklonale antistoffer mot BRCA1 (klone D9 # sc-6954) og mot thioredoxin samspill protein (TXNIP) # sc-166234 var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Dallas, TX). Muse monoklonale antistoffer mot Poly (ADP) ribose (PADPR) (10H # ab14459) var fra abcamBiochemicals
® (Cambridge, UK).
Senescence-forbundet β-galaktosidase flekker
senescence β-galaktosidase flekker kit var fra celle signalisering Technologies og farging ble utført i henhold til produsentens instruksjoner.
Transfeksjon av celler med plasmider som koder for eIF2α varianter
heIF2α S51A og heIF2α S51D i pcDNA3.CD2 ble oppnådd fra Addgene (Cambridge, MA). Transient transfeksjon ble utført med JetPei (Polyplus, New York, New York) i henhold til produsentens instruksjoner som vi beskrev før [19]. Forsøk ble utført i tre paralleller i 6-brønners skåler, med 1,5 ug plasmid i 2 ml vekstmedium uten antibiotika i 24 timer før tilsetning av 0,5 ml medium, og fortsetter med den forsøksprotokoll.
tumorvekst i nakne mus
Alle dyrestudier ble gjennomført i henhold til forsøksprotokoll # 609/10 /ANIM som ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Sheba Medical Center. Cellene ble suspendert i en blanding av Matrigel (redusert vekstfaktor) (BD Biosciences, Bedford, MA) og RPMI (1: 1). Cellene (1,5 * 10
6 i 200 mL) ble injisert i lyskemelkefettpute av atymiske
nu
– /
nu
– hunnmus ( Harlan, Israel) som veier ~ 20 gr. Dyrene ble veid 1-2 ganger ukentlig, og tumorstørrelse ble målt 2-3 ganger ukentlig med en digital målepunktet. Tumor volum ble beregnet ved hjelp av formelen
V
= (
en
×
b
2) × 0,5, der
«a
« er større dimensjon og
«b
« normalen diameter. Eksperimenter inkludert syv mus per eksperimentelle gruppen når du tester den kombinerte effekten av vorinostat og seks-TG på tumorvekst og 10 mus per gruppe når du tester den kombinerte effekten av vorinostat og ABT-888. Bæreren var sammensatt av 40% PEG og 20% DMSO i 0,72% NaCl. Legemidler ble administrert daglig ved intraperitoneal injeksjon (i.p.) gjennom hele forsøket starter en eller to dager før celle inokulering og kontroller mottok bæreren. Injeksjonsvolumet var 250 pl. På grunn av skader forårsaket av injeksjoner, noen mus utviklet, innen 24 timer etter injeksjon, svært store hematomer på den injiserte side som var assosiert med tegn på stress (krum holdning og vanskeligheter i bevegelser). Disse musene ble avlivet av CO
2 kvelning. Deres antall i det eksperiment som testet effekten av kombinert vorinostat og ABT-888 behandling var som følger: C- (3 av 11), V (2 av 10), ABT-888 – (ingen), V og ABT -888 (2 av 11). Antall mus som døde på den samme måte i løpet av forsøket som testet effekten av kombinert vorinostat og 6-TG behandling var som følger: C- (ingen) V- (1 ut av 7) 6-TG- (1 ut av 7) V og 6-TG- (1 ut fra 7). Forsøk ble avsluttet ca fire uker etter oppstart når svulster begynte å vise tegn på nekrose. Mus ble avlivet ved CO
2 kveling og blodprøver ble tatt ved hjertepunktur. Fullstendig blodtelling sammen med lever og nyre funksjoner ble utført av A.M.L Veterinær Division, Herzlia, Il. Prøver fra indre organer ble fiksert i 4% bufret formalin og behandlet for hematoxylin og eosin (H E) og prøyssisk blå flekker
Statistisk analyse
In vitro-analyser for klonogene overlevelse. Betydningen av forskjeller mellom forsøksgruppene som behandles med to agenter og hver av gruppene fikk behandling med en agent eller kontrollene ble bekreftet med uparede Student
t
test.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Forsøk med naken mus:. ANOVA med repeterte målinger ble benyttet for å teste for betydningen av de observerte forskjellene i tumorvolumet mellom de ulike forsøksgrupper. Analysen inkluderte mus som overlevde gjennom eksperimentene. Tid innenfor faget faktor og V og ABT eller V og 6-TG mellom fag faktorer ble brukt. For å nærme seg normalfordeling, ble dataene analysert etter kvadratrot transformasjon. ANOVA med gjentatte målinger ble også anvendt for å demonstrere den manglende behandlings-induserte endringer i mus vekt.
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Vorinostat sensitizes kreftceller in vitro til behandling med ABT- 888
Det har blitt rapportert at vorinostat reduserer nivået av DNA-reparasjonsproteiner i kreft, men ikke i normale celler [8]. Vi har også observert at vorinostat førte til en doseavhengig reduksjon av BRCA1 og RAD51 nivå i MDA-MB-231 celler (S1 Fig). Resultatene bedt oss å teste effekten av vorinostat på følsomheten av kreftceller til PARPi-ABT-888.
Det har blitt rapportert at 5 mikrometer ABT-888 fører til ~ 90% reduksjon i klonogene overlevelse av MDA-MB-436 BRCA1 mutert brystkreft cellelinje [25]. I motsetning til dette, MDA-MB-231 som besitter villtype BRCA1 [26] reagerte dårlig på behandling med 7-10 uM ABT-888 (figur 1). Likevel inhibitoren var aktiv innenfor cellene som vist ved dets evne til å oppheve H
2o
2-indusert dannelse av poly (ADP) -ribose (figur 1b). Den triple negative BT-549 brystkreftcellelinje og den glioblastom U-87 var tilsvarende elastisk til ABT-888, mens den østrogenavhengige MCF-7 brystkreftcellelinjen var forholdsvis følsom for medikamentet. Ikke desto mindre, slik det fremgår av figur 1a, vorinostat-forsterket responsen av alle disse cellelinjene til ABT-888 og alle eksperimentelle og simulert CI indikerte at interaksjonen mellom vorinostat og ABT-888 er synergis (Fig 1a og S1 tabell). Under våre eksperimentelle forhold, ble normale humane fibroblaster og brystkreft celler knapt berørt av noen av disse stoffene eller deres kombinasjon.
a. Klonogene død som følge av kombinert behandling av vorinostat og ABT-888: kreftcellelinjer og fibroblaster ble sådd for klonogene overlevelsesanalyser og behandlet med vorinostat, ABT-888 eller begge deler. Verdier er midler klonogene død (CD) (%) av triplicates ± SEM. Bestemmelse av prosent celledød (CD) for normale bryst-celler ble utført ved trypan blå eksklusjon assay. Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater. Forskjeller mellom CD av kombinert behandling og hver av de eneste behandlinger eller kontrollene var signifikante. *
p
0,05, ** p 0,01. Kombinasjon indekser (KI) var 0.9. b. ABT-888 er aktiv i cellene: MDA-MB-231 celler ble inkubert over natten med 10 mm ABT-888 enn 15 min med 1 mM H2O2 før høsting og foredling for påvisning av poly (ADP-ribose) (PADPR) av western blot .
molekylære mekanismer som ligger til grunn for sensibiliserende virkning av vorinostat
Ved hjelp av forsøksbetingelsene avbildet i figur 1a vi bestemt nivå av DNA-reparasjon protein i celler behandlet med vorinostat, ABT-888 og deres kombinasjon. I motsetning til våre forventninger, har vi funnet at kombinasjonen av vorinostat og ABT-888 hadde bare en moderat effekt på nivået av BRCA1, redusere det ved ikke mer enn ~ 40%, mens nivået av RAD51 var upåvirket. Intriguingly, ble nivået av 53-BP1 økte med vorinostat, og ved ABT-888, og deres kombinasjon økt nivå av 53BP1 mer enn hvert medikament alene (figur 2a-2c). Den mulige implikasjon av økt nivå av 53BP1 i ansiktet av redusert nivå av BRCA1 for cellulær følsomhet for PARPis regnes i diskusjonen (fig 2).
Kombinert behandling av vorinostat og ABT-888 reduserte nivået av BRCA1 ved ~ 30% (a), påvirket ikke nivået av RAD51 (b), økt nivå av 53BP1 i forhold til kontroll ABT-888 eller vorinostat behandlede celler (c) og reduserte nivået av TXNIP (d). ABT-888 (10 uM), vorinostat (0,5 uM) og deres kombinasjoner ble tilsatt til cellene 48 timer etter utsåing. Cellene ble høstet 48 timer senere og behandlet for western blot analyse av endringer i nivåene av BRCA1, RAD51 og TXNIP. Tall på bunnen av autoradiogrammene indikerer endringer i forhold til kontroller i nivået av BRCA1, RAD51, TXNIP og lastet proteiner (ponceau). Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater. Unabridged bilder av autoradiogrammene som er presentert i panel (a) og (b) er vist i S2 Fig.
I fravær av en dramatisk virkning av den kombinerte behandling på nivå av BRCA1 eller RAD51 vi fastslått effekten av vorinostat, ABT-888 og deres kombinasjon på nivået av celle tioredoksin samspill protein (TXNIP). Det har blitt rapportert at før økt ekspresjon av TXNIP ligger til grunn for den differensielle virkningen av vorinostat på kreftceller [27]. Vi har også vist at høye konsentrasjoner av vorinostat førte til en doseavhengig økning av TXNIP i MDA-MB-231 celler (S1 Fig). Men under våre eksperimentelle betingelser kombinasjonen av vorinostat og ABT-888 som forbedret celledød gjentatte ganger ført til en reduksjon i stedet for en økning i nivået av TXNIP i MDA-MB-231 celler (figur 2d).
i tillegg til TXNIP, økt fosforylering av eIF2α er også vist, ved flere laboratorier inkludert våre, for å formidle den cytotoksiske effekt av vorinostat på kreftceller [19,28]. Vi undersøkte derfor nivået av eIF2α fosforylering i celler behandlet med både vorinostat og ABT-888 og fant at vorinostat ved konsentrasjoner som forbedret følsomhet til ABT-888, førte til en markert økning i eIF2α fosforylering, mens ABT-888 alene førte til bare en svak økning i fosforylering av proteinet. I celler behandlet med begge midlene nivået av fosforylert eIF2α var lik den som ble oppnådd med vorinostat alene. I motsetning til dette, den kombinerte virkningen av vorinostat og ABT-888 mislyktes i å øke nivået av fosforylert eIF2α i humane fibroblaster eller i humane normale bryst-celler (figur 3a).
a. Vorinostat øket eIF2α fosforylering i ABT-888 behandlede MDA-MB-231 celler, men ikke i ABT-888 behandlede fibroblaster og normale bryst celler: ABT-888 (10 uM), vorinostat (0,5 uM) og deres kombinasjoner ble tilsatt til cellene 48 timer etter plating. Cellene ble høstet 48 timer senere og behandlet for western blot-analyse av endringer i forholdet mellom p-eIF2α /eIF2α. Tall på bunnen av autoradiogrammene indikerer endringer i forhold til kontroll av p-eIF2α /eIF2α og lastet proteiner (ponceau). Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater. b. Salubrinal øker CD av MDA-MB-231-celler i respons til ABT-888: Cellene ble behandlet med salubrinal, ABT-888 eller begge deler. Verdier er midler CD (%) av triplicates ± SEM. Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater. Forskjeller mellom CD (%) av kombinert behandling, og hver av de eksperimentelle behandlinger eller kontroller var signifikant. **
p
0,01, *
p
0,05. CI var 0.9. c. En phosphomimetic eIF2α variant øker klonogene død i respons til ABT-888: The PARPi (10 uM) ble tilsatt til cellene 18 timer etter transfeksjon med 1.5μg /2 ml eIF2α S51A eller eIF2α S51D. Kolonier ble behandlet for analyse 10 dager etter behandlingsstart. Verdier er midler CD (%) av triplikatprøvene ± SEM. Eksperimentet ble gjengitt to ganger med lignende resultater. Forskjeller mellom hver av kontrollene og deres ABT-888 behandlede kolleger så vel som mellom ABT-888 behandlede S51A og S51D varianter var betydelig. SA-ikke-phosphorylatable S51A eIF2α, SD-phosphomimetic S51D eIF2α. d. Salubrinal øker eIF2α fosforylering og 53BP1 ekspresjon i ABT-888 behandlede celler uten å påvirke nivået av BRCA1 eller RAD51: ABT-888 (10 uM) og salubrinal (4,5 pM) ble tilsatt til cellene 48 timer etter utsåing. Cellene ble høstet 48 timer senere og behandlet for western blot-analyse av endringer i BRCA1, RAD51, 53BP1 og forholdet mellom p-eIF2α /eIF2α. Tall på bunnen av autoradiogrammene er endringer i forhold til kontroll av nivået av BRCA1, RAD51, 53P1, forholdet p-eIF2α /eIF2α og mengder av belastede proteiner (ponceau). Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater. e. Nivået av fosforylert eIF2α er høyere og nivået av total eIF2α er lavere i normal fibroblaster og brystkreft celler enn i kreftceller: Cellene ble høstet for western blot analyse fire dager etter utsåing. Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater. Tall på bunnen av autoradiogrammene indikerer endringer i forhold til kontroll av peIF2α /eIF2α og mengden lastet proteiner (ponceau). Eksperimentet ble gjengitt en gang med lignende resultater. Unabridged bilder av MDA autoradiogrammet i panel (a) i RAD51 og 53BP1 i panelet (d) og av autoradiogrammene i panelet (e) er presentert i S3 Fig.
For å finne ut om økt fosforylering av eIF2α i ABT-888 behandlede kreftceller bidrar til den sensibiliserende virkning av vorinostat, evaluerte vi virkningen av salubrinal-en inhibitor av eIF2α defosforylering-på følsomheten av cellene til ABT-888. Som det fremgår av figur 3b og i S2 tabell, salubrinal forbedret følsomhet av cellene til ABT-888, og lignende resultater ble oppnådd med phosphomimetic eIF2α varianten S51D (figur 3c). Etter avtale med dens effekt på følsomheten av kreftceller til ABT-888, salubrinal etterlignet effekten av vorinostat på økt fosforylering av eIF2α i ABT-888 behandlede celler og ligner på kombinasjonen av vorinostat og ABT-888, er kombinasjonen av salubrinal og ABT-888 ikke redusere nivået av RAD51. Men i motsetning til effekten av vorinostat, ble den sensibiliserende virkning av salubrinal oppnås uten i det hele tatt å påvirke nivået av BRCA1 (figur 3d). Interessant, effekten av salubrinal alene på nivå av 53BP1 var høyere enn det som ble sett med vorinostat eller ABT-888 alene, og i celler behandlet med både salubrinal og ABT-888 nivået 53BP1 var høyere enn den som ble observert i ABT-888 behandlede celler og lik som angitt i celler behandlet med salubrinal alene (figur 3d).
av notatet hos ubehandlede fibroblaster eller normale bryst-celler, nivået av total eIF2α var mye lavere, og nivået av fosforylert protein var mye høyere enn i det ubehandlede human brystcancer cellelinje MDA-MB-231 (figur 3e), noe som tyder på at normale celler kan være mer tolerante enn kreftceller til økt fosforylering av eIF2α.
Under våre eksperimentelle betingelser, det sensibiliserende virkning av vorinostat på den cellulære responsen til ABT-888 ble ikke påvirket av tilstedeværelsen av pan-kaspaseinhibitor-Z-VAD-FMK (S4 fig). En caspase-uavhengig virkning av vorinostat på celle overlevelse er vist før av Xu et al. [29]. Merkelig nok, z-VAD-FMK alene førte til en doseavhengig reduksjon i celleoverlevelse-et fenomen som har vært observert før i forskjellige cellesystemer [30-32].
Relativt høye konsentrasjoner av vorinostat (5 -10 bretter høyere enn de som er anvendt i våre studier) har vist seg å dramatisk redusere nivået av inhibitoren av apoptose protein (IAP) familien, for eksempel c-IAP1, c-IAP2, XIAP og survivin [29]. Vi undersøkte derfor effekten av vorinostat og som av den kombinerte behandling av vorinostat og ABT-888 i mengden av slike proteiner (S5 Fig). Under våre forsøksbetingelser, ble vorinostat ikke påvirke nivået av c-IAP1, Survivin og XIAP. Også, ABT-888 ikke påvirke nivået av disse proteinene. Nivået av c-IAP2 ble redusert med vorinostat behandling, men ble øket med ABT-888. Likevel, i henhold til våre eksperimentelle forhold, kombinert behandling ikke å påvirke nivået av disse IAP.
Den kombinerte behandlingen av vorinostat og ABT-888 ble imidlertid assosiert med en økt utseende forstørrede flate senescent jakt celler som farget for β-galaktosidase-aktivitet (S6 fig). Også her har en lignende effekt av vorinostat blitt rapportert tidligere av Xu et al. [33].
Interessant, lik den behandling med vorinostat og ABT-888, behandling med salubrinal og ABT-888 resulterte i en økt inntrykk av senescent ser celler som farget for β-galaktosidase (S6 Fig). Også, som vorinostat, salubrinal ikke påvirke nivået av c-IAP1, Survivin og XIAP men førte til et redusert nivå av c-IAP2, og som vorinostat og ABT-888, kombinert behandling av salubrinal og ABT-888 ikke påvirke nivået av disse IAP (S5 figur).
Økt hemming av tumor xenograft vekst i mus behandlet med både vorinostat og ABT-888
effekten av vorinostat på følsomheten av MDA-MB-231 til ABT-888 ble gjengitt in vivo. Kombinert behandling av vorinostat og ABT-888 førte til en signifikant inhibering av tumorveksten i forhold til hver behandling alene (figur 4a). De ulike behandlinger ikke føre til en betydelig effekt på kroppsvekt (Fig 4b) og synes ikke å påvirke fullstendig blodtelling, lever- eller nyrefunksjon (S3 og S4 tabeller). H E farging av seksjoner fra indre organ ikke viste behandlings-induserte endringer i hjerte, lever, nyre og lungene. b. c. b. b. c. b.
