Abstract
KRAS
proto-onkogen spiller en nøkkelrolle i utviklingen av mange humane svulster og er vanligvis aktivert ved somatisk mutasjon eller signalisering gjennom spesifikke vekstfaktorreseptorer. Imidlertid har ikke blitt definert samspillet mellom mikro-miljø og K-ras aktivitet. Hypoksi alltid utvikler seg som svulster vokser deres tilførsel av oksygen. En serie av velorganisert cellulære tilpasninger forekomme som stimulerer angiogenese og forbedre overlevelse av tumoren i hypoksiske forhold. Våre tidligere studier vist at mutant
KRAS
alleler kan samhandle med hypoksi å indusere vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) i tykktarmskreft. Vi ønsket å finne ut om lignende hypoksiske svarene er også til stede i tumorer uten
KRAS
mutasjon. Hypoksi gående økte nivå av aktiverte, GTP-bundet K-ras i tykktarmskreftcellelinjer med en vill-type
KRAS
-genet, og dette avhang aktivering av c-Src. Inhibering av c-Src ved PP2 behandling eller siRNA knockdown blokkert den hypoksiske aktivering av K-ras. Denne aktivering av K-ras ikke være avhengig av EGFR og resulterte i fosforylering av Akt og induksjon av VEGF ekspresjon. I tillegg aktivering av K-ras vesentlig blokkert apoptose i hypoksiske forhold. Disse studiene viser en unik adaptiv mekanisme i hypoksi som aktiverer K-ras signalering i fravær av en mutant
KRAS
onkogen
Citation. Zeng M, Kikuchi H, Pino MS, Chung DC ( 2010) Hypoksi Aktiverer K-Ras Proto Oncogene stimulere Angiogenese og hemme apoptose i Colon kreftceller. PLoS ONE 5 (6): e10966. doi: 10,1371 /journal.pone.0010966
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 27 april 2010; Godkjent: 12 mai 2010; Publisert: 04.06.2010
Copyright: © 2010 Zeng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health stipend CA92594; Kate J. og Dorothy L. Clapp Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utviklingen av vevshypoksi er karakteristisk observert som ondartede svulster raskt øke i størrelse. Slike hypoksiske betingelser utøve seleksjonstrykk på kreftceller, og evnen av tumorceller til å overleve i et hypoksisk mikromiljøet har vært assosiert med en dårlig prognose og resistens overfor terapi [1]. Et av de mest kritiske og mest karakteriserte responser til hypoksi er induksjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) er en godt etablert mediator av denne prosessen. Imidlertid har tidligere studier vist at HIF-uavhengige mekanismer kan også indusere VEGF i hypoksi, og onkogene K-ras spiller en nøkkelrolle i denne prosessen [2], [3], [4].
K- ras er en liten GTPase som sykluser mellom inaktive guanosin difosfat (BNP) -bundet og aktiv guanosin trifosfat (GTP) -bundet conformations (Ras-BNP og henholdsvis Ras-GTP,) [5]. Det fungerer som et signal bryter molekyl som par reseptor aktivering av spesifikke vekstfaktorer med nedstrøms effektor trasé inkludert Ras-MEK-ERK og fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt kaskader som kontrollerer flere cellulære responser. Onkogene mutasjoner i
KRAS
svekke evnen til K-Ras å hydrolysere bundet GTP i en vekstfaktor-uavhengig måte, og konstituerende signalering gjennom disse effektor trasé resultater. Svulsten mikromiljøet kan ha stor innflytelse på mobilnettet atferd, og hypoksi har vist seg å samhandle med mange onkogene signalveier. Spesielt hypoksisk aktivering av PI3K-Akt, MEK-ERK, NF-kB, og hypoksi-induserbar faktor (HIF) signalveier har blitt beskrevet [6], [7]. Selv om K-ras er en sentral regulator i alle disse banene, er det ukjent om K-ras i seg selv er spesielt aktiveres ved hypoksi. Tidligere studier har vist en sterk synergistisk interaksjon mellom hypoksi og muterte K-ras i reguleringen av flere mål-gener, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), IL-8, og osteopontin [2], [8], [9]. Men færre enn 50% av tykktarmskreft havn
KRAS
mutasjoner, og forholdet mellom Ras signalering og hypoksi i tumorer med villtype
KRAS
forblir udefinert.
søkt å bestemme hvilken rolle K-ras i hypoksisk mikro-miljø i tykktarmskreft, en svulst type som ofte havner
KRAS
mutasjoner. Vill-type K-ras ble sterkt aktivert ved hypoksi, og c-Src var nødvendig for denne hypoksisk aktivering av K-ras. Dette resulterte i fosforylering av Akt og induksjon av VEGF ekspresjon. I tillegg hypoksisk aktivering av vill-type K-ras blokkerte apoptose. Sammen er disse funnene markere en ny mekanisme for hypoksisk aktivering av onkogene overlevelses trasé i fravær av en onkogen mutasjon.
Resultater
hypoksisk aktivering av K-Ras i tykktarm kreft celler
for å finne ut om hypoksi aktiverer Ras, vi målte GTP-bundet Ras i normoksiske og hypoksiske forhold i et panel av tykktarmskreft cellelinjer. Nivåer av GTP-bundet Ras var knapt synlig i Caco2, HT29, Colo320DM og Colo205 celler i normoksisk forhold (Fig. 1a). Alle disse linjer har en villtype
KRAS
genet. Imidlertid, når disse cellene ble inkubert i hypoksiske betingelser (1% O
2), var det en dramatisk økning (3-6,8 ganger) i nivåene av aktivert Ras (Fig. 1A). I motsetning til de basale aktiviteter Ras i DLD1, HCT116 (både heterozygot for
KRAS
D13
mutasjon), og SW480 (homozygote for
KRAS
V12
mutasjon) cellene i normoxia var høy, og det var ingen etterfølgende økning i hypoksi (fig. 1A, høyre panel). SW480 celler hadde de sterkeste nivåene av Ras aktivering i normoksisk forhold. Hypoksi er dermed en sterk aktivator av Ras i tykktarm kreft celler, men dette induksjon ble kun observert i disse cellene med en vill-type
KRAS
genet.
Nivåene av GTP-bundet Ras ( A) og GTP-bundet K-ras (B) ble evaluert i villtype (venstre panel) og mutant (høyre panel)
KRAS
cellelinjer dyrket enten i normoksiske (N) eller hypoksiske (H) betingelser i 4 timer. To milligram celleekstrakter ble anvendt for en Ras-aktivering assay, etterfulgt av Western blotting med de angitte antistoffer. Tetthetsverdiene er uttrykt som gangers endring i forhold til kontrollverdiene normalisert til 1. C, Caco2-celler ble dyrket i DMEM med pH justert til 7,5 eller 6,5 til 4 timer. Cellelysater ble anvendt for en Ras-aktivering assay fulgt av Western blotting med et Ras-GTP spesifikt antistoff. Densitometry verdiene er uttrykt som ganger endring sammenlignet med kontrollverdiene normalisert til 1.
For å kontrollere at K-ras isoform ble aktivert av hypoksi, en K-ras spesifikt antistoff ble benyttet. Som illustrert i figur 1B, ble nivåer av GTP bundet-K-ras indusert av hypoksi i tykktarm kreft celler med vill-type
KRAS plakater (Caco2, HT29), mens det var ingen endringer i cellelinjer med en mutant
KRAS
onkogen (DLD1, HCT116, SW480). En rolle for N-ras i reguleringen av apoptose er blitt foreslått i tykktarmskreft, men en N-ras-spesifikke antistoff ikke klarte å påvise GTP-bundet-N-ras i Caco2, DLD1, og HCT116-cellelinjer i enten normoksisk eller hypoksiske betingelser (fig. S1) [10].
Tumor hypoksi er ofte ledsaget av en bryter til anaerob glykolyse og en lavere pH-verdi, slik at vi undersøkt hvorvidt den hypoksiske regulering av Ras-aktiviteten ble mediert gjennom endringer i pH. Inkubasjon av Caco2-celler i sure betingelser (pH 6,5) i 4 timer økte ikke aktiviteten av Ras, noe som tyder på at forandringer i pH ikke regulere nivåene av GTP-bundet Ras (Fig. 1C).
Oppregulering av Ras aktivitet ved hypoksi krever c-Src
c-Src ligger oppstrøms av K-ras, og vi neste søkt å undersøke om c-Src aktiveres også ved hypoksi. En tidsavhengig aktivering av c-Src, målt ved fosforylering ved Tyr
416, ble observert i både Caco2 og HT29-celler etter inkubasjon i hypoksiske betingelser (Fig. 2A). For å bestemme om c-Src-aktivitet bidrar til aktivering av Ras ved hypoksi, forbehandlet vi Caco2-celler med PP2, en potent og selektiv Src tyrosinkinase inhibitor. En 50% reduksjon i hypoksisk induksjon av Ras ble påvist i Caco2-celler, mens det ikke var noen effekt på nivåene av total Ras (fig. 2B, venstre panel). Denne effekten var doseavhengig, med en maksimal virkning observert ved 20 uM (data ikke vist).
A, Caco2 og HT29-celler ble inkubert i hypoksiske betingelser for de angitte tider og Western blotting for fosfo-Src
416 og total Src ble utført. β-aktin bekreftet lik belastning. Densitometry verdiene er uttrykt som ganger endring sammenlignet med kontrollverdiene normalisert til 1. B, ble Caco2 celler forbehandlet med Src inhibitor PP2 (20 mm) eller DMSO i 1 time (venstre panel), eller transient transfektert med c-Src spesifikke siRNA konstruksjoner eller et ikke-målretting styre (høyre panel), før inkubering i hypoksisk eller normoksisk betingelser i 4 timer. Aktivert Ras ble revet og SDS-PAGE ble utført ved hjelp av en Ras-GTP spesifikt antistoff. Total Ras bekreftet lik belastning. Tetthetsverdiene er uttrykt som gangers endring i forhold til kontrollverdiene normalisert til 1. C, ble lysater av Caco2pEVX og Caco2SrcY527F cellene immunfarget for p-Src
416 og total Src og også anvendt for en Ras aktiveringstest. Tetthetsverdiene for Ras-GTP er uttrykt som gangers endring i forhold til kontrollverdiene normalisert til 1. D, venstre panel, Styre celler og celler forbehandlet med NAC (20 mM) i 20 minutter ble eksponert i 10 minutter for å H
2O
2 (5 mm). Lysates ble deretter immunoblottet for p-Src
416 og total Src. β-aktin bekreftet lik belastning. Midtre og høyre paneler, Kontroll Caco2 celler og celler forbehandlet med NAC (20 mm) for en time ble inkubert i hypoksi i 4 timer. Western blotting for fosfor-Src
416 (i midten panel) og en Ras aktivere assay (høyre panel) ble deretter utført. Tetthetsverdiene er uttrykt som gangers endring i forhold til kontrollverdiene normalisert til 1. E, ble lysater av kontroll Caco2-celler og celler inkubert i hypoksi i de angitte tidsrom underkastet Western blotting for å påvise p-EGFR (Tyr
1068) og total EGFR protein nivåer. Behandling med EGF (100 ng /ml) fungerte som en positiv kontroll.
For å vurdere rollen til c-Src mer direkte, vi slått ned endogen c-Src i Caco2 celler via RNA interferens. Knock-down av c-Src førte til en 33% reduksjon i hypoksisk aktivering av GTP-bundet Ras (fig. 2B, høyre panel). Videre Caco2-celler som uttrykker en konstitutivt aktiv c-Src-vektor (SrcY527F) oppviste en 70% økning i nivået av GTP-bundet Ras (fig. 2C) sammenlignet med tom vektor (pEVX). Western blotting bekreftet K-ras isoform ble aktivert ved ekspresjon av Src (fig. S2).
reaktive oksygenforbindelser (ROS) som genereres av hypoksi har tidligere vist seg å aktivere Src. Eksogene administrasjon av H
2o
2 (5 mm) potent indusert fosforylering av Src ved Tyr
416 i Caco2 celler (Fig. 2D, venstre panel). Denne effekten ble signifikant redusert med NAC (20 mM), en antioksidant som hemmer ROS. Vi ønsket å finne ut om NAC kunne blokkere hypoksisk aktivering av endogen Src og Ras. NAC behandling redusert induksjon av p-Src
416 i hypoksi med ca 30% med en ledsagende 17% reduksjon av GTP-bundet Ras (fig. 2D). Disse funnene tyder på at generasjonen av ROS kan delvis bidra til hypoksisk aktivering av c-Src i tykktarm kreft celler.
Nye rapporter har antydet at hypoksi kan øke nivåene av EGFR og at fosforylering av EGFR kan være et mellomtrinn i signalerings fra Src til RAS [11], [12]. For å avgjøre om EGFR kan spille en slik rolle, målte vi totalt EGFR og fosfo-EGFR nivåer i Caco2 celler inkubert i hypoksi. Det var en liten økning i den totale EGFR i hypoksi. Det var imidlertid ingen økning i EGFR fosforylering ved Tyr
1068 (Fig. 2E). Samlet viser dataene tyder på at oppregulering av c-Src-aktivitet ved hypoksi medieres delvis gjennom ROS men at aktivering av K-Ras av c-Src i hypoksi er ikke avhengig av EGFR.
Aktivering av Akt ved hypoksi er nedstrøms c-Src og K-ras
neste søkt å finne ut hvilke nedstrøms effektor trasé ble aktivert av c-Src og K-ras i hypoksi. Eksponering for hypoksiske tilstander som er indusert fosforylering av Akt ved Ser
473 i begge Caco2 og HT29-celler, mens ingen aktivering av ERK ble påvist under de samme betingelser (fig. 3A). Akt ble aktivert i en tidsavhengig måte og nådde et maksimalt nivå ved 12 timer. For å avgjøre om Src var involvert i hypoksisk aktiveringen av Akt, forbehandlet vi Caco2 celler med bestemte Src inhibitor PP2 i 12 timer før eksponering for hypoksi. Som vist i figur 3B, ble den hypoksiske aktivering av Akt redusert ved PP2 behandling på en doseavhengig måte. I samsvar med disse funnene, slå ned på c-Src også fullstendig blokkert hypoksisk aktiveringen av Akt i forhold til celler transfektert med en kontroll siRNA (Fig. 3C).
A, Protein utdrag fra Caco2 og HT29 celler dyrket i normoksisk eller hypoksiske betingelser for de angitte tider ble utsatt for immunblotting for fosfo-Akt og fosfo-ERK1 /2. Blottene ble deretter strippet og reprobed med antistoffer mot total Akt og total ERK. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Densitometry verdier for p-Akt er uttrykt som gangers endring i forhold til kontrollverdiene normalisert til 1. B, ble Caco2-celler inkubert i 1 time med PP2 ved de konsentrasjoner som er angitt, før de overføres til normoksisk eller hypoksiske betingelser i 12 timer. Western blotting ble utført for å bestemme nivåene av fosfo-Akt, total Akt, fosfo-Src
416, og total Src. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Densitometry verdiene er uttrykt som ganger endring sammenlignet med kontrollverdiene normalisert til 1. C, ble Caco2 celler transfektert med kontroll siRNA, K-ras siRNA eller c-Src siRNA oligonukleotidene (hver på 20 nM) før eksponering for normoksiske (N) eller hypoksisk (H) betingelser i 12 timer. Immunoblotting med de angitte antistoffer ble deretter utført. Densitometry verdier for p-Akt er uttrykt som ganger endring sammenlignet med kontrollverdiene normalisert til 1. D, ble Caco2 celler som stabilt overuttrykker K-rasV12 (Caco2pCSGWK-ras V12) transfektert med c-Src siRNA oligos. Førti-åtte timer senere ble cellene inkubert i hypoksi eller normoxia i 12 timer og Western blotting med de angitte antistoffer ble deretter utført. Densitometry verdier for p-AKT er uttrykt som gangers endring i forhold til kontrollverdiene normalisert til 1.
Fordi Akt er kjent for å være nedstrøms av K-ras, testet vi om Akt er også et mål for spesifikk K-ras i henhold hypoksiske forhold ved å benytte K-ras siRNA oligos. Stanse av K-ras redusert nivåene av Akt i hypoksi sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (Fig. 3C). Disse data indikerer at hypoksisk aktivering av Akt er mediert gjennom både Src og K-ras. Ingen endringer i fosfor-Src
416 og total Src proteinnivåene ble observert når K-ras ble stille (Fig. 3 C), noe som indikerer at Src er faktisk oppstrøms K-ras i dette hypoksisk signalveien.
for å uavhengig bekrefte at K-ras var nedstrøms Src i denne hypoksi-indusert fosforylering av Akt, vi utførte eksperimenter i en Caco2 cellelinje som stabilt uttrykker mutant onkogen
KRAS
V12 plakater (Caco2 /pCSGWK- rasV12). Den hypoksisk induksjon av p-Akt ble ikke blokkert av kneble av c-Src med siRNA (Fig. 3D). Disse funnene indikerer at c-Src funksjoner oppstrøms K-ras i hypoksisk aktiveringen av Akt.
K-ras og Src megle motstand mot apoptose i hypoksi
Akt spiller en sentral rolle i å regulere apoptose og cellesyklusprogresjon. Siden Akt er en nedstrøms mål av K-ras i dette hypoksi-utløst intracellulær signalveien, forsøkte vi å finne ut om lyddemping av K-ras vil påvirke celle overlevelse. Knock-down av K-ras redusert celleviabilitet selv i normoksisk forhold med 20% i HCT116 cellene, men det var ingen signifikante endringer i DLD1 eller Caco2 celler. I motsetning til K-ras knockdown i hypoksiske forhold redusert celletall i mye større grad: en 40% reduksjon i HCT116 (
P
0,05) og 50% reduksjon i DLD1 og Caco2 celler (
P
0,01) ble observert (figur 4A).. Stanse av K-ras i Caco2 celler resulterte i en overlevelsesrate på hypoksi sammenlignes DLD1 og HCT116-celler som havn en mutant
KRAS
genet, noe som tyder på at villtype K-ras protein spiller også en viktig rolle i den adaptive mekanisme i hypoksi.
A, DLD1, HCT116 og Caco2-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller K-ras siRNA, og deretter inkubert i hypoksi i 48 timer. Celleantall ble bestemt ved bruk av et hemacytometer etter farging med trypanblått, og resultatene er uttrykt som prosent av levedyktige celler sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler i normoxia. Dataene er fra tre uavhengige forsøk og er vist som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01. B, Colo320DM celler dyrket på sterile dekkglass ble transfektert med siRNA kontroll oligoene (vist i øverste p) eller siRNA oligoer i K-ras (som er vist i de nederste radene) i 24 timer, etterfulgt av inkubering i hypoksi i 48 timer. Tidlig apoptotisk (FITC + PI-) og sen apoptotiske /nekrotiske celler (FITC + PI +) ble oppdaget. Venstre paneler: 20x fase kontrast og 20x fluorescens grønn og rød kanal fusjonert bilder. Høyre panel: 20x og 40x fluorescens grønn og rød kanal fusjonert bilder. C, Caco2-celler ble transfektert med K-ras siRNA eller kontrollere siRNA, og deretter inkubert i normoxia eller hypoksi i 48 timer. Celledød ble bestemt ved FACS som beskrevet i Materialer og Metoder. D, Early apoptotisk (Annexin V + PI-) og sen apoptotiske /nekrotiske (Annexin V + PI +) celler ble bestemt ved FACS-analyse. Mean ± SD av tre uavhengige eksperimenter er vist. *, P 0,05. **, P 0,01. E, DLD1, HCT116 og Caco2-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller c-Src siRNA oligoer (20 nM) i 24 timer og deretter utsatt for hypoksi i 48 timer. Celler unntatt trypan blått ble tellet, og resultatene er uttrykt som prosent av levedyktige celler sammenlignet med kontroll siRNA transfekterte celler i normoxia. Mean ± SD av tre uavhengige eksperimenter er vist. *, P 0,05. **, P . 0,01
Vi merkede celler med FITC-konjugert annexin V og propidiumjodid (PI) til å måle utbredelsen av apoptose. En annen vill-type
KRAS
cellelinje, Colo320DM, ble studert fordi dens vekstmønster som enkeltceller tillater visualisering av apoptotisk membran endrer tydeligere. Stanse av K-ras resulterte i endringer i cellemorfologi, inkludert blebbing, krymping, og atom fragmentering, samt redusert feste til vevskulturskål og økt flytende. Stanse av K-ras også økt antall Annexin V positive celler sammenlignet med (Fig. 4B) kontroll siRNA. For å kvantifisere anti-apoptotiske effekter av K-ras i hypoksi, analyserte vi apoptotiske celle populasjoner av flowcytometri (FACS). Caco2 celler transfektert med enten en ikke rettet mot kontroll eller K-ras siRNA oligonukleotider ble inkubert i normoxia eller hypoksi i 48 timer. Celler uten noen behandling tjente som en negativ kontroll, og celler eksponert for UV-lys i 10 minutter, og dyrket med TNF-α og Cycloheximide (CHX) tjente som en positiv kontroll (Fig. 4C, venstre panel). Et histogram av Annexin V-FITC positive celler viste at knock-down av K-ras i normoxia ikke vesentlig endre priser av apoptose. Men under hypoksiske betingelser, tap av K-ras betydelig økt forekomst av celledød fra 22% til 57% sammenlignet med kontroll siRNA behandling (Fig. 4C, midtre og høyre panel). Vi videre analysert apoptotiske celler som to subpopulasjoner: tidlige apoptotiske celler (Annexin V +, PI-) og sene apoptotiske /nekrotiske celler (Annexin V +, PI +). Bare når K-ras ble slått-down under hypoksiske betingelser var en signifikant induksjon av apoptose observert ved FACS analyse; det var en 1,3 ganger økning i antall tidlige apoptotiske celler (
P
0,05) og 2,0 ganger økning i antall sene apoptotiske celler (
P
0,01) når sammenlignet med kontroll siRNA i hypoksi (fig. 4D). Disse studiene viser at K-ras kan hemme apoptose i hypoksi.
Våre data antydet at Src kan også regulere overlevelse trasé som blokkerer apoptose i hypoksi. Vi definert forholdet mellom Src og celleoverlevelse direkte ved telling av levedyktige celler som ekskluderte trypanblått. Knock-down av Src i DLD1 og HCT116-celler forandret ikke celleoverlevelse i normoxia (1% og 9% reduksjon i celletall, henholdsvis), mens det i hypoksi, celletellinger ble redusert med 36% og 45%, henholdsvis (fig. 4E ). Tilsvarende knockdown av c-Src i Caco2-celler redusert celletellinger med 20% i normoxia sammenlignet med en mer signifikant 58% reduksjon av hypoksi. Derfor aktivering av K-ras eller Src henhold hypoksiske forhold øker overlevelsen av tykktarmskreftceller.
hypoksisk regulering av VEGF med K-ras
Hypoksi er også en potent stimulus for angiogenese gjennom induksjon av VEGF. Vi har tidligere vist at hypoksi og onkogene K-ras kan synergi up-regulere VEGF [2]. Mens slike undersøkelser gir uvurderlig innsikt i onkogene K-ras-funksjon, har de ikke gir innsikt i mekanismene som tykktarm kreft celler med vill-type
KRAS
kan utnytte. Vi har derfor hemmet endogent villtype
KRAS
i Caco2 celler med siRNA oligos å definere forholdet mellom K-ras-aktivering og VEGF produksjon. I Caco2-celler transfektert med en kontroll siRNA, hypoksi øket VEGF-mRNA-nivåer 4,9 ganger. Knockdown av K-ras resulterte i en reduksjon av VEGF-mRNA-ekspresjon ved 60% og 76% i normoksisk og hypoksiske tilstander, henholdsvis, sammenlignet med celler transfektert med en styre siRNA (Fig. 5A). Vi neste brukte en VEGF-promoter reporter-konstruksjonen (fig. 5B). Hypoksiske forhold indusert VEGF promoter aktivitet med 2,2 ganger. I samsvar med våre QRT-PCR resultater, tie av K-ras dramatisk redusert hypoksisk induksjon av VEGF promoter aktivitet med 72%. I normoxia, var det en 38% reduksjon i VEGF promoter aktivitet etter K-ras stanse. Denne reduksjonen i VEGF-promoteren aktivitet korrelert med de endringer som sett i K-ras-aktivering. Til slutt, en ELISA-analyse viste at utskilt VEGF protein nivåer var oppregulert 2,6 ganger ved hypoksi. Knockdown av villtype
KRAS
i Caco2 cellene redusert VEGF protein nivåer med bare 8% i normoxia men redusert VEGF protein nivåer mer betydelig i hypoksi med 51% (Fig. 5C). Disse resultater antyder at et villtype-
KRAS
genet er også en viktig regulator av VEGF i hypoksiske forhold.
A, Relative mRNA-nivåer av VEGF, som evaluert ved kvantitativ RT-PCR, i Caco2-celler transfektert med en K-ras-spesifikke siRNA konstruere eller et ikke-målretting kontroll og utsatt for normoxia eller hypoksi. Dataene er uttrykt som ganger endring i forhold til kontrollceller siRNA i normoxia, normalisert til 1. Columns, gjennomsnitt av minst tre forsøk; barer, SEM. *, P 0,05 sammenlignet med kontrollceller. B, Caco2 celler ble transient transfektert med enten siRNA rettet mot endogene K-ras eller ikke targeting kontroll siRNA. Etter 24 timer ble en 2,3 kb VEGF-luciferase reporter-konstruksjonen ble ko-transfektert med PRL-CMV og cellene ble inkubert i normoxia eller hypoksi i ytterligere 24 timer. Dataene er uttrykt som ganger endring i forhold til kontrollceller siRNA i normoxia, normalisert til 1. Columns, gjennomsnitt av minst tre forsøk; barer, SEM. *, P 0,05 sammenlignet med kontrollceller. C, Supernatant fra celler i (A) ble oppsamlet, og en ELISA for VEGF ble utført. Dataene er uttrykt som ganger endring i forhold til kontrollceller siRNA i normoxia, normalisert til 1. Columns, gjennomsnitt av minst tre forsøk; barer, SEM. *, P . 0,05 sammenlignet med kontrollceller
hypoksisk induksjon av VEGF er også Src avhengig
Selv om tidligere bevis har indikert at c-Src signaltransduksjonsveier kan regulere VEGF uttrykk, forholdet mellom aktivering av Src ved hypoksi og produksjon av VEGF i kolon kreftceller er ennå ikke avklart. Snarere enn overekspresjon v-Src, blokkerte vi endogen c-Src med PP2. PP2 behandling i 24 timer i Caco2-celler undertrykkes VEGF-mRNA-nivåer med 87% i hypoksi sammenlignet med en reduksjon på 60% normoxia (Fig. 6A). PP2 undertrykkes også VEGF-promoter-aktivitet med 85% i hypoksi sammenlignet med en 50% reduksjon i normoxia (fig. 6B).
A og C, Relative mRNA-nivåer av VEGF, som evaluert ved kvantitativ RT-PCR, i Caco2 og HT29-celler forbehandlet med 10 uM PP2 (A) eller transient transfektert med en Src-spesifikk siRNA-konstruksjon (C), og utsatt for normoxia eller hypoksi i 24 timer. Dataene er uttrykt som ganger endring sammenlignet med kontrollceller i normoxia, normalisert til 1. *, P 0,05. B og D, VEGF-luciferase reporter-analyser av Caco2 og HT29-celler, forhåndsbehandlet med 10 uM PP2 (B) eller transient transfektert med en Src-spesifikk siRNA-konstruksjon (D), og utsatt for normoxia eller hypoksi i 24 timer. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter utført i duplikat, og er presentert som gangers endring sammenlignet med kontrollceller i normoxia normalisert til 1. Data er vist som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05. **, P . 0,01
Hvis du vil kontrollere den spesifikke rollen c-Src i hypoksisk induksjon av VEGF, benyttet vi Src siRNA oligos. Med denne tilnærmingen, mRNA-nivåer av VEGF var uforandret i normoksisk betingelser, men redusert med 39% i hypoksi (fig. 6C), og VEGF-promoter-aktivitet ble redusert 56% sammenlignet med en nedgang i normoxia 33% (fig. 6D). For å bekrefte denne effekten var ikke unikt for Caco2 celler, HT29 celler ble også analysert. Behandling med PP2 eller Src siRNA oligos i HT29 celler under normoksisk forholdene hadde ubetydelige virkninger på VEGF mRNA eller promoter aktivitet. I motsetning til dette under hypoksiske betingelser, PP2 trykkes VEGF-mRNA-nivåer og promoter-aktivitet ved 67% og 53%, respektivt (figur 6A og 6B, høyre panel.); på samme måte, c-Src siRNA oligoer redusert VEGF-mRNA-nivåer og promoter-aktivitet med 37% og 76% i hypoksi, henholdsvis (fig. 6C og 6D, høyre panel). Sammen er disse resultatene også implisere c-Src som en kritisk regulator av VEGF i hypoksi.
Diskusjoner
Hypoksi er en uunngåelig konsekvens av rask svulst vekst som overgår den eksisterende blodtilførsel. En nøye orkestrert sett adaptive responser sikrer overlevelse av tumorcelle i disse hypoksiske forhold. Den HIF-1 transkripsjonsfaktor er kjent for å spille en rolle i denne hypoksisk reaksjon [13], [14], [15]. Vi ønsket å finne ut om flere onkogene veier kan forsterke disse tilpasninger. I tykktarmskreft, har tidligere studier vist synergistisk interaksjon mellom
KRAS
mutasjoner og hypoksi i reguleringen av flere gener inkludert VEGF [2], [8], [9]. Men
KRAS
mutasjoner er identifisert i mindre enn halvparten av alle tykktarm kreft, og rollen til villtype
KRAS
i hypoksisk respons er mindre sikkert. Så vidt vi vet, er dette den første demonstrasjonen av hypoksisk aktivering av K-ras i tykktarmskreft.
Våre data viser at hypoksi er en potent aktivator av villtype K-Ras i tykktarm kreft celler. Aktivering av K-ras resulterte i nedstrøms aktivering av Akt, induksjon av VEGF, og inhibering av apoptose. Disse effekter på angiogenese, så vel som apoptose begge er kritiske for tumor overlevelse under forhold med vedvarende hypoksi. Rekrutteringen av Akt veien er konsistent med tidligere rapporter om hypoksisk signale av muterte K-ras i reguleringen av OPN genekspresjon [9]. K-ras kan aktivere hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1) til og protein fosforylering, og noen av de observerte virkninger på induksjon av VEGF kan potensielt være mediert gjennom HIF-1 [16]. Det er imidlertid lite sannsynlig at HIF-1 er den eneste formidler av denne prosessen, som K-ras kan også regulere VEGF gjennom HIF-1 uavhengige baner i hypoksi [17].
Aktivering av K-ras i hypoksi avhang oppstrøms aktivering av c-Src. Det er et presedens for den hypoksiske aktivering av Src, som er blitt demonstrert både
in vivo
og
in vitro
i andre celletyper [18]. Det finnes en rekke spesifikke mediatorer som kobler Src til K-ras, og en rolle for aktivering av EGFR er godt beskrevet [11], [19], [20]. Til tross for sin etablert kobling til colonic tumorgenese, betyr EGFR ikke spiller en rolle i den hypoksiske aktivering av K-ras.
Cellulære responser til hypoksi søke å bevare overlevelsen i et fiendtlig mikromiljøet. Aktiveringen av K-ras i hypoksiske betingelser innebærer en nøkkelrolle i den hypoksiske respons, og våre studier markere to viktige funksjoner: hemming av apoptose og stimulering av angiogenese. Rollen av K-ras i reguleringen av apoptose er sterkt avhengig av sammenheng og celletype. I noen tilfeller, kan K-ras være pro-apoptotiske gjennom aktivering av RASSF1 eller Nore1, men i andre scenarier kan det tjene anti-apoptotiske funksjoner ved PI3K eller Tiam1 [21]. Våre studier i tykktarmskreftceller påvise en nøkkelrolle for aktivering av Akt bane i hypoksi, som tidligere er blitt vist til å blokkere apoptose i andre cellulære systemer [22], [23], [24]. Interessant, ERK ble ikke aktivert av hypoksi i vårt system. Rollen til ERK-aktivering i colontumorer er ikke enkelt. Selv om ekspresjon av onkogene K-ras i normale epitelceller i kolon kan sterkt aktivere ERK
in vivo
, bare var begrenset ERK-signalisering observert i colontumorer som utviklet seg i disse dyrene [10]. I tillegg, tykktarmskreftceller som bærer en K-ras-mutasjon viste ingen signifikant aktivering av ERK, og ingen pålitelig korrelasjon mellom
KRAS
mutasjons status og ERK-aktivering har blitt observert i humane tarmkreftprøver [10], [ ,,,0],25]. De spesifikke mekanismer som bestemmer hvilke effektor trasé er engasjert av K-ras i hypoksisk versus normoksisk forholdene fortsatt skal defineres og illustrerer plastisitet av K-ras funksjon avhengig av spesifikke mikromiljø signaler.
hypoksiske forhold kan derfor skape et miljø der proto-onkogener som ikke mutert kan etterligne aktivert onkogener. Selv om vill-type K-ras kan aktiveres ved hypoksi, er det sannsynlig at dets aktivitetsspektrum ikke er helt overlapper med den av mutante K-ras og det finnes andre egenskaper som er spesifikke for onkogene
KRAS
alleler.
