Abstract
Xanthatin, en sesquiterpene lakton renset fra Xanthium strumarium L., besitter fremtredende anticancer aktivitet. Vi fant at forstyrrelse av GSK3p aktivitet var avgjørende for xanthatin å utøve sine kreft egenskaper i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), samtidig med å foretrekke undertrykkelse av konstitutiv aktivering av STAT3. Interessant, inaktivering av de to signaler er to gjensidig utelukkende hendelser i xanthatin-indusert celledød. Videre vi overraskende funnet at eksponering av xanthatin ikke klarte å utløse presumable bivirkning av kanoniske Wnt /β-catenin fulgt av GSK3p inaktivering. Vi videre observert at nedregulering av STAT3 var nødvendig for xanthatin å finjustere risikoen. Dermed kan oppdagelsen av xanthatin, som har muligheten til å samtidig orkestrere to uavhengige signalkaskader, har viktige implikasjoner for screening lovende legemidler i kreftbehandling
Citation. Tao L, Fan F, Liu Y, Li W, Zhang L, Ruan J et al. (2013) for samordnet bekjempelse av STAT3 og GSK3P er involvert i vekst Hemming av ikke-småcellet lungekreft etter Xanthatin. PLoS ONE 8 (11): e81945. doi: 10,1371 /journal.pone.0081945
Redaktør: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Storbritannia
mottatt: 31 august 2013; Godkjent: 17 oktober 2013; Publisert: 28.11.2013
Copyright: © 2013 Tao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China (nr 81173174 og 81202655) National; The National Key Technology Research Development Program (No. 2008BAI51B02); Ph.D. Foundation programmer av Ministry of Education of China (No. 20113237110008). Jiangsu College graduate forsknings- og innovasjonsprosjekter (No. CXZZ13_0627). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
glykogensyntasekinase 3β (GSK3P) har dukket opp som en av de mest attraktive mål for terapeutisk behandling av neurodegenerative sykdommer, og GSK3p-inhibitorer er blitt vellykket anvendt for å klinisk praksis i flere tiår [1,2]. Selv om det har blitt allment akseptert at de avvikende GSK3p-mediert funksjoner er ofte relatert til kreftutvikling, utnyttelse av GSK3p antagonister i kreftbehandling forblir gåtefulle og kontroversielle [3]. Et stort problem i anti GSK3P behandling er forventet å aktivere Wnt /β-catenin signalering og stabilisere onkogener således antagelig føre til tumorgenese. I cytosol, phosphorylates GSK3p β-catenin og mål det for ubiquitinering og proteasomal degradering. Derfor hemming av GSK3p resulterer i β-catenin akkumulering, påfølgende trans inn i kjernen og rekruttering av lymfoid enhancer faktor /T-celle faktor (LSF /TCF) DNA-binding-mediert onkogene proteiner transkripsjon [4].
Lungekreft er kjent for topp ledende årsaken til dødelighet i verden [5]. Den nåværende kunnskap med hensyn til GSK3p i lungekreft progresjon er basert på klinisk observasjon at fosforylert GSK3p (Ser 9, kinase død) kan være en god prognostisk markør for epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) overekspresjon lungekreft [6]. Nyere bevis har vist at inhibering av GSK3p forbedrer evnen til Kjemopreventivt medikamentet celecoxib for å nedregulere anti-apoptotiske protein C-FLIP [7] og sensitizes tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) indusert apoptose i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [8], kan antyde at avbrudd av GSK3p aktivitet tjene som en valgfri måte å blokkere lungekreft.
identifisering av nye legemidler fra naturlige produkter har en lang og vellykket historie. I dette arbeidet, innfører vi en naturlig sesquiterpene lakton xanthatin [9], som er isolert fra
Xanthium strumarium
L. og har fremtredende anticancer aktivitet, kan farmakologisk forstyrre GSK3p. Det har blitt rapportert at metanol ekstrakt av
Xanthium strumarium
L. som tilbyr store xanthatin kan hemme GSK3p aktivitet og downregulate mikroftalmi-assosiert transkripsjonsfaktor (MITF) -mediert melanogenesis, mens MITF er hovedmål av Wnt signalveien [10]. Disse funnene foreløpig tyder på at det kan være noen hva sammenhengen mellom GSK3p hemming og Wnt aktivering av anlegget. Videre, hvis Wnt signale aktivering er et uunngåelig resultat ledsaget av GSK3p hemming, postulerte vi at det kunne ganske muligens være noen forebyggende løsninger for risikoen ved xanthatin. I dette tilfellet vil den multi-talentfulle kinase som et terapeutisk mål realiseres og nytten av xanthatin vil også bli verdsatt.
Vi har tidligere demonstrert at xanthatin betydelig indusert cellesyklus arrest og caspase-avhengig apoptose i menneskets lunge og magekreft, så vel som murin melanoma [9,11,12]. Imidlertid er det fortsatt stort sett uklart hvorvidt inhibering av GSK3P er essensiell for anticancer virkning av xanthatin. For ytterligere å avsløre potensielle mekanismer for hensiktsmessig samordning av flere veier som inaktivering av GSK3p av xanthatin dose ikke lett å opprettholde β-catenin /Wnt, tar vi signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3), fordi det er en ekspansiv bevis på litteratur tyde på at STAT3 regulerer en håndfull av nedstrøms onkogener som deles av β-catenin. Så langt vi kjenner til, 1250 overlapp mulige målgener har blitt identifisert som samtidig var regulert av β-catenin /TCF4 og STAT3 [13]. Disse godt karakterisert felles mål inkluderer cellesyklus akseleratorer (c-myc, CyclinD1, etc.), anti-apoptotiske proteiner (BCL-2, XIAP, etc.) og regulatorer metastase (COX-2, VEGF, etc.) [ ,,,0],14,15]. Egentlig var STAT3 aktivering involvert i atom akkumulering av β-catenin, noe som resulterer i dårlig pasient overlevelse i tykktarm og brystkreft [16,17]. Dermed er det utledes at STAT3 kunne funksjonelt samarbeide med β-catenin. Vi har derfor en hypotese om at avbrudd i STAT3 kan delvis dempe den forhøyede Wnt /β-catenin følgende GSK3p inaktivering av xanthatin.
I denne studien undersøkte vi effekten av xanthatin på Stat3 og GSK3p aktiviteter i NSCLC og undersøkt den underliggende crosstalk mellom STAT3 og Wnt /β-catenin signalings. Resultatene vil beslaglegging tvil klinisk anticancer anvendelse av xanthatin i fremtiden.
Materialer og metoder
cellekultur og cellelinjer
Den menneskelige NSCLC linjer (A549, H1975 , H1650, HCC827) og SV40-udødelig ikke-tumorigene humane bronkiale epitelceller BEAS-2B brukt som kontroll ble innhentet fra Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection (CBTCCCAS, Shanghai, Kina). De lungekreft cellelinjer ble dyrket som monolag i RPMI 1640 kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum (Wisent, Quebec, Canada), 100 mikrogram /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og BEAS-2B ble dyrket i serum- gratis LHC-8 medium (Invitrogen, Carlsbad, California) opprettholdt i en kuvøse med en fuktig atmosfære av 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
Kjemi og regenter
Xanthatin ble isolert og renset ved vår gruppe som tidligere beskrevet [10] og renheten oversteg 95% som bestemt ved en HPLC-metode. Den 100 mM stam av xanthatin oppløsning ble fremstilt i 100% DMSO og celler behandlet med lik mengde av DMSO tjente som kontroll. Lithium chloride (LiCl) ble SB216763 og N-acetylcystein (NAC) kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). Rekombinant humant IL-6 ble hentet fra R . D Systems (Minneapolis, MN, USA)
En løsning celleproliferasjonsanalyse
Cellen levedyktighet ble bestemt av CellTiter 96
® vandig en løsning celleproliferasjon analysen (Promega, Madison, WI, USA). I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners cellekulturplater og behandlet med angitte midler. Etter inkubasjon i angitte tidsrom, ble 20 ul av en løsning reagens tilsatt til hver brønn, og inkuberingen ble fortsatt i ytterligere 1-4 timer. Absorbansen ble målt ved 490 nm ved bruk av Synergy ™ HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT, USA). Effekten av angitte stoffer på cellelevedyktigheten ble bedømt som prosent av cellelevedyktighet sammenlignet med vehikkelbehandlede kontrollceller som ble vilkårlig tildelt 100% levedyktighet. Konsentrasjonen av xanthatin som resulterer i 50% inhibering av kontrollvekst (IC
50) ble beregnet ved å SPSS statistikk programvare. Bilder av cellen morfologi ble tatt med en invertert mikroskop (CarlZeiss, Hallbergnoos, Tyskland) på tilfeldige felt.
flowcytometri analyse
Celler ble sådd i 6-brønns cellekulturplater og behandlet med ulike midler for angitte tidsperioden. For cellesyklusanalyse, ble cellene løsnet med trypsin og vasket med kald PBS. Utfelte celler ble fiksert med 500 pl kald 70% etanol over natten ved -20 ° C. Etter å ha blitt vasket i PBS, ble fikserte celler deretter inkubert med RNase ved 37 ° C i 30 minutter og farget med propidiumjodid (PI) i 15 min ved romtemperatur i mørke og umiddelbart analysert ved strømningscytometri (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, California). For celle apoptose analysen ble cellene løsnet med trypsin og vasket med kald PBS. Resuspenderte celler i 500 mL bindende buffer var dobbelt farget med FITC-konjugert Annexin V og PI. Etter 15 min inkubering ved romtemperatur i mørke, ble prøvene umiddelbart analysert ved flow-cytometri.
Western blot-analyse
Whole-cellelysater ble fremstilt med RIPA-buffer inneholdende protease og fosfatase-inhibitorer. Atom og cytoplasmatiske celleekstrakter ble fremstilt ved bruk av NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Utvinning kit (Thermo, Rockford, USA). Like mengder cellelysater (25 ug) ble lastet på 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Etter membraner ble blokkert, ble de inkubert med monoklonalt antistoff mot GSK-3 (1:500, Signalway antistoff) og fosfor-GSK3p Ser-9 (1:10000, Epitomics), β-catenin (1:5000, Epitomics) og fosfor -β-catenin Ser-33/37 /Thr41 (1:1000, Cell Signaling Technology), STAT3 og fosfor-STAT3 Tyr705 (1:1000, Cell Signaling Technology), Akt og fosfor-Akt Ser473 (1:1000, Cell Signaling Technology), GPADH (1:5000, BioWorld Technology) og Lamin A /C (1:5000, Epitomics) etterfulgt av inkubasjon med pepperrot peroksidase-konjugert IgG (1:10000, BioWorld bioteknologi). Target proteiner ble oppdaget av ECL-system (Millipore, Braunschweig, Tyskland) og visualisert med ChemiDoc XRS system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
plasmider og genet transfeksjon
cellene ble transient transfektert med plasmider (0,1 ug /brønn på 96-brønners kulturplater og 2 ug /brønn i 6 brønners kulturplater) som inneholder hemagglutinin (HA) -tagged konstitutivt aktiv (S9A) GSK3p (plasmider 14754, Addgene, Cambridge, MA , avsatt av Dr. Jim Woodgett) og pcDNA3.0 tom vektor (Invitrogene, Carlsbad, CA, USA) som kontroll ved bruk av Opti-MEM medium (Gibco-BRL /Invitrogen, Carlsbad, California) pluss X-tremeGENE HP DNA transfeksjon reagens ( Roche, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens anbefalinger. Etter 48 timer post-transfeksjon ble cellene behandlet med den angitte midler for Western blot-analyser og proliferasjonsanalyse.
RNA interferens
oligonukleotider for human STAT3 siRNA sett ble kjøpt fra OriGene (Rockville, MD , USA). Settet inneholder tre ferdige tomannsboliger rettet mot et bestemt gen av interesse, og vi brukte en pool av tre mål siRNAs for å sikre effektivitet i arbeidet. Celler ble transfektert med STAT3 siRNA eller ikke-spesifikk siRNA (0,15 ug /brønn i 96-brønners kulturplater og 2 ug /brønn i 6 brønners kulturplater) ved hjelp av Opti-MEM pluss X-tremeGENE siRNA transfeksjon reagens (Roche, Mannheim, Tyskland ) i henhold til bruksanvisningen. Etter 24 timer post-transfeksjon ble cellene ytterligere behandlet med xanthatin for Western blot-analyser og proliferasjonsanalyse.
Kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad , CA, USA). Første cDNA ble syntetisert med en mikrogram total RNA ved hjelp av en PrimeScript RT reagenssett (TakaraBio, Tokyo, Japan). QRT-PCR ble utført ved hjelp av IQ
TM SYBR Grønn SuperMix og iQ5 sporing i sanntid system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Den komparative syklus terskel (Ct) metoden ble brukt for å kvantifisere uttrykket nivåer gjennom beregning av to
(- ΔΔCt) -metoden. Primerne anvendt for PCR var som følger (sense- og antisense, henholdsvis): GAPDH: cgagatccctccaaaatcaa og ttcacacccatgacgaacat; Cyclin D1: gtgctgcgaagtggaaacc og atccaggtggcgacgatct; c-myc: taccctctcaacgacagcag og tcttgacattctcctcggtg; BCL-2: gtggagagcgtcaaccgggaga og gggccgtacagttccacaaaggc; XIAP: cgagcagggtttcttttatactgg og tgtagactgcgcgtggcact. cDNA forsterkning og relative uttrykk verdier ble innhentet fra tre uavhengige eksperimenter.
Immunocytochemistry
Etter A549 celler på dekkglass ble behandlet av angitte agenter, ble de løst ved å forhånds kald aceton, deretter skylles tre ganger med PBS. Cellene ble permeabilisert i 0,1% Triton X-100 og inkubert med 1% BSA /PBS for å blokkere ikke-spesifikk binding. Deretter ble cellene immunfarget ved inkubasjon med kanin-monoklonalt antistoff mot β-catenin (fortynnet 1:500, Epitomics) over natten ved 4 ° C. Etter å ha blitt vasket med PBS, ble cellene inkubert med FITC-konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff (fortynnet 1:60, BOOSTER Biotechnology, Wuhan, Kina). Kjerner ble kontra med Hoechst 33258 (BioTime Biotech, Haimen, Kina). Bilder ble tatt og analysert ved hjelp av ZEN 2011 bildebehandlingsprogrammer på en Zeiss invertere mikroskop (CarlZeiss, Hallbergnoos, Tyskland) under 400 ganger forstørrelse.
Dual luciferasereportergenet analysen
Celler i 96 brønner kulturplater ble transient transfektert med 0,1 pg /brønn p-STAT3-TA-Luc reporter plasmider (BioTime Biotech, Haimen, Kina) eller TCF /LSF-responsive luciferase (Luc2P /TCF-LSF /Hygro, Promega, Madison, WI, USA ). Transfeksjon effektivitet ble normalisert med Renilla luciferaserapportørplasmid plasmider. Etter 18 timer post-transfeksjon ble cellene behandlet med angitte midler. Relativ promoter-aktivitet ble målt ved dobbel-luciferase reporter (DLR) analysesystemet ved bruk av Glomax 96 Mikroplate Luminometer (Promega, Madison, WI, USA). For kotransfeksjonseksperimenter, celler i 96-brønners kulturplater ble ko-transfektert med STAT3 siRNA (0,08 ug /brønn), mål- og kontroll-reporter plasmider (0,15 ug /brønn totalt) i 24 timer og deretter behandlet med antydede midler, så gikk DLR analysen.
Statistisk analyse
dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjeller i resultatene av to grupper ble evaluert ved anvendelse av enten to-halet Student t test og enveis ANOVA etterfulgt av
post hoc
Dunnetts test. Forskjellene med
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Xanthatin hemmer spredning av NSCLC
For å få tilgang til kreft aktiviteter xanthatin , fire humane NSCLC-cellelinjer A549, H1975, H1650 og HCC827, samt normal (ikke-neoplastiske) humane bronkiale epitelceller BEAS-2B ble anvendt. Som vist i figur 1A, har vi funnet xanthatin hemmet NSCLC spredning i en dose og tid responsive måte. IC
50-verdier fra hver kreftcellelinje og inkubasjonstid ble beregnet, som viser at xanthatin som utøves 50% inhibering etter 20 uM etter 48 timers behandling. Vi bemerket også hemmende effekt på normale bronkiale epitelceller holdt ved høye mikromolare konsentrasjoner enn effekten av ekvivalente doser og inkubasjonstid på xanthatin i NSCLC. Representative bilder av cellemorfologi viste at xanthatin selektivt drepte tumorceller i stedet for normale celler (figur 1B). Sammen er disse dataene viser at xanthatin har universell anticancer aktivitet i NSCLC tilsynelatende uten fysiske toksisitet.
(A) NSCLCs (A549, H1975, HCC827, H1650 celler) og menneske bronkiale epitelceller (BEAS-2B) ble eksponert til indikerte konsentrasjoner av xanthatin (1, 5, 10, 20, 40 uM) for henholdsvis 24 timer og 48 timer,. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved en løsning celleproliferasjonsanalyse. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Verdiene er uttrykt som prosent av levedyktige celler som er normalisert til prosentandel av levedyktige celler i 0,5% DMSO-behandlede celler. Konsentrasjonen av xanthatin som resulterer i 50% inhibering av kontrollvekst (IC
50) ble beregnet ved å SPSS statistikkprogram ved hjelp av Probit-modell. (B) Representative bilder av cellemorfologi i BEAS-2B og H1975 celler ble tatt etter 48 timer behandling med eller uten 20 mikrometer xanthatin (100 × representerer skala bar 200 mikrometer).
Xanthatin fortrinnsvis hemmer aktivering av STAT3 snarere enn GSK3p i NSCLC
Vi har evaluert neste om nedregulering av GSK3p og STAT3 aktiviteten var sammenfallende med kreft effekter av xanthatin. Vi behandlet NSCLC med forskjellige konsentrasjoner av xanthatin (1, 5, 10, 20 og 40 pM) i 6 timer, eller 20 uM xanthatin innen 12 timer. Western blot analyse viste at xanthatin doseavhengig økning i fosfor GSK3p (Ser9) og redusere fosfor-STAT3 (Tyr705) uten total proteinnivået er endret i A549, H1975, H1650 og HCC827 celler (figur 2A). I tillegg observerte vi at xanthatin potente opphevet STAT3 aktivitet i 30 min, men fosforylert GSK3P begynte å øke etter 2 timers behandling i A549 og H1975 celler (figur 2B), hvilket antyder at xanthatin hovedsakelig undertrykkes STAT3 istedenfor GSK3p. Sammen er disse resultatene tyder på at inaktivering av både GSK3p og STAT3 er involvert i cellulære hendelser utløst av xanthatin.
(A) NSCLCs (A549, H1975, HCC827, H1650 celler) ble behandlet med angitte konsentrasjoner av xanthatin ( 1, 5, 10, 20, 40 uM) i 6 timer og deretter ble underkastet Western blot for å måle protein nivåer av fosfor-GSK3P (Ser9), t-GSK3p, henholdsvis fosfor-STAT3 (Tyr705) og STAT3. (B) A549 og H1975-celler ble behandlet med 20 uM xanthatin for ulike tid (0-12 h) og deretter ble underkastet Western blot for måling av protein nivåer av fosfor-GSK3p (Ser9), GSK-3, fosfor-STAT3 (Tyr705 ) og STAT3 hhv.
Inaktivering av GSK3p og STAT3 er to gjensidig utelukkende hendelser i xanthatin-indusert celledød
for å bekrefte forholdet mellom de to molekylære hendelser forårsaket av xanthatin og potensial mekanismene bak mottakelighet av xanthatin-indusert celledød, undersøkte vi om den kjente GSK3p-spesifikke kinase hemmere, LiCl (non-ATP-kompetitiv hemmer) og SB216763 (ATP-kompetitiv hemmer) [18] kunne generere lignende anticancer aktivitet og forsterke anticancer responsen xanthatin. Som vist i Figur 3A, har vi funnet begge av 20 mM LiCl og 20 uM SB 216763 øket GSK3p inaktive og effekten vesentlig styrket ved xanthatin. Interessant, i motsetning til LiCl, SB216763 kunne ikke bare øker fosforylering av GSK3P basal men også nedbrytningen av den totale GSK-3 i A549 og H1975 NSCLC, som var ute av vår forventning. Imidlertid farmakologiske GSK3P inhibitorer mislyktes i å påvirke nivået av fosfor-STAT3. For ytterligere å undersøke om GSK3p inaktivering kan ha innvirkning på celleoverlevelse, fant vi at spredning av A549 og H1975 celler ble markert hemmet av GSK3p hemmere alene eller i kombinasjon med xanthatin i 24 timer behandling, og normale menneskelige bronkiale epitelceller ble svakt påvirket av GSK3p-inhibitorer med eller uten xanthatin (figur 3B).
(A) A549 og H1975-celler ble behandlet med 0,5% DMSO eller 20 uM xanthatin ko-inkubert med eller uten 20 mM LiCl eller 20 uM SB216763 i 6 timer . Proteinprøver ble utsatt for Western blot for måling av fosfor-GSK3p (Ser9), GSK-3, fosfor-STAT3 (Tyr705) og STAT3. (B) NSCLC (A549, H1975-celler) og BEAS-2B ble eksponert for 0,5% DMSO eller 20 uM xanthatin ko-inkubert med eller uten 20 mM LiCl eller 20 uM SB216763 i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (For angitte sammenligninger, *
P
0,05, **
P
0,01). (C) Styre siRNA eller siRNA mot STAT3 ble transfektert inn i A549 celler (2 mikrogram siRNA per brønn). Etter 24 timer etter transfections ble cellene behandlet med med eller uten 20 mikrometer xanthatin i 6 timer etter med Western blot for måling av fosfor-GSK3p (Ser9), GSK-3, fosfor-STAT3 (Tyr705) og STAT3. (D) Kontroll siRNA eller siRNA mot STAT3 ble transfektert inn i A549 celler (0,15 mikrogram siRNA per brønn). Etter 24 timer etter transfeksjonene ble cellene behandlet med med 10 eller 20 uM xanthatin i ytterligere 24 timer og underkastet celle-proliferasjonsanalyse. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. For indikert sammenligninger, *
P
0,05, **
P
. 0,01
Vi har også brukt siRNA å dempe STAT3 funksjon i A549 celler som en omfattende validering. Western blot-analyse bekreftet signifikant suppresjon av fosfor-STAT3 og total STAT3 ekspresjon av mål siRNA, som genererte additiv inhibering av STAT3 aktivitet i nærvær av xanthatin. Imidlertid STAT3 siRNA også kunne forandre GSK3p-aktivitet sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (figur 3C). I tillegg stanse av STAT3 forbedret evne til xanthatin for å redusere veksten av A549 celler etter 24 timers behandling (figur 3D). Alt i alt, er det sannsynlig å konkludere med at blokkering av GSK3p og Stat3 aktiviteter er innblandet i antiproliferative effekter av xanthatin, men de to hendelsene er ikke årsaks tilkoblet.
Farmakologisk hemming av GSK3p delvis forsterker xanthatin-indusert celle arrest og apoptose
for å bekrefte de forbedrede kreft effekter av anti-GSK-3 i xanthatin eksponerte celler skyldes ubalansert celleproliferasjon eller apoptose, overvåket vi deretter cellesyklus og apoptose responser ved flowcytometrisk analyse i A549 celler. Som vist i figur 4A og 4C, 20 uM xanthatin og 20 mM LiCl ble sterkt indusere celler til å gjennomgå G2 /M rest etter 24 timers behandling (10,56 til 31,42% og 10,56 til 30,27%, henholdsvis), som ble ledsaget av en nedgang i G1 fase (69,26 til 41,21% og 69,26 til 50,33%, henholdsvis). I motsetning til LiCl, 20 uM SB216763 mindre utpreget påvirkes G2 /M fordeling i A549-celler (10,56 til 15,07%), som var parallell med den tidligere rapport [8]. Når vi co-inkubert xanthatin med de to GSK3p-inhibitorer, signifikant økning i cellene ved G2 /M fase først ved LiCl, men ikke SB216763. Cellene ble også farget med Annexin V /PI for apoptose analyse. A549-celler utviste en klar apoptose etter langvarig eksponering (48 h) ved xanthatin (58,8%), LiCl (54,6%), og henholdsvis SB216763 (48,1%). Videre xanthatin kombinert med SB216763 augmented mer apoptotiske celler enn LiCl (96,2% versus 71,9%) (figur 4B og 4D). Tatt sammen, hemming av GSK3P er sannsynligvis ansvarlig for xanthatin-indusert cellesyklus og apoptose.
(A), A549-celler ble utsatt for 0.1% DMSO eller 20 uM xanthatin ko-inkubert med eller uten 20 mM LiCl eller 20 uM SB216763 i 24 timer og deretter farget med propidium iodidle for påvisning av cellesyklus ved strømningscytometri. (B) A549-celler ble utsatt for 0.1% DMSO eller 20 uM xanthatin ko-inkubert med eller uten 20 mM LiCl eller 20 uM SB216763 i 48 timer og deretter farget med propidium iodidle og AnnexinV-FITC for detektering av apoptose ved strømningscytometri. (C) Kvantitative data for cellesyklus (G0-G1, S og G2 /M-fase) er hentet fra gjennomsnittet av målinger in triplo, og er vist som gjennomsnitt ± SD. For indikert sammenligninger, *
P
0,05, **
P
0,01. (D) Totalt prosenter av apoptotiske celler ble oppsummert av den nedre høyre kvadrant av fluorescens-aktivert celle sortering histogrammer (andel av tidlige apoptotiske celler) og øvre høyre kvadrant (prosentandel av sen apoptotiske celler). Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD. For angitte sammenligninger, *
P
0,05, **
P
. 0,01
GSK3p hemming er viktig for anticancer aktivitet av xanthatin
for å direkte undersøke om inaktivering av GSK3p korrelert med xanthatin-indusert celledød, vi transient transfektert A549 celler med en konstitutivt aktiv (S9A) konstruere av GSK3p. Som vi har funnet, ektopisk ekspresjon av konstitutivt aktiv GSK3P dempet fosforylering av GSK3P ved xanthatin, men likevel ikke klarte å endre nivåene av STAT3 signalering i A549-celler (figur 5A), som videre er angitt at inhibering av GSK3p ved xanthatin ble ikke stoles på inhibering av STAT3. Som forventet, overekspresjon av konstitutivt aktiv GSK3P dratt en motstand mot anticancer aktivitetene til xanthatin i tidsavhengig måte (figur 5B). Dessuten er GSK3P dypt involvert i apoptose flukt og dens inaktivering er et oppstrøms tilfelle av reaktive oksygenarter (ROS) generasjon [19,20]. For å oppnå dette, observerte vi at xanthatin-indusert celledød ble fullstendig forhindret i nærvær av en kraftig antioksidant og ROS-passiveringsmidlet N-acetylcystein (NAC) (figur 5C). Videre NAC fullstendig dempet GSK3P fosforylering av xanthatin (figur 5D), som demonstrerte rolle GSK3P inhibering av xanthatin i ROS-mediert celledød. Alt i alt har våre data at GSK3P inhibering er viktig for anticancer aktivitet av xanthatin via ROS.
(A) A549-celler utsådd i 6-brønners plate ble transfektert med HA-merket konstitutivt aktiv (S9A) -GSK3β eller tom vektor (2 ug plasmid DNA per brønn). Etter i 48 timer etter transfeksjonene ble cellene behandlet med eller uten 20 mM xanthatin i 6 timer, deretter ble underkastet Western blot for måling av proteinnivåer av HA tag, henholdsvis fosfor-STAT3 (Tyr705) og STAT3. (B) A549 celler seeded i 96 brønners plate ble transfektert med HA-merket konstitutivt aktiv (S9A) -GSK3β eller tom vektor (0,1 pg plasmid DNA per brønn). Etter i 48 timer etter transfeksjonene ble cellene behandlet med 10 eller 20 uM xanthatin i 24 timer og 48 timer henholdsvis, og deretter ble underkastet celleproliferasjonsanalyse. For indikert sammenligninger, *
P
0,05, **
P
0,01. (C) A549-celler ble behandlet med 10 eller 20 uM xanthatin i nærvær eller fravær av 1 mM NAC i 48 timer, deretter ble underkastet celleproliferasjonsanalyse. (D) A549-celler ble behandlet med 10 eller 20 uM xanthatin i nærvær eller fravær av 1 mM NAC i 6 timer, deretter ble underkastet Western blot for måling av protein nivåer av fosfor-GSK3p (Ser9) og GSK-3 respektivt. Dataene som vises, er representert som gjennomsnittet ± SD. For indikert sammenligninger, *
P
0,05, **
P
. 0,01
Xanthatin unnlater å utløse samlet post-transkripsjonen aktivitet av β- catenin svar på GSK3p inaktive
for å grundig vurdere muligheten for at xanthatin kan føre til skadelige konsekvenser på grunn av GSK3p hemming via oppregulering β-catenin mediert transkripsjon aktivitet og onkogener uttrykk, setter vi ut for å undersøke den intracellulære signalkaskade som svar til stimulering av xanthatin og GSK3p-inhibitor. Som vist i figur 6A, behandling med 20 uM xanthatin i 12 timer neppe indusert bred nukleær translokasjon av β-catenin, mens LiCl alene gjengitt β-catenin stabiliteten og den generelle atomfordeling. Co-inkubasjon av de to agentene forårsaket mest alvorlige hendelsen, men celletallet ble sterkt redusert. Deretter studerte vi endring av promoter-aktivitet ved hjelp av aktiv β-catenin ved hjelp av luciferase konstruere med LEF /TCF responselement, som ble innblandet i transkripsjon DNA-binding av β-catenin for å studere Wnt aktivering. Vi fant at xanthatin doseavhengig øket (0-10 uM), men ble redusert (20-40 pM) pre-transkripsjonelle aktivitet av Wnt /β-catenin, med eller uten 20 mM LiCl etter 6 timers inkubasjon (figur 6B). Vi undersøkt videre Tidsforløpet kinetikk karakterisering av 20 mikrometer xanthatin på β-catenin-LSF /TCF luciferase aktivitet. Xanthatin induserte en tidsavhengig aktivering av reportergenet innen 2 timer, men etter at begynte den maksimale effekt for å redusere innen 6 timer. Disse data bekrefter at xanthatin har mulighet for å aktivere β-catenin /Wnt, men denne hendelsen er ikke vedvarende.
(A) A549 celler ble behandlet med kjøretøy, 20 mikrometer xanthatin, 20 mM LiCl eller 20 mM LiCl pluss 20 uM xanthatin i 12 timer, deretter ble cellene fiksert og inkubert med primære antistoffer mot β-catenin. A549 celler ble immunostained med anti-kanin FITC-konjugert sekundært antistoff og deretter farget med Hoechst 33258. Prøvene ble visualisert og fotografert ved hjelp av en fluorescens mikroskop (400 ×, skala bar representerer 50 mikrometer). Blå viser kjernen og grønne viser lokalisering av β-catenin. (B) A549-celler dyrket til 70-90% konfluens ble ko-transfektert med Luc2P /TCF-LEF /Hygro og Renilla luciferase (0,1 ug plasmid DNA per brønn totalt) i 18 timer, deretter ble sitimulated med kjøretøyet, 20 mM LiCl eller 20 mM LiCl pluss 1, 5, 10, 20 og 40 uM xanthatin i 6 timer. Cellelysatene ble utført av DLR-analyse, og forholdet mellom ildflueluciferase til Renilla (relativ luciferaseaktivitet) aktivitet ble bestemt. For indikert sammenligninger, *
P
0,05, **
P
0,01. N.S, ikke-signifikant. (C) A549-celler dyrket til 70-90% konfluens ble ko-transfektert med Luc2P /TCF-LEF /Hygro og Renilla luciferase (0,1 ug plasmid DNA per brønn totalt) i 18 timer, deretter ble stimulert med 20 pM xanthatin for 0- -6 timer. Cellelysatene ble utført av DLR assay, **
P
0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. (D) A549-celler ble behandlet med eller uten 20 mM xanthatin i 12 timer og deretter totale RNA ble ekstrahert. CyclinD1, c-Myc, Bcl-2, XIAP mRNA-nivåer ble bestemt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR og normalisert til nivået av GAPDH mRNA. Brette endringer i mRNA-ekspresjonen av genene som er angitt ble sammenlignet som et forhold til bærerkontrollen. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater eksperimenter. **
P
0,01 sammenlignet med kontrollgruppen. (E) A549-celler ble behandlet med eller uten 20 mM xanthatin i 6 timer. Cytoplasmatisk (Cyto.) Og kjerne (Nu.) Ekstrakter ble fremstilt og deretter utsatt for Western blot for måling av proteinnivåer β-catenin, fosfor-GSK3p (Ser9), GSK-3, fosfor-STAT3 (Tyr705) og STAT3 respektivt.
Neste, vi konkludert med at mRNA nivåer av fire representative wnt målgener av kvantitativ real-time PCR-analyse. Som vist i figur 6D, Cyclin D1, c-Myc, Bcl-2 og XIAP var upåvirket, eller til og med undertrykt av xanthatin etter 12 timers inkubering.
