Abstract
Cystatin C antas å hindre tumorprogresjon ved begrenser aktivitetene til en familie av lysosomal cystein proteaser. Men lite er kjent om den eksakte mekanismen for cystatin C funksjon i prostata kreft. I denne studien undersøkte vi uttrykket av cystatin C og sin tilknytning til matriksmetalloproteinaser 2 (MMP2) og androgen reseptor (AR) i en vev microarray sammenligne godartede og ondartede prøver fra 448 pasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi for lokalisert prostatakreft. Cystatin C ekspresjon var signifikant lavere hos kreftprøvene enn i benigne vev (p 0,001), og det var en statistisk signifikant invers korrelasjon mellom ekspresjon av cystatin C og MMP2 (r
s
2 = -0,056, p = 0,05 ). Det var en klar tendens til at pasienter med redusert nivå av cystatin C, hadde en lavere total overlevelse. Målrettet inhibering av cystatin C ved bruk av spesifikke siRNA resultert i en økt invasivitet av PC3-celler, mens induksjon av cystatin C overekspresjon sterkt redusert hastighet invasjon av PC3 in vitro. Effekten av cystatin C på modulere PC3 celle invasjonen ble provosert av Erk2 inhibitor som spesifikt hemmet MAPK /Erk2 aktivitet. Dette tyder på at cystatin C kan mediere tumorcelle-invasjon ved å modulere aktiviteten av MAPK /ERK kaskader. I samsvar med våre immunhistokjemiske funn at pasienter med lav uttrykk for cystatin C og høy uttrykk for androgen reseptor (AR) har en tendens til å ha dårligere total overlevelse enn pasienter med høyt uttrykk av cystatin C og høy AR uttrykk, indusert overekspresjon av AR i PC3 celler som uttrykker cystatin C siRNA kraftig forbedret invasivitet av PC3 celler. Dette tyder på at det kan være en crosstalk mellom cystatin C og AR-mediert veier. Vår studie avdekker en ny rolle for cystatin C og tilhørende mobilnettet trasé i prostatakreft invasjon og metastase
Citation. Wegiel B, Jiborn T, Abrahamson M, Helczynski L, Otterbein L, Persson JL, et al. (2009) Cystatin C er nedregulert i prostatakreft og modulerer Invasjonen av prostata kreft celler
via
MAPK /Erk og androgen Receptor Pathways. PLoS ONE 4 (11): e7953. doi: 10,1371 /journal.pone.0007953
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: May 17, 2009; Godkjent: 29 oktober 2009; Publisert: 23.11.2009
Copyright: © 2009 Wegiel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Vetenskapsrådet (gi no. 20760 og 09915), den svenske Cancer Society (Projects Ingen 07-0458 og 02-4573), Forskningsfondet og Cancer Research Fund of Malmö, universitetssykehus, fakultet of Medicine, Universitetet i Lund Gunnar Nilssons Cancer Foundation, og Crafoord STF, og Regjeringen Helse Grant (ALF) og A. Oesterlund Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er fortsatt den vanligste og nest mest dødelige tumor hos menn i den vestlige verden [1]. Omtrent en tredjedel av behandlede pasienter vil få tilbakefall og ingen kurativ behandling i dag eksisterer for metastatisk sykdom [2]. Progresjonen gjennom hormonavhengig til kastrering motstandsdyktig og metastatisk prostatakreft er dårlig forstått. Prosessene for invasjon og metastase av tumorceller er avhengig av deres evne til å nedbryte liggende proteiner og andre komponenter vev. De proteolytiske enzymer og proteaser slik som kollagenase og katepsiner er nødvendige for dette formål, og således spiller avgjørende roller i flere trinn av kreftvekst og metastase [3], [4]. Blant proteaser, er de matriks-metalloproteinaser MMP’er og lysosomal katepsin B blitt tilskrevet en stor rolle i sykdomsprogresjon [5] – [9] [10], [11]. Nylig MMP2 ble også knyttet til en invasiv fenotype av prostatakreftceller [12] og uttrykk for MMP2 i ondartet prostata epitel ble demonstrert å være en uavhengig prediktor for prostatakreft sykdomsfri overlevelse [13].
Cystatin C er en utskilt cystein protease inhibitor som regulerer benresorpsjon, nøytrofile chemotaxis, og vev betennelse samt motstand mot bakterielle og virale infeksjoner. Det fungerer også som en potent hemmer av cathepsin B og andre menneskelige lysosomal cysteinproteaser [14]. Cystatin C er også kjent for å være en bedre markør for nyreskade enn kreatinin [15], [16]. Ved å inaktivere cathepsin protease-aktivitet, inhiberer cystatin C kreftcelleinvasjon og metastase [17], [18]. Unormale serumnivåer av cystatin C eller cathepsin B /cystatin C-komplekset har blitt foreslått som diagnostikk og prognostiske indikatorer for kreft i hud, tykktarm og lunge [19]. Cystatin C har blitt foreslått å spille en viktig rolle i neuroendrocrine differensiering av prostatakreft [20]. Mer nylig har serum-cystatin C er foreslått som nyttig markør for osteoblastisk øket aktivitet forbundet med bisfosfonat behandlinger i prostata kreftpasienter med benmetastaser [21]. Imidlertid er rollen av cystatin C i prostata cancer progresjon og dens tilhørende cellulære og molekylære nettverk gjenstår å undersøkes.
Nyere studier har vist at under tumorgenese og metastase, proteolytiske forskjellige kaskader bestående av enzymer så som cysteinproteaser og MMP’er opptre på en synkronisert måte, og hjelpe til med tumorvekst, invasjon inn i omgivende vev [10]. Cathepsin B har blitt implisert i nedbrytning av den ekstracellulære matriks (ECM), enten i utskilt form i det ekstracellulære rom eller festet til celleoverflaten [10]. Spesielt har MMP-2 og MMP-9 blitt foreslått å være assosiert med prostata cancer metastase, ble så høye nivåer av disse proteiner målt i plasma og urin hos pasienter med metastatisk sykdom [5], [22], [23]. MMP9 har også blitt studert intensivt og er skjønt å spille en viktig rolle i to viktige aspekter av tumorprogresjon, angiogenese og vaskulogenese [8].
metastatisk prosessen innebærer koordinering av flere cellulære og signal-overføringsveier som tillate kreftceller til å spre seg, remodel deres omgivelsene, invadere fjern området og danne nye svulster. MAPK signalveier spiller en viktig rolle i å indusere sekresjon av proteolytiske enzymer som nedbryter basalmembranen, noe som forbedrer cellemigrering og opprettholdelse av tumorcellevekst [7]. Økning i MAPK aktivitet er observert i avansert PCa som tyder på at en konstitutivt aktiv Ras veien kan være assosiert med prostatakreft progresjon og metastase [7], [24]. Viktigere er MAPK-aktivering knyttet til utvikling av androgen-uavhengig prostatacancer, nå ofte betegnes kastrering resistent prostatakreft (CRPC) [25], [26], [27].
Androgen reseptor (AR), et medlem av superfamily av ligand-aktivert kjernereseptorer, spiller en sentral rolle i patogenesen av primære og metastatisk prostatakreft [28], [29]. AR genamplifisering er funnet i en tredjedel av avansert prostatakreft og antas å bidra til progresjon og metastasering av prostatakreft [30], [31], [32], [33]. AR ikke opptre uavhengig i reguleringen av tumorvekst, men krever samhandling med co-regulatorer [34]. Mutasjoner i genet eller budskap AR er grunnen til den økte androgen følsomheten av disse tumorer. Lokal autokrint produksjon av dihydrotestosteron og testosteron i prostatakreftceller avtar kastrering effekt [35]. Crosstalk mellom AR og andre signalveier (f.eks MAPK) samt endringer i AR co-regulatorer [34] akselerere ligand uavhengig aktivering av AR. Dermed spiller AR en viktig rolle i både klinisk lokaliserte og avanserte prostatakreft.
Denne studien forsøkte å behandle uttrykket av cystatin C og klinisk relevans i prostata kreft, og for å klargjøre en ny rolle for cystatin C i prostata kreft invasjon. Cystatin C er forbundet med den proteolytiske kaskade og MAPK /Erk veien sammen med AR kan opptre på en synkronisert måte for å fremme tumorvekst og invasjon inn i omkringliggende vev. Her etablerte vi for første gang en funksjonell kobling mellom cystatin C og MAPK-Erk signalering og AR-mediert baner i prostatakreftceller.
Resultater
Tissue Uttrykk av cystatin C i prostatakreft er assosiert med MMP2 som en markør for Invasivitet og klinisk utfall
Redusert cystatin C mRNA uttrykk har blitt rapportert i flere typer solide tumorer inkludert brystkreft, tykktarmskreft og nyrekreft [36], [37]. Imidlertid har den spesifikke rollen til cystatin C-protein ekspresjon i sykdomsprogresjon og dens forbindelse med kliniske karakteristika ikke blitt rapportert. Vi utnyttet en vev-microarray (TMA) som inneholder prøver fra benign prostatahyperplasi vev og ondartede svulster fra 448 pasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi for lokalisert prostatakreft. Uttrykk av cystatin C ble undersøkt ved immunhistokjemi. Nesten alle godartede prøvene viste markert høy cytoplasmisk protein uttrykk for cystatin C mens matchet prostata kreft vev konsekvent vist svakere eller ikke målbare farging (figur 1A, B). Differansen var statistisk signifikant (p 0,001), noe som tyder på at cystatin C proteinekspresjon er, generelt, nedregulert i prostata kreft sammenlignet med godartet epitel. Vi deles deretter tumorprøver i to grupper basert på Gleason graderinger av enkeltkjerne biopsier, Gleason grad 2 eller 3 (gruppe 1) vs. Gleason grad 4 eller 5 (gruppe 2) [38]. Vi fant redusert ekspresjon av cystatin C i 61% tumorprøver fra gruppe 1 sammenlignet med 72% av prøvene i gruppe 2 (figur 1A). Både MMP2 og MMP-9, i særdeleshet, har blitt funnet å være forbundet med prostatakreft metastase [13], [39]. Nylig ble cystatin C identifisert som et nytt substrat for MMP2 i celle-baserte proteomikk analyse, noe som tyder på at det er en direkte funksjonell sammenheng mellom MMP2 og cystatin C [40]. Vi utforsket derfor en mulig sammenheng mellom cystatin C uttrykk og uttrykk for MMP2 i pasientprøvene ved immunhistokjemisk analyse av vår vev microarray konstruksjon (TMA). Interessant, ekspresjon av cystatin C protein ble omvendt assosiert med MMP2 i 448 pasientmaterialet som var statistisk signifikant (r
s
2 = -0,056, p = 0,05). Vi videre undersøkt om cystatin C uttrykk korrelert med klinisk utfall hos pasienter med prostatakreft, og vi delt pasientene inn i to grupper basert på nivået av cystatin C uttrykk: cystatin C høy (intensitet flekker 2 eller 3) eller cystatin C lav (intensitet flekker mindre enn 2) gruppe. Vi fant ingen signifikant forskjell i kliniske parametere inkludert Gleason score, T scene /patologi stadium, metastase fritiden, forbehandling PSA nivåer, Biokjemisk tilbakefall PSA nivåer, Biokjemisk ledig tid og positive kirurgiske marginer mellom cystatin C høyt og cystatin C lav gruppe (tabell 1 ). Vi deretter undersøkt om klinisk utfall inkludert total overlevelse (OS) skilte mellom cystatin C høyt og cystatin C lave pasienter. Pasienter i cystatin C høyt gruppe på 100 måneder fra diagnose hadde et OS på ca 40% sammenlignet med 25% for pasienter i cystatin C lav gruppen (p = 0,307) (figur 1C). Selv om vi ikke oppnår statistisk signifikans, er det en klar tendens til at pasienter med lavt nivå av cystatin C uttrykk hadde dårligere resultat sammenlignet med de med høyere nivåer. Når vi vurdert om biokjemisk tilbakefall overlevelse forskjellig mellom gruppene, det var heller ingen signifikant forskjell (p = 0,401) (figur 1D).
A). Immunhistokjemisk analyse av cystatin C uttrykk i godartede og PCA prøver. Seksjoner som representerer godartet, vev og svulster i Gleason grad 3 og grad 5 er vist. Representative bildene ble innhentet ved hjelp av et 40x objektiv. B). Grafen for kvantitativ analyse av immunhistokjemisk farging av cystatin C (0 poeng-negativ, 1- moderat, sterk 2-, 3- meget sterk) viser sammenligningen mellom 448 godartede og kreft prøver (gjennomsnitt farging av duplikater av hver prøve). Den sammenkoblede Wilcoxon rang sum test analyser ble brukt for å vurdere sammenligningen mellom gruppene. De gjennomsnittlige verdier av intensiteter av flekker (horisontale linjer) med feilfelt som representerer 95% konfidensintervall for gjennomsnittet vises. Boksene representerer fordelingen av ekspresjonen av cystatin C i gruppene. C) Total overlevelse hos pasienter med høyt eller lavt uttrykk av cystatin C i prostatakreft prøver. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse ble utført. D) Overlevelseskurver av tid til tilbakefall som vurderes som en biokjemisk tilbakefall målt ved høyning av PSA [57] for lav (intensitet scorer 0-1,5) og høy (intensitet scorer 2-3) cystatin C uttrykk.
Tissue uttrykk av androgen Receptor er omvendt Associated med Cystatin C Expression
Amplification og mutasjoner av AR genet er identifisert som kritiske faktorer knyttet til dårlig prognose av prostatakreft. Vi ønsket å undersøke hvorvidt cystatin C uttrykk i kombinasjon med AR kan forutsi utfallet av sykdommen. Vi evaluerte uttrykk for cystatin C i en undergruppe av våre TMA prøvene omfatter 99 pasienter med den mest avanserte sykdom og hadde høyt nivå av AR uttrykk. Vi delt disse 99 pasienter i to grupper: de cystatin C-lav /høy AR-gruppe og cystatin C-høy /AR-høy gruppe (figur 2). Pasienter med lav cystatin C-nivå og høy AR uttrykk hadde lavere total overlevelse (40%, 100 måneder) sammenlignet med pasienter med høyt cystatin C-nivå og høy AR uttrykk (60%, 100 måneder), selv om disse resultatene ikke oppnådde statistisk signifikans (p = 0,094). Dette tyder på at pasienter som hadde lav cystatin C og høy ekspresjon AR har en tendens til å ha dårligere resultat sammenlignet med pasienter med høy cystatin C og høy ekspresjon AR.
total overlevelse i en gruppe på 99 pasienter med de mest avanserte prostatakreft (Gleason grad 4-5) som ble preget av høy uttrykk for AR og ble skilt i ulike grupper basert på cystatin C-nivå (lav intensitet scorer 0-1,5 og høy intensitet scorer 2-3).
cystatin C Expression in prostate Cancer Cell Lines
Fordi cystatin C ble nedregulert i prostata kreft vev og forbundet med økt uttrykk av MMP2 som er kjent for å bidra til tumorinvasjon og metastase, ønsket vi å undersøke rollen til cystatin C ekspresjon i prostata kreftcellevekst, overlevelse og invasjon. Vi undersøkte cystatin C uttrykk i tre prostatakreft cellelinjer inkludert androgen-sensitive LNCaP celler og androgen-insensitive PC3 og DU-145 celler (figur 3). Cystatin C-proteinkonsentrasjoner i supernatantene ble målt ved hjelp av ELISA, etter dyrking av cellene i serumfritt medium i 24 og 48 timer henholdsvis. Interessant, LNCaP-celler som er kjent for å være ikke-invasive produserte høye nivåer av cystatin C, mens den invasive cellelinjer PC3 og DU-145 viste lavere nivåer av cystatin C sekresjon (figur 3). PC3-celler, med et moderat nivå av ekspresjon cystatin C ble valgt for etterfølgende funksjonelle studier for å evaluere effektene av tvungen overekspresjon og knockdown av cystatin C på PC3 celle invasjon.
ELISA-analyse av supernatanter fra tre forskjellige prostatakreftceller linjer, som ble sådd ut 24 timer eller 48 timer før forsøket ble utført. Data er vist som gjennomsnitt av tre paralleller ± SD for 3 forsøk.
nedregulering av Cystatin C er knyttet til invasjon av PC3 celler
Siden PC3 celler er invasiv, uttrykker moderat nivå av cystatin C og har manglende funksjonelle AR, således kan være en utmerket modell for kombinerte studier av cystatin C og AR funksjon. PC3-celler ble transfektert med cystatin C siRNA vektor eller kontroll siRNA vektor i 24 timer. Immunoblot-analyse bekreftet at cystatin C siRNA spesifikt blokkert protein ekspresjon av cystatin C i PC3-celler (figur 4A). For å undersøke effekten av cystatin C slå ned på modulering av aktiviteten av invasive PC3-celler, in vitro-invasiv aktivitetsanalyser ble utført for å bedømme andelen av PC3-celler som uttrykker cystatin C siRNA eller tak siRNA som har invadert gjennom Matrigel belagte membraner. En signifikant høyere andel av PC3-celler, transient transfektert med cystatin C siRNA, migrerte gjennom Matrigel belagt kammer sammenlignet med det PC3-celler transfektert med kontroll siRNA (figur 4B-C). Deretter vurderes vi om cystatin C knockdown kan ha effekt på spredning av prostata kreft celler. PC3-celler transfektert med cystatin C siRNA eller kontroll siRNA ble utsatt for BrdU-inkorporering analysen. Cellulær proliferasjon ble bedømt etter 24 timer eller 48 timer etter transfeksjon. Ingen signifikante forskjeller i spredningshastigheter mellom PC3-celler transfektert med siRNA til cystatin C eller kontroll siRNA ble observert (data ikke vist), noe som tyder på at inhibering av cystatin C hadde ingen virkning på celleformering PC3. Evaluering av effekten av cystatin C på cellesyklusfordeling. Flowcytometrisk analyse ble utført i celler transfektert med cystatin C siRNA eller kontrollere siRNA, hadde vi ikke observere at stanse av cystatin C hatt vesentlig innflytelse på fordelingen av cellesyklus faser i PC3 celler (data ikke vist). Deretter ønsket vi å teste om hemming av cystatin C kan ha noen effekt på overlevelse av PC3 celler som respons på behandling med cellegift. PC3-celler transfektert med siRNA til cystatin C eller kontroll siRNA ble behandlet med det cytotoksiske middel camptothecin ved 10 ng /ml for å indusere apoptose. Behandling av PC3 celler med camptothecin vellykket indusert celledød i PC3 celler. PC3-celler transfektert med siRNA mot cystatin C, viste imidlertid ingen signifikant forskjell i camptothecin-indusert apoptose sammenlignet med PC3-celler transfektert med kontroll siRNA (data ikke vist).
A). Immunoblotting av cystatin C i PC3-celler etter behandling med kontroll (siCtr) og cystatin C (siCys) siRNA. B-C) Invasion assay i matrigel- belagt Boyden kammere i PC3-celler med knockdown av cystatin C. Representative bilde av invaderende celler er vist i (B) og kvantitativ analyse av invasjon ved å måle absorbansen etter farging av invaderende celler med celleFlekk løsning innehold krystallfiolett leveres i Transwell Invasion analysen (Chemicon, Millipore, CA) (C) data ± SD er representative for minst 3 forsøk; * p. 0,01 (Student t-test)
Fordi hemming av cystatin C i PC3 cellene hatt vesentlig effekt på PC3 celle invasjon, vi derfor vurdert om overekspresjon av cystatin C kan ha hemmende effekt på invasiv oppførselen til PC3 celler. For å indusere overekspresjon av cystatin C i PC3-celler, ble PC3-celler transfektert med et cystatin C ekspresjonsvektor eller med en tom ekspresjonsvektor. Den stabile overekspresjon av cystatin C i PC3 cellene ble oppnådd etter antibiotikavalg. Overekspresjon av cystatin C i PC3-celler ble bekreftet ved immunblotanalyse (figur 5A). Når vi undersøkte effekten av overekspresjon av cystatin C på PC3 celle invasjon, ble det registrert at en betydelig lavere andel av PC3-celler som overuttrykker cystatin C migrert gjennom Matrigel-belagte Boyden kammere sammenlignet med celler som uttrykker kontroll-vektor (figur 5B-C). Til sammen tyder våre data gjeldende en viktig rolle for cystatin C for å hemme prostatakreft celle invasjon.
A) Immunoblot av cystatin C i PC3-celler etter stabil transfeksjon med pcDNA3.1 og cystatin C-pcDNA3.1 plasmider . Stabile kloner ble etablert etter 2 uker med utvalg på neomycin. B-C) Invasion analyse av PC3 celler med overekspresjon av kontroll eller cystatin C plasmider. Representative bilder av celler er vist i B og kvantifisering (absorbans) av data + SD fra 3 uavhengige forsøk er vist i C. * p 0,05 (Student t-test)
The Role of Erk2. pathway i cystatin C medierte effekter på Invasion
Deretter ønsket vi å undersøke de cellulære mekanismene og reaksjonsveier for cystatin C utøver sin effekt på PC3 celle invasjon. MAPK signalveier og TGFp veier har vist seg å ha funksjonell kobling med proteolytiske enzymer, inkludert cathepsin familie av proteiner for å fremme nedbrytning av basalmembran, forbedrer celleinvasjon og opprettholder tumorcellevekst. Smad 2/3 proteiner er nedstrøms effektorer av TGFB signalering og målet om MAPK /ERK veier også, vi ønsket derfor å undersøke om cystatin C kan ha en direkte funksjonell kobling til disse signalveier. Vi først undersøkt om cystatin C kan megle virksomhet MAPK og TGFB trasé ved å regulere uttrykk og fosforylering av Smad2 og ERK1 /2 i PC3 celler. Vi undersøkte fosforylering av Smad2 og ERK1 /2 i PC3-celler transfektert med cystatin C siRNA eller kontroll siRNA (figur 6A). Immunoblot-analyse viste at en økning i nivået av fosforylert Smad2 og ERK1 /2 ble observert i PC3-celler transfektert med cystatin C siRNA, noe som tyder på at både Smad2 og ERK1 /2 kan være nedstrøms effektorer inhiberes av cystatin C (figur 6A).
A). Immunoblot analyse av P-Smad2 i PC-3 celler etter lyddemping av Smad2. B-C). Invasion analyse i PC-3 celler etter å kneble av Smad2 samtidig med knockdown av cystatin C. De representative Bildene vises i B og kvantitative resultater fra 3 uavhengige forsøk er presentert i C. * p 0,05 (Student t-test). D). Immunoblot med antistoff mot fosforylert (Ser383) -Elk1 og cystatin C i lysatene fra PC3 celler transfektert transient med siRNA cystatin C og kontroll siRNA og co-behandlet med Erk2 inhibitor (25 mm). Merk at Erk2 hemmer blokkerer nedstrøms fosforylering av Elk1 et mål av Erk2 i celler med knockdown av cystatin C. Dataene er representative for 2 eksperimenter. E-F). Invasion analyse i PC-3 celler etter samtidig stanse av cystatin C og hemming av Erk2 med selektiv hemmer. De representative Bildene vises i D og kvantitative resultater fra 2 uavhengige forsøk er presentert i E. * p 0,05, # p. 0,01 (Student t-test)
For å funksjonelt undersøke hvilken rolle Smad2 aktivering i PC3 celler, testet vi om målrettet Smad2 knockdown hatt noen effekt på tumorcelle invasjon. Vi har utformet siRNA spesifikt mot Smad2. Inhibering av fosforyleringen Smad2 via Smad2 siRNA mediert knockdown ble oppnådd i PC3-celler og ble bekreftet ved immunblot (data ikke vist). In vitro-invasive aktivitetsanalyser viste at andelen av migrerende og invaderende PC3-celler var like i PC3-celler transfektert med Smad2 siRNA og i PC3-celler transfektert med kontroll siRNA (figur 6B-C). Vi deretter utføres samtidig målrettet knockdown av Smad2 og cystatin C i PC3 celler. PC3-celler som er ko-transfektert med cystatin C siRNA og Smad 2 siRNA eller kontroll siRNA ble ytterligere påført på invasjonen kammeret for invasjonen analysen. Det var ingen forskjeller i invasjonen kursen mellom PC3 celler samtidig uttrykte cystatin C siRNA og Smad 2 siRNA og PC3 celler co-uttrykker cystatin C siRNA og styrer siRNA (figur 6B-C), noe som tyder på at hemming av Smad2 hadde ingen tilleggseffekter på moduler invasjon av PC3-celler som uttrykker cystatin C siRNA og at Smad2 kan ikke være involvert i cystatin C-mediert tumorcelle invasjon.
fordi en økning i nivået av fosforylert ERK1 /2 ble også observert i PC3-celler transfektert med cystatin C siRNA i de ovenfor angitte forsøk, har vi derfor ytterligere undersøkt om aktivering av ERK1 /2 mediert den hemmende effekten av cystatin C på PC3 celle invasjon. Behandling med en MEK-inhibitor (PD98059), en generell inhibitor av MAPK banene hadde ingen effekt på den invasive oppførselen til PC3-celler som uttrykker cystatin C siRNA eller kontroll siRNA (data ikke vist). Vi bestemte oss for å selektivt hemmer aktiviteten av Erk en eller Erk2.
Det første vi hemmet Erk 1 uttrykk via siRNA målrettet knockdown. Inhibering av Erk 1 hadde ingen effekt på invasjonen av PC3-celler som uttrykker cystatin C siRNA (data ikke vist), noe som tyder på at ERK1 kan ikke involvert i cystatin C forbundet tumorcelle-invasjon. Deretter anvendte vi selektiv inhibitor av Erk2 aktivitet, som blokkerte fosforylering av Elk-1, en nedstrøms mål for Erk2, i PC3 celler som uttrykker cystatin C siRNA (figur 6D). Vi observerte at Erk 2-inhibitor inhiberte signifikant frekvensen av invasivitet i celler som uttrykker cystatin C siRNA sammenlignet med celler som uttrykker kontroll siRNA (figur 6E-F). Den Erk2 inhibitor hadde ingen virkning på celleformering i PC3-celler under de samme betingelser (data ikke vist). Disse resultatene antyder at Erk2 kan være en nedstrøms mål for cystatin C. Dette tyder på at PC3-celler som har lav cystatin C og høy Erk2 aktivitet kan bli mer invasive sammenlignet med celler med normalt nivå av cystatin C og Erk 2-aktivitet. Videre kan cystatin C megle tumorcelle invasjon gjennom MAPK /ERK2 signalveier.
AR Forbedrer Cell invasjon i fravær av Cystatin C
AR er en viktig nedstrøms mål av MAPK /ERK stier, og inhibering av ERK1 /2-aktivitet vil føre til en redusert ekspresjon av AR i prostata kreftceller [41]. Overekspresjon av AR i PC3-celler har vist seg å påvirke celle invasjon og vekst in vitro [42]. Siden vi har etablert en direkte funksjonell kobling mellom cystatin C og Erk2 aktivitet, og vi har vist at PCA pasienter med lave cystatin C-nivå og samtidige høye nivåer av AR viste en tendens mot en verre utfall i forhold til pasienter med høyt cystatin C og høy AR nivåer, vi ønsket derfor å vurdere cellulært og molekylært sammenheng mellom cystatin C og AR. Vi anvendte PC3-celler som mangler funksjonell AR for å undersøke en samarbeidende rolle mellom AR og cystatin C. PC3-celler ble ko-transfektert med AR uttrykke vektoren sammen med cystatin C siRNA vektor betegnet som «siCysC, AR», eller med en kontrollvektor betegnet «sictr, AR». På en lignende måte, PC3-celler var også ko-transfektert med et CMV-vektor og cystatin C siRNA (betegnet som «siCysC, CMV»), eller et CMV uttrykker vektor og en styre siRNA ( «sictr, CMV»). De transfekterte PC3-celler ble deretter utsatt for invasjon assay. Overekspresjon av AR med samtidig knockdown av cystatin C resulterte i en betydelig økning i hastigheten av invasjonen av PC3-celler sammenlignet med kontrollene (figur 7A-B). Dermed disse resultatene tyder på at PC3-celler som mangler cystatin C, men har et høyt nivå av AR kan være mer omfattende enn kontrollcellene med normalt nivå av cystatin C og AR.
A-B). Invasjon analysen av PC3 celler transfektert med kontroll siRNA eller mot cystatin C og coexpressing AR. Bildene fra representant eksperiment er vist i A og de kvantitative Absorbansen av invaderende celler (* p 0,05, cystatin C siRNA versus siRNA kontroll, # p 0,05 AR versus CMV, Student T-test) etter angivelse med Cell Stain Solution leveres i den Transwell Invasion analysen (Chemicon, Millipore, CA) er vist i B. dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter.
Diskusjoner
i denne studien har vi vist at
in vitro
stanse av cystatin C ved spesifikke siRNA økt kreftcelle invasjon i samarbeid med Erk2 og AR signalering. Vi raknet nye molekylære mekanismer som cystatin C påvirker tumorcelle invasjon viser at cystatin C uttrykk ble nedregulert i primær prostatakreft sammenlignet med godartede vev i 448 pasienter. Ved hjelp av en TMA bestående godartede og tumorprøver fra 448 pasienter, viste vi en invers korrelasjon mellom cystatin C og MMP2 uttrykk. Flere studier har overbevisende demonstrert at cystatin C er et viktig inhibitor av katepsin B og tumorcelle-invasjon [43], [44]. Cathepsin B påvirkninger tumor mikromiljøet av nedbrytning av ekstracellulær matriks, og ved aktivering av andre proteolytiske enzymer så som pro-urokinase-type plasminogen aktivator (pro-uPA) og matriks-metallproteaser (MMP) slik at tumorceller aktivt kan invadere og metastasere [45]. Overekspresjon av cystatin C har vist seg å inhibere invasiv potensialet av humane melanom og glioblastoma cellelinjer [36], [43]. Vår nåværende funn fra etterforskningen av kliniske materialer indikerer at det er en direkte kobling mellom cystatin C og ekstracellulære matrix protein MMP2 i prostatakreft. Vi har ikke undersøkt rollen til cystatin C i modulering av katepsin B-aktivitet i prostatakreftceller, men det er en åpen mulighet tanke på tilsvarende sammenhenger i andre typer av tumorer. Proteome signaturer som er kjennetegnene ved proteolyse avslørte spalting av mange kjente MMP-2 substrater i mobilsammenheng. Proteomikk bevis på MMP-2 behandling av nye substrater ble funnet. Cystatin C-proteinet er ett av substratet som blir spaltet av MMP-2 [40]. Vi gir ytterligere bevis som støtter et tidligere foreslått rolle av cystatin C for å forebygge tumorgenese og kreftcelle invasivitet, muligens på grunn av dets evne til å inhibere aktiviteten av ekstracellulære matriksproteiner [46], [47].
funksjonell analyse i PC-3-celler videre demonstrert at hemming av cystatin C via siRNA-mediert knockdown resulterte i en betydelig økning i hastigheten av invasjonen av PC3-celler. Denne observasjonen er i samsvar med tidligere demonstrasjon i primær prostatatumorer hvor de mest invasive svulster hadde svært lav eller ikke målbare cystatin C uttrykk. Dermed kan cystatin C være funksjonelt viktig for celler til å opprettholde normal oppførsel, som er i samsvar med vår nåværende resultater som PC3 celler som overuttrykker cystatin C via transient transfeksjon vises mindre invasive fenotyper.
Erk-MAPK veien er en felles signalering mekanisme for flere vekstfaktorer som er involvert i metastatisk spredning og resistens [48]. Ved å anvende siRNA mot cystatin C, viste vi at cystatin C ble inverst forbundet med invasiv oppførselen til PC3-celler, og at cystatin C var involvert i reguleringen av Erk kinaseaktivitet.
