Abstract
Hypoksi og betennelse er strengt sammenvevd både concurring til prostatakreft progresjon. Utallige rapporter markere rollen av tumorceller i syntesen av pro-inflammatoriske molekyler og viser at hypoksi kan modulere en rekke av disse genene som bidrar vesentlig til økningen av kreft aggressivitet. Men lite er kjent om viktigheten av svulsten fenotype i denne prosessen. Denne studien undersøker hvordan ulike funksjoner, inkludert differensiering og aggressivitet, av prostatatumorcellelinjer innvirkning på hypoksisk ombygging av pro-inflammatorisk genekspresjon og malignitet. Vi utførte våre studier på tre cellelinjer med økende metastatisk potensiale: godt differensiert androgen-avhengige LNCaP og mindre differensiert og androgen-uavhengig DU145 og PC3. Vi analyserte effekten at hypoksisk behandling har på moduler proinflammatorisk genuttrykk og evaluert rolle HIF isoformer og NF-kB spille i å opprettholde denne prosessen. DU145 og PC3-celler dokumentert en høyere normoksiske uttrykk og en mer fullstendig hypoksisk induksjon av pro-inflammatoriske molekyler sammenlignet med godt differensiert LNCaP-cellelinje. Rollen HIF1α og NF-kB, master regulatorer av henholdsvis hypoksi og betennelse i å opprettholde den hypoksisk pro-inflammatorisk fenotype var annerledes i henhold til celletype. NF-kB ble observert til å spille en viktig rolle i DU145 og PC3 cellene der behandling med NF-kB hemmer parthenolide var i stand til å motvirke både hypoksisk pro-inflammatorisk skift og HIF1α aktivisering, men ikke i LNCaP celler. Våre data høydepunkt som svulst prostata cellefenotyp bidrar til en annen grad og med ulike mekanismer til hypoksisk proinflammatorisk genuttrykk relatert til tumorprogresjon
Citation. Ravenna L, Principessa L, Verdina A, Salvatori L, Russo MA, Petrangeli E (2014) Tydelig fenotyper av menneskelige prostata kreft celler forbinder med Different Tilpasning til Hypoksi og proinflammatoriske Gene Expression. PLoS ONE 9 (5): e96250. doi: 10,1371 /journal.pone.0096250
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 20 september 2013; Godkjent: 04.04.2014; Publisert: 06.05.2014
Copyright: © 2014 Ravenna et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Kunnskapsdepartementet universitet og forskningsdepartementet (MIUR, COFIN 2006062242). Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft oppviser en heterogen cellepopulasjon inkludert sjeldne kreft stamceller (CSC) og pluripotente stamceller (PS) innleiret i en masse av celletyper ved forskjellige grader av differensiering. Den relative overflod av CSC + Ps og differensiering av bulk celler korrelerer med tumor malignitet [1], [2]. Men få tilgjengelige data om virkningen av fenotype av bulk kreftceller i å tilpasse seg miljøstress og spesielt til hypoksi. Hypoksi er en reduksjon i den normale nivå av vev oksygen spenning som kan forekomme i humane patologier. Nyere studier har vist at hypoksi fremmer en mer aggressiv metastatiske fenotype i humane cancerformer så som bryst [3], glioblastom [4], skjoldbruskkjertel [5], tykktarm [6], bukspyttkjertel [7] og spesielt prostatakreft [8] – [10] som er assosiert med en dårlig prognose. Hypoksi-induserbare faktorer (HIFs) er viktige regulatorer av transkripsjonen respons på hypoksisk spenning [11]. De er heterodimerer dannes av en O
2 følsom α subenheten og et konstitutivt uttrykt β subenhet (HIF1β). Tre isoformer av induserbare HIFα er til stede i pattedyr. HIF1α og HIF2α er de beste karakteriserte og liknende struktur isoformer [12]. HIF3α er mer fjernt beslektet med en rekke spleisevarianter [13]. I nærvær av oksygen, undergår HIF1α proteasomal degradering. Under hypoksiske betingelser, akkumuleres det i cellekjerner, danner heterodimerer med HIF1β og binder hypoksi responselementer på målgenet loci. Også HIF2α og HIF3α stede hypoksisk stabilisering og binding til HIF1β selv med ulike kinetikk. Både HIF2α og HIF3α vises uttrykt i en celle-spesifikk måte og spiller ikke-redundante roller i tilpasning til hypoksi og i hypoksiske tumorvekst og progresjon [14], [15]. Økende bevis indikerer at den inflammatoriske mikromiljøet er et ytterligere medvirkende faktor som fører til kreftutvikling i prostata [16], [17]. Inflammatorisk gen respons avhenger av flere transkripsjonsfaktorer, blant annet NF-kB spiller en sentral rolle. Den klassiske formen av NF-kB er heterodimer p50 /p65. Etter aktivering, NF-kB dimerer translocate inn i kjernen hvor de kan gjennomgå fosforylering, bind målgener og stimulere transkripsjon [18]. En krysstale mellom NF-kB og HIF veier har blitt dokumentert omfattende [19] – [21]. Faktisk, NF-kB subenheter p50 og p65 direkte samhandle med NF-kB konsensus nettsted på HIF1α arrangøren og bidra til basale nivåer av HIF1α mRNA og protein i enkelte modeller [22], [23]. På den annen side synes hypoksi å aktivere NF-kB avhengig gentranskripsjon [24]. Men de underliggende mekanismene som knytter hypoksi til betennelse og betennelse til tumorprogresjon fortsatt unnvikende. Nyere rapporter har fremhevet rollen til hypoksiske tumorceller i syntesen av inflammatoriske relaterte molekyler i bryst [3], glioblastom [4], skjoldbruskkjertel [25] og prostata [26] ondartet kreft progresjon. I tillegg viste de at en samordnet banen, herunder inflammatoriske og reparerende molekyler er til stede i svulstvev i fravær av påvisbare leukocytter infiltrat (CD45 +) og er oppregulert i transformerte celler.
Denne studien ble utført for å analysere den relative viktigheten av HIF og NF-kB baner i modulering av hypoksisk inflammatoriske genekspresjon i prostata cellemodeller viser tydelige fenotyper med økende differensiering. Avklare den spesifikke involvering av disse to baner i intratumor heterogene celler kan ha nyttig fall-out på klinisk forskning og terapi [27]. For å oppnå dette, utførte vi våre eksperimenter på godt differensiert, androgen-avhengige LNCaP og på mindre differensierte, androgen-uavhengig DU145 og PC3 tumor prostata cellelinjer med lav, middels og høy metastatisk potensial, henholdsvis [28] – [32] . Vi tok hensyn til et representativt sett av gener knyttet til det medfødte immunresponsen sterkt involvert i prostata tumorprogresjon som ble vist oppregulert i svulstvev [26], [33]. Disse inkluderer: skaden reseptoren for erfarne glykerte endeprodukter (RAGE) og purin-reseptoren (P2X7R), den vaskulære epidermal vekstfaktor A (VEGF) som er involvert i tumor angiogenese, den induserbare enzymer ciclo-oksygenase-2 (COX2) ansvarlig for prostaglandiner syntese, akuttfaseprotein pentraxin 3 (PTX3) og CXC kjemokin reseptor 4 (CXCR4) av stromal celle-avledet faktor, regulator av invasiv vekst og metastasedannelse. Videre har vi analysert nivåene av heme-oksygenase-1 (HO1), det hastighetsbegrensende enzym i heme degradering, som en prototype av anti-inflammatorisk regulator [34], [35]. For å evaluere virkningen av NF-kB i hypoksi drevet modulering av de analyserte pro-inflammatoriske gener, studerte vi effektene av NF-kB-inhibitor parthenolid. Bidraget av HIF1α og den kombinerte virkningen av NF-kB og HIF1α ble analysert i androgen-uavhengig DU145-celler som stabilt knockdown for HIF1α.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelig prostata kreft cellelinjer LNCaP, DU145 og PC3 ble oppnådd fra American Type Culture Collection. LNCaP ble dyrket i RPM1-1640 medium, DU145 og PC3 i D-MEM-medium (Invitrogen) supplementert med 10% volum /volum inaktivert føtalt bovint serum (Thermo Scientific HyClone) og 100 U /ml penicillin + 100 ug /ml streptomycin. Puromycin dihydrocloride (Sigma-Aldrich) 2 mg /ml ble alltid tilsatt til mediet av HIF1α knockdown kloner. Cellene ble holdt under standardbetingelser (normoksisk 95% luft og 5% CO
2) i en fuktet inkubator ved 37 ° C. For eksperimenter i hypoksiske betingelser, ble cellene sådd ut i retter i fullstendig vekstmedium ved en tetthet avhengig av lengden av behandlingen for å oppnå subconfluence da ble utført analysen. På dagen for eksperimentet, ble mediet erstattet med forbehandlet hypoksisk medium og cellekulturer ble utsatt for hypoksi i en forseglet modul inkubator kammer (Billups-Rothenberg) spylt med 1% O
2, 5% CO
2 og 94% N
2 i henhold til produsentens instruksjoner og kultur ved 37 ° C. Parthenolid (Sigma-Aldrich) behandlinger ble utført ved en konsentrasjon på 5 uM for den tid angitt, alltid innledes med en to timers forbehandling i normoxia.
Protein ekstraksjon og western blot-analyse
nuclear ekstrakter ble utarbeidet av en kjernefysisk ekstrakt kit (Active Motif). Totalt 5-20 ug protein ble løst i Tris-HCl-polyakrylamidgeler og elektroforetisk overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Invitrogen). Membranene ble blokkert i PBS-fettmelk 5% (Bio-Rad Laboratories) i 1 time, probet med det passende primære antistoff over natten ved 4 ° C og deretter inkubert med peroksydase-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur. Immunkomplekser ble visualisert ved hjelp av en forsterket kjemiluminescerende kit (EuroClone). Digitale bilder av de resulterende båndene ble kvantifisert ved nummer én programvarepakke (Bio-Rad Laboratories) og uttrykt som vilkår densitometriske enheter
Følgende primære og sekundære antistoffer ble brukt. Mus anti-HIF1α (1:500 BD Biovitenskap); mus anti-HIF2α og kanin anti-P50 (1:500, 1:1000, Novus Biologicals); kanin anti-HIF3α (1:1000, Aviva Biologiske Systems); mus anti-p65 (1:2000, Santa Cruz Biotechnology); kanin anti fosfor-NF-kB p65 (Ser 276) (1:1000, Cell Signaling); mus anti β-aktin (1:10000, Sigma Aldrich); pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus og anti-kanin (1:2000, Bio-Rad Laboratories).
RNA isolering og real-time kvantitativ polymerasekjedereaksjon
Totalt RNA ble ekstrahert ved Trizol reagens og revers transkribert ved hjelp Hevet II revers transkriptase og tilfeldige primere (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ RT-PCR ble utført med ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Life Technologies). TaqMan Gene Expression Analyse kits ble brukt for HIF1α, HIF2α, HIF3α, VEGF, RAGE, P2X7R, COX2, PTX3, CXCR4, HO1 og 18S rRNA (Life Technologies) med produsentens standardsykkelforhold. MRNA nivået av hvert gen ble kvantifisert ved hjelp av en passende standardkurve og normalisert til husholdningsgenet 18S rRNA.
Stall genet stanse
Mission shRNA Bakteriell Glycerol Stock husing sekvens verifisert shRNA lentivirus plasmidvektorer ( klone tall TRCN0000003810 og TCRN0000010819) som uttrykker kort hårnål RNA (shRNA) rettet mot HIF1α (HIF1α shRNA) og ikke-targeting shRNA negative kontroll plasmider (NTshRNA) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Bakteriekulturer ble forsterket og shRNA plasmider renset (PureLink, Invitrogen) og transfektert inn DU145 cellene. Stabile transfeksjoner ble utført ved anvendelse av Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. I korthet ble 10
6 celler sådd i retter med 6 cm diameter. Den følgende dag ble cellene transfektert med 4 ug plasmid i et medium uten antibiotika. Seks timer senere ble mediet erstattet med et standard medium, og 24 timer etter start transfeksjon ble cellene trypsinert og sådd ut ved forskjellige fortynninger. Etter ytterligere 24 timer ble den selektive antibiotikum puromycin-hydroklorid tilsatt i den endelige konsentrasjon på 2 ug /ml. Ti utvalgte kolonier på hvert plasmid vektor ble amplifisert og testet for HIF1α mRNA-ekspresjon. Kolonier med en redusert HIF1α mRNA nivå (~ 20% av gjennomsnittlig vekt verdi) for lyddemping plasmidvektorer og en mRNA-nivå sammenlignes med wt celler for NTshRNA plasmidvektor som ble kontrollert for HIF1α kjerneprotein ved western blot, etter 4 timer hypoksiske stimulering. For å redusere variabiliteten i hypoksisk respons, utførte vi våre eksperimenter på tre forskjellige knockdown kloner og vi presentere gjennomsnitt ± SE av resultatene oppnådd fra hver klone. For kontroll ble en blanding av tre ikke målretting plasmidvektorer transfekterte kloner brukt. NTshRNA DU145 og WT celler viste ingen signifikante forskjeller i normoksisk og hypoksiske nivåer av alle de analyserte parametrene. Derfor viser vi som «vekt» gjennomsnitt ± SE av data innhentet både fra wt og NTshRNA DU145 cellene.
Statistisk analyse
Hver eksperiment ble utført minst tre ganger og representative resultatene er vist. Verdier i søylediagrammer er gitt som gjennomsnitt ± SE. Statistisk signifikans for enkelt sammenligninger av normalfordelte data ble bestemt av Student t test eller Mann-Whitney Rank Sum test for data normalt ikke fordelt. All statistikk ble analysert ved PRISM program. P-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant (* /° /# P 0,05, ** /°° /## P 0,01, *** /°°° /### P 0,001).
Resultater
Protein kjernefysisk translokasjon og mRNA transkripsjon av HIF1α HIF2α og HIF3α i hypoksiske prostatakreftceller LNCaP, DU145 og PC3
Nuclear trans er et mål på aktivering av HIF isoformer. Vi kjennetegnes derfor atom uttrykk profilen til HIF1α, HIF2α og HIF3α i tumor prostata cellelinjene LNCaP, DU145 og PC3 følgende oksygenmangel (figur 1A). I normoksiske kontroll, HIF1α protein var umulig å oppdage eller til stede på et svært lavt nivå. En% oksygen økt sin kjernefysiske trans i alle de undersøkte cellelinjer med lignende kinetikk. Nuclear akkumulering startet tidlig etter oksygenmangel (1 t), nådde en topp etter 4 timer og falt nær bunnen nivå ved 48 timer. HIF2α var til stede i kjernen i alle cellemodeller også i normoxia og dens kvantitet synes ikke i betydelig grad modulert på hvilken som helst av de studerte modellene. En 72 kDa atom HIF3α protein påvises bare i normoksisk DU145 cellene der en sen induksjon ble også observert starter etter 24 timer stimulering. Densitometrisk analyse dokumentert en maksimal økning på 2,8 ± 0,8 folder i forhold til normoksisk celler etter 48 h oksygen tilbaketrekking og en langsom nedgang til verdier fortsatt over de av kontroller etter 72 timer hypoksi (data ikke vist).
Cell ble utsatt til 1% O
2 fra en opp til 48-72 timer, i henhold til den eksperimentelle design eller ubehandlet. Et protein ekspresjon ble påvist i kjerneekstrakter ved immunoblotanalyse. Et representativt eksperiment for hvert gen i hver undersøkte cellelinjer er vist. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. B mRNA bestemmelser ble utført ved real-time PCR, normalisert til husholdningsgenet 18S rRNA og uttrykt som fold induksjon med hensyn til normoksisk kontroller (sett på en). Middelverdier ± SE.
Effektene av hypoksi på HIF1α, HIF2α og HIF3α mRNA nivåer i de undersøkte cellemodeller er avbildet i figur 1B. HIF1α mRNA ble uttrykt i alle ikke-stimulerte celler. I hypoksisk miljø, forble HIF1α mRNA nivået uforandret i 4 timer og deretter brått ble redusert til 40-50% av basisverdien og holdt stabilt lav til 48 timer behandling. Også HIF2α mRNA ble uttrykt i alle normoksisk cellelinjer og viste en sen og bare svak økning i androgen-avhengige LNCaP etter 24 og 48 timer oksygenmangel. HIF3α mRNA var synlig bare i DU145. I denne cellen modellen, hypoksi bestemt mRNA oppregulering som gikk forut for økningen i kjernefysiske protein, som starter etter 4 timer og nådde en topp etter 48 h stimulering (10,8 ± 1,5 ganger induksjon).
Til sammen våre data høydepunkt at HIF1α isoform, ut av de tre analyserte, er den viktigste aktøren i respons på hypoksi uavhengig av celle fenotype. HIF3α aktivering er cellespesifikk og ser ikke ut til å være relatert til kreftcelle aggressivitet.
Hypoksi aktiverer NF-kB veien i DU145 og PC3, men ikke i androgen-avhengige LNCaP celler
evaluert effekten av hypoksi på NF-kB status av western blot analyse, kvantifisere mengden av atom P50 og P65 subenheter i tid-retters eksperimenter av oksygenmangel. Basal NF-kB-aktivering ble observert i alle cellelinjer. Nukleær translokasjon av både p50 og p65 var signifikant økt i forhold til normoksisk celler i PC3 (1-4 h) og DU145 (2-4 timer), mens oksygenmangel ikke klarte å betydelig modulere atom NF-kB-nivå i LNCaP-celler innenfor samme tids span (figur 2).
Cell ble utsatt for 1% O
2 fra 0,5 opptil 24 timer eller venstre ubehandlet. Etter tidene er angitt, ble cellene behandlet og atominnholdet av p50 og p65 ble påvist ved immunblotanalyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Et representativt eksperiment for hvert gen i alle de undersøkte cellelinjer er vist. Mean densitometry av NF-kB p50 og p65 i forhold til p-aktin ± SE er også dokumentert og uttrykt som vilkårlige enheter. * hypoksiske celler
vs
normoksisk kontrollceller.
Disse resultatene gir bevis for at hypoksi har en annen betydning for NF-kB vei i henhold til tumor celle fenotype.
hypoksisk oppregulering av betennelsesrelaterte fenotype i prostatatumorceller
Vi undersøkte deretter rolle hypoksi ved modulering av syntese av pro-inflammatoriske molekyler i de beskrevne prostata tumorcellelinjer. For dette formål har vi valgt en rekke representative medlemmer av genfamilier som er involvert i inflammasjon og i vev reparasjon overuttrykt i prostata svulst eller metastase og deres ekspresjon i tidsforløpet av akutt (2 og 4 timer) og kronisk (24, 48, 72 h) hypoksisk stimulering ble målt ved hjelp av sanntids-PCR.
ble observert Kvalitative og kvantitative forskjeller i basisnivået og i hypoksisk induksjon av de utvalgte molekyler i henhold til celle-fenotype og metastatisk potensiale.
LNCaP celler var de mindre aktive produsenter av molekylene studert i henhold normoxia. Vi oppdaget ikke transkripsjoner for PTX3 og COX2 og alle andre gener, med unntak av CXCR4, var betydelig mindre transkribert i forhold til androgen-uavhengig DU145 og PC3 celler (tabell 1).
Hypoksi var i stand til å indusere VEGF, RAGE, CXCR4 og HO1 men ikke P2X7R mRNA transkripsjon. RAGE-mRNA-økning var begrenset til akutt stimulering (4 h), mens mRNA transkripsjon av de andre gener nådde en topp etter 24 timer oksygenmangel og redusert med 72 h (figur 3a).
Celler ble utsatt for 1% O
2 fra 2 til 72 timer. mRNA nivåer for VEGF, RAGE, P2X7R, PTX3, COX2, CXCR4 og HO1 ble analysert ved real-time PCR og normalisert til husholdningsgenet 18S rRNA. Figurene viser forholdet mellom ekspresjonen av hypoksi behandlede celler i forhold til normoksisk kontrollceller (satt lik 1). Middelverdier ± SE. * hypoksiske celler
vs
normoksisk kontrollceller.
DU145 og PC3 cellene uttrykte et høyere antall av de valgte betennelsesrelaterte gener som ble oppregulert i hypoksi med en mer komplett og vedvarende respons i mer aggressive PC3 celler. Spesielt DU145 dokumentert basal transkripsjoner for alle de undersøkte molekyler unntatt P2X7R. I hypoksi, viste PTX3 mRNA en bråmoden og tidsbegrenset økning, mens transkripsjon av VEGF, RAGE, COX2, CXCR4 og HO1 toppet seg etter 24 timer stimulering og falt med 72 timer (Figur 3B). PC3 cellene uttrykte påvisbare basale mRNA nivåer av alle de analyserte proinflammatoriske molekyler. Også i denne cellelinje PTX3 og RAGE ble maksimalt indusert ved akutt hypoksi etter 2 og 4 timer stimulering, respektivt. Annerledes enn de andre cellemodeller, hypoksisk økning på VEGF, P2X7R, COX2, CXCR4 og HO1 uttrykk var fortsatt på topp etter 48-72 timer av oksygenmangel (figur 3C).
Sammen er de ovennevnte resultater markere at uttrykket og hypoksisk oppregulering av molekyler vanligvis involvert i betennelse og metastase i prostata svulst kan i stor grad varierer i henhold til celle fenotype.
NF-kB inhibitor parthenolide motvirker hypoksi-indusert pro-inflammatorisk fenotype i DU145 og PC3 men ikke i LNCaP celler og induserer HO1 transkripsjon i alle cellemodeller
observasjon at hypoksi har en annen betydning for NF-kB aktivering ifølge cellelinjen fenotype bedt oss om å undersøke hvilken rolle NF-kB i hypoksisk oppregulering av inflammasjonsrelaterte fenotype i alle prostataceller ved hjelp av den naturlige NF-kB-inhibitor parthenolid. På figurene 4A, 4B og 4C virkningene av 5 uM parthenolid på ekspresjonen av hypoksi modulerte pro-inflammatoriske gener i LNCaP, DU145 og PC3-celler henholdsvis er vist, både i hypoksisk og normoksisk betingelser. For hvert gen, presenterer vi de data som oppnås ved det tidspunkt ved hvilket hypoksi utøvet sin maksimale økning i transkripsjon som vist i figurene 3A, 3B og 3C. Parthenolid betydelig motvirkes den hypoksi-indusert oppregulering av de fleste av disse gener i DU145 og i PC3-celler bortsett fra P2X7R og CXCR4 i PC3-celler. Tvert imot, har stoffet ikke viser noen signifikant effekt på ekspresjonen av hypoksi-indusert molekylene i mindre aggressive LNCaP-celler.
LNCaP (A), PC3 (B), DU145 (C) celler ble holdt i normoxia og utsatt for 1% O
2 i nærvær og fravær av 5 uM parthenolid. mRNA-nivåer for VEGF, RAGE, P2X7R, PTX3, COX2, CXCR4 og HO1 ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR, normalisert til husholdningsgenet 18S-rRNA og uttrykt som gangers induksjon med hensyn til normoksisk ubehandlede kontroll (angitt med 1). For hvert gen presenterer vi effekten av parthenolid ved de tidspunkter hvor hypoksi som utøves en maksimal økning på dens transkripsjon. * hypoksisk Parthenolide behandlede celler
vs
hypoksiske celler. C: kontroll normoksisk ubehandlede celler. P: normoksiske Parthenolide behandlede celler. H: hypoksiske celler. HP. Parthenolide behandlet hypoksiske celler
Handlingen av parthenolide i modulering av HO1, et viktig enzym i å motvirke betennelsesskade, var helt annerledes (figur 5). Parthenolide var i stand til å precociously og sterkt induserer HO1 i alle normoksisk og hypoksiske prostata kreftceller med en maksimal effekt etter 4 timer stimulering. Denne effekten gradvis redusert, men var fremdeles tilstede etter 24 timers behandling i LNCaP og DU145 og etter 48 timer i PC3-celler. Ved disse tidspunktene effekten av parthenolid og hypoksi på HO1 ekspresjon var additiv.
LNCaP, PC3 og DU145-celler ble holdt i normoxia og utsatt for 1% O
2 i nærvær og fravær av 5 pM parthenolide. mRNA-nivåer for HO1 ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR, normalisert til husholdningsgenet 18S-rRNA og uttrykt som gangers induksjon med hensyn til normoksisk ubehandlede kontroll (angitt med 1). Vi viser virkningen av parthenolid etter 4 timers behandling når medikamentet maksimalt oppregulert HO1 ekspresjon i normoksisk kulturer, og etter 24 timer (LnCap, DU145) og 48 timer (PC3) stimulering når hypoksi som utøves en maksimal økning på dens transkripsjon. Middelverdier ± SE. * Normoksisk og hypoksiske Parthenolide behandlede celler
vs
normoksisk kontrollceller. C: kontroll normoksisk ubehandlede celler. P: normoksiske Parthenolide behandlede celler. H: hypoksiske celler. HP: parthenolide behandlet hypoksiske celler
Disse resultatene viser at NF-kB spiller en sentral rolle i å flytte mer aggressive DU145 og PC3 men ikke LNCaP hypoksisk prostata kreftceller mot en pro-inflammatorisk, mer ondartet. fenotype. Videre er det i alle cellelinjer, vises NF-kB er involvert i en hypoksi-uavhengig inhibering av den antiinflammatoriske genet HO1.
Parthenolide påvirker HIF1α og HIF3α hypoksi avhengig aktivering i DU145 og PC3 cellelinjer
kontroll av HIFs og spesielt av HIF1α aktivering av NF-kB er et spørsmål om debatt. Vi testet om parthenolide hatt noen innvirkning på den kjernefysiske opphopning av HIF1α etter 4 timer hypoksisk stimulering som induseres det høyeste nivået av kjernefysisk translokasjon i våre eksperimentelle forhold. Figur 6A viser at NF-kB hemmer parthenolide betydelig redusert HIF1α protein atom akkumulering i DU145 og PC3 celle (~ 30%, P 0,05). Interessant, HIF1α atomnivå ble ikke påvirket av NF-kB-inhibering bare i LNCaP-celler som ikke viser et signifikant NF-kB-aktivering i hypoksi.
A LNCaP, DU145 og PC3-celler ble holdt i normoxia og utsatt for 1% O
2 i 4 timer i nærvær og fravær av 5 uM parthenolid. HIF1α Innholdet ble målt i atomfraksjonen ved immunblotanalyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. For hvert gen er vist et representativt eksperiment. Mean densitometry av HIF1α forhold til p-aktin er også dokumentert og uttrykt som vilkårlige enheter. B-DU145-celler ble inkubert i henhold til normoksisk eller hypoksiske betingelser i 48 timer i nærvær og fravær av 5 uM parthenolid. HIF3α Innholdet ble målt i atomfraksjonen ved immunblotanalyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. For hvert gen er vist et representativt eksperiment. Mean densitometry av HIF3α forhold til p-aktin er også dokumentert og uttrykt som vilkårlige enheter. Middelverdier ± SE. C: kontroll normoksisk ubehandlede celler. P: normoksiske Parthenolide behandlede celler. H: hypoksiske celler. HP: parthenolide behandlet hypoksiske celler. * hypoksisk Parthenolide behandlede celler
vs
hypoksiske celler.
Som beskrevet i figur 1A, HIF3α regulering var cellespesifikk og dens uttrykk var begrenset til DU145 cellene blant prostata tumormodeller undersøkt. Vi undersøkte om NF-kB spilt en rolle også i hypoksi avhengig aktivering av HIF3α og vi observert at parthenolide betydelig redusert HIF3α atomnivå etter 48 h hypoksisk stimulering (~65%, P 0,01). (Figur 6B)
til sammen disse dataene markere at parthenolide kan påvirke hypoksisk HIF1α aktivering bare i tumorceller hvor NF-kB er lydhør overfor oksygenmangel. En hemmende effekt av parthenolide er observert også på HIF3α.
rolle HIF1α i ombygging av pro-inflammatoriske fenotype i DU145 cellene. Kombinerte virkningen av HIF1α knockdown og parthenolide
Til forskjell fra LNCaP, i mindre differensierte DU145 og PC3 celler, NF-kB veien var dypt involvert i ombygging av pro-inflammatoriske fenotype etter hypoksi. Å definere bidrag HIF1α i denne prosessen har vi opprettet stabil HIF1α knockdown kloner (HIF1α shRNA) fra DU145 cellene. Figur 7A viser nivået av kjerne HIF1α protein i vekt, i NTshRNA vektor transfekterte celler og i en representativ HIF1α shRNA transfektert klon ut av de tre valgt for forsøkene, etter 4 timer oksygenmangel. Den svært lavt nivå av kjernefysisk protein i HIF1α knockdown celler stammer fra 87% ± 1 gjennomsnittet dråpe HIF1α mRNA (data ikke vist). Som for villtype celler, preget vi NTshRNA og HIF1α shRNA kloner i normoxia og hypoksi for mRNA og kjernekraft protein nivå av HIF2α og HIF3α og for NF-kB status. HIF1α knockdown celler bekreftet HIF2α manglende respons på hypoksisk behandling i våre eksperimentelle forhold (data ikke vist). Både HIF3α mRNA og protein ble indusert ved hypoksi vedvarende til en mye mindre grad enn i WT-celler (figurene 7B, 7C). Videre parthenolide påvirket ikke HIF3α atomproteinnivå etter 48 h hypoksisk stimulering (figur 7C). Også i HIF1α knockdown celler hypoksi forbedret aktivitet av NF-kB som vist ved den økte atom nivå av p50 og p65 i 1% oksygen (figur 7D), selv om aktiveringstiden var kortere enn i WT-celler.
A vill-type, NTshRNA og HIF1α shRNA transfektert DU145-celler ble holdt i normoxia og under hypoksi (1% O
2) i 4 timer. HIF1α Innholdet ble målt i atomfraksjonen ved immunblotanalyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. C: kontroll normoksisk ubehandlede celler. H: hypoksiske celler. B villtype og HIF1α shRNA-celler ble holdt i normoxia og under hypoksi i 24, 48 og 72 timer. mRNA nivå for HIF3α ble analysert ved real-time PCR og normalisert til husholdningsgenet 18S rRNA. Grafen viser forholdet mellom den hypoksi-ekspresjon i behandlede celler i forhold til normoksisk kontrollcellekulturer (satt lik 1). Middelverdier ± SE. C villtype og HIF1α shRNA-celler ble holdt i normoxia og under hypoksi i 48 timer i nærvær og fravær av 5 uM parthenolid. Innholdet av HIF3α atom protein ble påvist ved immunblotanalyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. C: kontroll normoksisk ubehandlede celler. P: normoksiske Parthenolide behandlede celler. H: hypoksiske celler. HP: parthenolide behandlet hypoksiske celler. D HIF1α shRNA-celler ble holdt i normoxia og under hypoksi for 1, 2 og 4 timer. Den kjernefysiske Innholdet av p50 og p65 ble påvist ved immunblotanalyse. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Densitometrisk analyse av p50 og p65 i forhold til p-actin ble uttrykt som vilkårlige enheter, og vist som gangers induksjon i forhold til normoksisk kontrollcellekulturer (angitt ved 1). Middelverdier ± SE. * hypoksisk HIF1α shRNA celler
vs
HIF1α shRNA normoksiske kontroll.
Vi målte uttrykk for de valgte betennelsesrelaterte gener i tid-retters eksperimenter av akutt (2, 4 t ) og kronisk (24, 48, 72 h) hypoksisk stimulering i fravær og nærvær av 5 uM parthenolid. Som forventet, hadde NTshRNA celler ikke signifikant forskjellig fra WT-celler i alle de analyserte parametrene (data ikke vist). Derfor samlet vi data innhentet både i vekt og i NTshRNA DU145 cellene. Resultater på HIF1α shRNA celler var ganske annerledes. Vi sammenlignet med deres verdier med de som ble oppnådd i WT-celler ved ekspresjon av mRNA-nivåene av hvert gen i HIF1α shRNA celler som gangers induksjon med hensyn til den midlere normoksiske nivået observert i WT-celler som ble satt til 1. Figur 8A oppsummerer funnene for VEGF, RAGE, PTX3, COX2 og CXCR4 genekspresjon på tidspunkter hvor hypoksi utøves maksimal økning i transkripsjon (2 h for PTX3, 48 t for VEGF, COX2 og CXCR4). Normoksiske VEGF og PTX3 RNA-verdier var signifikant lavere i knockdown i forhold til WT celler, noe som bekrefter en rolle for HIF1α i deres basal uttrykk. Hypoksi betydelig oppregulert VEGF, COX2 og CXCR4 uttrykk til nivåer sammenlignbare med de som ble observert i WT celler.
