Abstract
Cyclin B1, en mitotisk cyclin, har vært innblandet i malignances. Men dens bidrag til tykktarmskreft invasjon og metastasering er fortsatt ikke godt forstått. Her viste vi at invasjonen og metastasering av tykktarmskreft er regulert av Cyclin B1. Overekspresjon av cyclin B1 ble observert i kolorektal kreft vev, men dette løftet uttrykket er negativt assosiert med lymfeknutemetastaser, fjernmetastaser scenen, og TNM stadium. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at lav Cyclin B1 uttrykk var assosiert med dårlig total overlevelse av pasienter med tykk- og endetarmskreft. Hemming av cyclin B1 i kolorektal kreft celler forbedret celle migrasjon og invasjon av tre ulike kolorektal kreft cellelinjer. Ved å studere den mulige mekanismen som cyklin B1 undertrykker kolorektal kreft invasjon og metastase, observerte vi at hemming av cyklin B1 redusert ekspresjon av E-cadherin proteinnivå. Våre funn tyder på at Cyclin B1 kan undertrykke invasjon og metastasering av kolorektal kreft celler gjennom regulering av E-cadherin uttrykk, noe som muliggjør utvikling av potensielle intervensjonsstrategier for tykktarmskreft
Citation. Fang Y, Liang X, Jiang W, Li J, Xu J, Cai X (2015) Cyclin B1 undertrykker tykktarmskreft invasjon og metastasering av Regulering E-cadherin. PLoS ONE 10 (5): e0126875. doi: 10,1371 /journal.pone.0126875
Academic Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 18 januar 2015; Godkjent: 08.04.2015; Publisert: 11 mai 2015
Copyright: © 2015 Fang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av det internasjonale vitenskapelige og teknologiske samarbeidsprosjekter i Kina (https://www.istcp.org.cn/) (Grant No. . 2012DFA30410 til Xiujun Cai), og National Science-teknologi for støtteprogrammer Prosjekter av Kina (https://www.most.gov.cn/) (Grant No. 2012BAI14B06 til Xiujun Cai)
Konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
til tross for økt generell bevissthet, forblir tykktarmskreft en av de tre viktigste årsakene til kreft-relatert dødelighet på verdensbasis [1]. Flertallet av pasienter med kolorektal kreft i tidlig stadium (TNM stadium I og II) kan behandles effektivt ved kirurgisk fjerning og 5-års overlevelse for de tidlige stadium kreften er opp til 95% (stadium I) og 60-80 % (trinn II), henholdsvis. Men de fleste pasienter med metastatisk kolorektal kreft i avansert stadium (TNM stadium III og IV) er vanligvis ildfast til eksisterende terapi og har ganske dårlig prognose siden 5-års overlevelse falle dramatisk til 35% med spredning til lymfeknuter (stadium III ) og til 10% når sykdommen har spredd seg til fjerntliggende organer (stadium IV) [2-5]. Således er metastasedannelse av avgjørende og den mest dødelige hendelse i løpet av denne sykdomsforløp. Faktisk er tumormetastase en komplisert prosess som involverer biologisk primær tumor angiogenese, cancer celle invasjon, vaskulær /lymfatisk intravasation, fjernt målorgan ekstravasasjon, og veksten av celler i invaderte fremmede mikromiljø for å danne metastatisk kolonisering [6-8]. Selv om feilregulering av signalveier og dysfunksjon av mange molekyler har blitt identifisert i kreft metastaser, kan de ikke fullt ut forklare fenomenet kolorektal kreft metastase [2]. Dermed er det av stor betydning å avdekke de biologiske mekanismene bak metastaser ved kolorektalkreft og formulere strategier for å gripe inn i denne prosessen.
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er kjent som en viktig mekanisme i kolorektal kreft metastaser og en viktig regulator av fjernt organ formasjon [9-11]. Under prosessen med EMT, til epitel-avledede tumorceller tap av celleadhesjon og polaritet og forsterkning av trekkende og invasive egenskaper, som resulterer i aktivering tumorceller infiltrere omliggende vev, og således lisensiering disse cellene til å metastasere til fjerntliggende vev [9, 12 ]. På molekylært nivå, er E-cadherin best-preget molekylær markør for EMT. Tap av E-cadherin uttrykk er kjent som den mest fremherskende kjennetegn på EMT [13-15]. E-cadherin, kodet for av CDH1 gen som befinner seg på kromosom 16q22 [16], er et transmembran-glykoprotein begrenset til epitelceller og er hovedsakelig ansvarlig for intercellulære overganger adherens [17]. Mange transkripsjonsfaktorer, slik som sneglen, ZEB1, ZEB2, FOXC2, Slug, og Twist har vist seg å direkte eller indirekte føre til undertrykkelse av E-cadherin promoter aktivitet [18-21]. Dessuten ble det tap eller reduksjon av E-cadherin uttrykk funnet å tillate eller akselerere invasjon og metastasering, og dermed foreslått som en mulig prognostisk faktor ved kolorektalkreft [22-25].
Cyclin B1, kartlagt til menneskelig kromosom 5q12, er kjent som en mitotisk cyclin på grunn av dens nøkkelrolle i modulering av G2 /M progresjon fase av cellesyklusen, og deltar i cellevekst, differensiering, apoptose, og metastase i forskjellige krefttyper [26-29]. Hittil har økt ekspresjon av syklin B1 er rapportert i bryst, prostata, øsofageal, lunge, kolon, og gastriske cancere [30-36]. I vår forrige undersøkelse, fant vi også overekspresjon av cyclin B1 fremmet celleproliferasjon og tumorvekst i human kolorektal kreft [37]. Imidlertid fravær av prognostisk betydning eller gunstig prognose av syklin B1 ble også observert i kolorektal cancer, lymfom og bukspyttkjertel neuroendokrin tumor [35, 38, 39]. Disse uoverensstemmelsene indikere videre studier for å være nødvendig.
I denne studien å belyse hvorvidt og hvordan Cyclin B1 er involvert i celle invasjon og metastasering i tykktarmskreft, vi først evalueres Cyclin B1 uttrykk i 150 par av tykk- og endetarmskreft og matchet tilstøtende ikke-tumor kolorektal vev, deretter analysert dens korrelasjon med clinicopathological funksjoner. Interessant, fant vi at overekspresjon av cyclin B1 i tykktarmskreft var negativt korrelert med lymfeknutemetastaser, fjernmetastaser, TNM etapper, og dårlig overlevelse. Vår studie avslørte også hemming av cyclin B1 trykkes uttrykk for E-cadherin, og senere førte til induksjon av migrasjon og invasjon av kolorektal kreft celler. Disse funnene ikke bare knytte Cyclin B1 med metastaser i tykktarmskreft, men også gi et lovende mål for behandling sent stadium pasienter med kolorektal kreft.
Materialer og Metoder
Pasient og prøver
tumorous og matchet tilstøtende normale kolorektal vev ble innhentet fra 150 pasienter som gjennomgikk kirurgi på Sir Run Run Shaw Hospital, School of Medicine, Zhejiang University (Hangzhou, Kina), mellom april 2005 og juni 2009. spesielt tilstøtende normalt vev ble tatt 5 cm sideveis fra kanten av kreft regionen. Ingen av disse pasientene hadde fått kjemoterapi eller strålebehandling før operasjon. Denne studien ble godkjent av Sir Run Run Shaw Hospital forskningsetiske komité og alle prøvene ble innhentet skriftlig informert samtykke (S1 fig). Alle prøvene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen etter kirurgisk reseksjon og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon.
Klinisk informasjon fra disse pasienter, inkludert alder, kjønn, differensiering status, tumor plassering, tumorstørrelse, lymfeknutemetastase , fjern metastase, og TNM trinn ble samlet og vist i tabell S1. Pasientene ble fulgt opp en gang hver 3. måned i minst 5 år etter operasjonen. Alle pasientene ble kontaktet via telefon eller spørre bokstaver for å sjekke på deres helsetilstand. Død av pasientene ble konstatert av rapport fra sin familie.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert fra 2 ug total-RNA ved hjelp av PrimeScript RT reagens Kit (Takara) og amplifisert med SYBR Premiks Ex Taq (Takara) på ABI 7500HT system (ABI). Primeren av syklin B1 ble vist tidligere [37]. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. Relativ kvantifisering av mRNA uttrykk ble beregnet med to
-ΔCT eller to
-ΔΔCT metode.
Cell kultur og transfeksjon
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer p53
+ /+ HCT116, p53
– /- HCT116, og SW480 ble oppnådd fra American Type Culture Collection. p53
+ /+ HCT116 og p53
– /- HCT116-celler ble dyrket i McCoys 5A komplett medium (Gibco). De SW480 celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS (Gibco). Alle tre cellelinjer ble dyrket i et fuktet kammer med 5% CO
2 ved 37 ° C.
siRNA mot cyklin B1 og siRNA negativ kontroll ble syntetisert ved bioneer. Cellene ble transient transfektert med siRNA hjelp lipid-baserte transfeksjon reagenser DharmaFECT1 (Dharmacon) i henhold til produsentens protokoll. Transfeksjonseffektiviteten og transfeksjon nivå av cyclin B1 siRNA ble bestemt tidligere [37].
Cell migrasjon analysen
24 timer etter transfeksjon, 1 × 10
5 behandlede kreftceller i 200 ul av serumfritt medium ble tilsatt til det øvre parti av Transwells (8-um porestørrelse, Costar). De nederste kamre ble fylt med medium supplert med 10% FBS og inkubert ved 37 ° C /5% CO
2 til deteksjonstiden (24h for p53
+ /+ HCT116, 36h for p53
– /- HCT116, og 36h for SW480, henholdsvis). Celler på undersiden av membranen ble fiksert, farget med 0,1% krystallfiolett og tellet (fem uavhengige mikroskopiske felt i en 20-gangers forstørrelse). Assays ble utført i duplikat og gjentatt tre uavhengige ganger.
celle invasjon assay
En 24-brønners transwell plate (8-um porestørrelse belagt med matrigel (BD Biosciences) ble brukt for å måle celle invasjon kapasitet. 24h etter transfeksjon ble 1 x 10
5-celler ble resuspendert i serumfritt medium og tilsettes til det øvre kammer. det medium supplert med 10% FBS ble anvendt som kjemotiltrekkende til det nedre kammer før undersøkelse. celler ble inkubert ved 37 ° C i den angitte tid (30 timer for p53
+ /+ HCT116, 42h for p53
– /- HCT116, og 48 timer for henholdsvis SW480,). cellene på den øvre overflate ble skrapet med bomullspinner og vasket bort, mens de invaderte celler på den nedre overflate ble fiksert, farget med 0,1% krystallfiolett i 1 time, og kvantifiseres ved bestemmelse av celletallet i fem randmonly utvalgte synsfelt Analyser ble utført i duplikat og gjentatt tre uavhengige ganger.
Vest-blot analyse
Celler ble samlet og lysert i RIPA buffer som inneholder proteasehemmer (Pierce). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med BCA-assay kit, og lik mengde protein, ble underkastet elektroforese på 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel og overført til polyvinylidendifluorid membrances (PVDF, Millipore). Etter blokkering av ikke-spesifikk binding, ble membranen inkubert med spesifikke primære antistoffer mot cyklin B1 (1: 2000; Epitomics), E-cadherin (1: 1000; Abcam), og GAPDH (1: 2000; Santa Cruz) over natten ved 4 ° C, og deretter vasket tre ganger med Tris-bufret saltvann og Tween 20, fulgt inkubert med de passende pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff (HRP, Dawen Biotec) i 1 time ved romtemperatur. Proteinet uttrykket ble til slutt visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence deteksjon (ECL, Biologiske Industries). Intensitetene for proteinekspresjon signalene ble kvantifisert ved hjelp av densitometrisk analyse med Mengde En programvare (Bio-Rad), og de resulterende verdier av proteinet ble normalisert til de tilsvarende lasting av kontrollene.
Immunhistokjemi
Anti -E-cadherin antistoff (Epitomics) ble anvendt for IHC-farging av de xenograft tumorer. IHC ble utført som beskrevet tidligere [37].
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS standard versjon 21.0 (SPSS Inc) og GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Forskjell mellom gruppene i vevsprøver ble vurdert av parametriske Mann-Whitney
U
test. Relativ kvantifisering av syklin B1 ekspresjon ble beregnet med 2
-ΔCT eller to
-ΔΔCT metode (ΔCT = cyklin B1 (CT) -GAPDH (CT); ΔΔCT = ΔCT (tumor) – ΔCT (normal)) og data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Kaplan-Meier og log-rank-tester ble benyttet for å evaluere pasient total overlevelse (OS) og for å skape overlevelseskurver basert på de høye og lave nivåer cyklin B1 (som definert av ROC-kurven). Den univariate og multivariate overlevelsesanalyse ble utført med Cox regresjonsmodellen. Alle in vitro eksperimenter ble utført i duplikat og gjentatt tre ganger. For in vitro og in vivo dyreeksperimenter, ble forskjellen mellom to grupper evaluert ved bruk av Students
t
-test, og data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Verdien av
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Cyclin B1 overekspresjon er negativt korrelert med lymfeknute matastasis, fjernmetastaser og avansert TNM stadium i menneskelige kolorektal kreft vev
For å identifisere potensielle rolle Cyclin B1 i kolorektal kreft metastase, vi først undersøkte uttrykk for cyclin B1 i 150 par av kolorektal kreft og matchet tilstøtende ikke-tumor kolorektal vev ved hjelp QRT-PCR. Cyklin B1 mRNA ble overuttrykt i 139/150 (92,7%) par, med en gjennomsnittlig økt gangers endring av 5,30 i kreftvev. Vi har videre funnet at den relative midlere ekspresjon av syklin B1 var mye lavere i pasienter med lymfeknutemetastase enn hos pasienter uten metastase (
P
= 0,011) (figur 1B). Hos pasienter med fjernmetastaser, nivået av Cyclin B1 var også betydelig lavere enn hos pasienter uten fjernmetastaser (
P
= 0,021) (figur 1C). Som vist i tabell 1, er sammenhengen mellom cyklin B1 nivå og clinicopathological egenskaper viste ekspresjon av Cyclin B1 var negativt korrelert med lymfeknutemetastase, fjern metastase, og avansert TNM trinn (
P
= 0,007) (Fig 1D ) hos pasienter med tykktarmskreft. Men ingen signifikant sammenheng ble funnet mellom Cyclin B1 uttrykk og andre clinicopathological funksjoner, for eksempel pasientens alder, kjønn, tumorlokalisering, tumorstørrelse og differensiering (alle
P
0,05). Videre bekreftes også vi proteinnivået Cyclin B1 i 30 kliniske vevsprøver, inkludert 10 normale kolorektal vev, 10 kolorektal kreft vev uten metastaser, og 10 kreftvev med metastase av western blot. Vi fikk konsistent resultat med RNA nivå resultat. Cyclin B1 protein ble overuttrykt i kolorektal kreft vev uten metastaser, sammenlignet med de vanlige kolorektal vev (
P
= 5,51 × 10
-5), mens cyclin B1 proteinnivået betydelig redusert i kolorektal kreft vev med metastaser, sammenlignet med de uten metastaser (
P
= 0,012) (figur 1E). Disse data indikerer at Cyclin B1 uttrykket ble omvendt assosiert med kolorektal kreft metastasering.
(A) Cyclin B1 mRNA uttrykk ble testet ved hjelp av QRT-PCR i 150 par av menneskelige kolorektal kreft vev og tilstøtende ikke-tumorvevet. Endringer i uttrykket er vist som scatter diagrammer, med y-aksen indikerer cyclin B1 uttrykk. Dets ekspresjon ble normalisert til nivået av GAPDH-ekspresjon i hver prøve. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. ***
P
0,001. (B) QRT-PCR analyse av cyclin B1 uttrykk i kolorektal kreftpasienter med eller uten lymfeknutemetastaser. Dataene er representert som en 2
-ΔΔCT (tumor /normal). *
P
0,05. (C) Statistisk analyse av relative syklin B1 ekspresjonsnivået i vevene kolorektal kreft, med eller uten fjernmetastaser. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05. (D) vurdering av relativ syklin B1 ekspresjonsnivået i kolorektal kreft vev av TNM trinn I, II, III, og IV. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05; **
P
0,01; NS, ikke signifikant. (E) Western blot validering av syklin B1 proteinnivå i normalt vev kolorektale (N) og kolorektal kreft vev (CA) med metastaser (M +) og uten (M-). GAPDH ble brukt for normalisering. Relativ intensitet av syklin B1 protein ble vist i de følgende stolpediagrammene. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. ***
P
0,001. *
P
0,05.
Cyclin B1 uttrykket er negativt assosiert med redusert overlevelse ved kolorektalkreft
For å evaluere den prognostiske potensialet Cyclin B1 i tykktarmskreft, vi analysert sammenhengen mellom Cyclin B1 uttrykk og overlevelse varighet ved hjelp av Kaplan-Meier analyse med log-rank test. Vi i utgangspunktet plottet mottakeren opererer karakteristikk (ROC) kurve for cyclin B1 (Fig 2A). I henhold til den maksimale Youden indeksen, den optimale cut-off-verdi for cyklin B1 ekspresjon var 3,33 ganger i tumor /ikke-tumor. Da de 150 pasienter med kolorektal kreft ble delt inn i to grupper: høy Cyclin B1 uttrykk gruppe (n = 88) som Cyclin B1 uttrykk forholdet ≥ 3,33, og lav Cyclin B1 uttrykk gruppe (n = 62) som Cyclin B1 uttrykk ratio 3,33, i henhold til cut-off nivå (figur 2B). Kaplan-Meier estimat analyse viste en sammenheng mellom Cyclin B1 uttrykk nivå og total overlevelse ganger. Pasienter med et lavt nivå av cyclin B1 hadde en åpenbart lavere overlevelse enn de med et høyt nivå av cyclin B1 uttrykk (
P
= 0,002) (figur 2C).
(A) optimal cut-off nivå av cyclin B1 forhold ble bestemt på grunnlag av den største av sensitivitet og spesifisitet av mottageren opererer karakteristikk (ROC) analyse for total overlevelse. Areal under kurven (AUC) av ROC var 0,90. (B) I henhold til den optimale cut-off verdi (3,33 ganger), ble 150 pasienter med kolorektal kreft delt inn i to grupper: ≥ 3,33 ble betraktet som en opphøyet cyklin B1 uttrykk gruppe (n = 88); 3,33 ble betraktet som en lav cyklin B1 uttrykk gruppe (n = 62). (C) Kaplan-Meier overlevelsesanalyse i henhold til Cyclin B1 uttrykk hos pasienter med kolorektal kreft (log-rank test). (D) Akkumulert totale overlevelseskurver for pasienter med høy eller lav Cyclin B1 uttrykk nivåer av multivariat analyse.
For å avgjøre om Cyclin B1 uttrykk er en uavhengig indikator på generelle survical for pasienter med kolorektal kreft, må vi først brukes en univariate Cox regresjonsmodell for å beregne den enkelte fareforhold for alle de clinicopathological egenskaper. Resultatene viste at total overlevelse ble significally relatert til Cyclin B1 uttrykk nivå (RR = 2,062; 95% CI, 1,273 til 3,340; p = 0,003) og fire andre parametere (tumor størrelse, lymfeknutemetastase, fjernmetastaser, og TNM stadium ; alle
P
0,05). Men i den multivariate analysen, Cox modell inkludert Cyclin B1 uttrykk, tumor størrelse, lymfeknutemetastase, og fjernmetastaser, identifisert tumor størrelse, lymfeknutemetastaser og fjernmetastaser som selvstendig prognostiske indikatorer for det samlede overlevelsen av pasienter med kolorektal kreft (HR: 0,564, P = 0,022; HR: 0,205, P = 2,0 × 10
-8, HR: 0,148, P = 1,0 × 10
-6, henholdsvis), men ikke Cyclin B1 uttrykk (p = 0,45) (figur 2D). De statistiske verdier av Cyclin B1 uttrykk og andre clinicopathological egenskaper avledet fra Cox regresjonsmodell er vist i tabell 2.
Undertrykkelse av cyclin B1 tilrettelagt trekkfugl evne i ulike kolorektal kreft celler
de ovennevnte observasjoner bedt oss om å undersøke mulighetene biologiske funksjonen til Cyclin B1 deregulering på kolorektal kreft progresjon. Muligheten av en tumorcelle for å gjennomgå migrering tillates det å endre posisjon i vev, og denne fremgangsmåte gjør det mulig for tumorceller til å gå fra sin primærtumor [40]. Dermed vurderte vi effekten av Cyclin B1 på migrasjon i kolorektal kreft celler ved hjelp av Transwell analysen. Tre kolorektal kreft-cellelinjer, p53
+ /+ HCT116, p53
– /- HCT116, og SW480 ble transfektert med spesifikk cyklin B1 siRNA eller siRNA negativ kontroll, respektivt, som tidligere rapportert. Resultatene viste at hemming av cyklin B1 tydelig forbedret vandrende evnen til p53
+ /+ HCT116-celler med 127% (p = 1,45 x 10
-5) (figur 3A). Tilsvarende spredningsevne av p53
– /- HCT116 ble også merkbart øket med 193% (p = 3,30 x 10
-8) (figur 3B) etter undertrykkelse av Cyclin B1 uttrykk. Videre migrasjon aktivitet i syklin B1 siRNA-transfekterte SW480-celler signifikant med 155% (p = 2,85 x 10
-6) (figur 3C), sammenlignet med kontrollceller. Disse data indikerer cyklin B1 utøver en migreringshemmende funksjon i humane kolorektale cancerceller, og denne effekten er uavhengig av celletype.
(A, B, C) Transwell migrasjon analyser av p53
+ /+ HCT116 , p53
– /- HCT116, og SW480-celler ble utført etter transfeksjon med Cyclin B1 siRNA eller negative kontroll, respektivt. Representative bilder av migrasjon analysen ble vist. I alle paneler, resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. NC, siRNA negativ kontroll. Data representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SD. ***
P
0,001
knockdown av cyclin B1 fremmer kolorektal kreft celle invasjon
Cell invasjonen er en iboende cellulær prosess der cellene svare på ekstracellulært. stimuli for å gå gjennom og fornedre den ekstracellulære matriks (ECM). I kreft, celle invasjon tillater kreftceller til å få muligheten til å gå inn lymfatisk og /eller blodkar for formidling til sirkulasjonen, fulgt av invasjonen til fjerne organer for metastatisk vekst [8, 40]. For å undersøke den potensielle effekten av cyclin B1 på celle invasjon i kolorektal kreft celler, brukte vi Matrigel invasjonen assay for påvisning. Vi fant at uttømming av syklin B1 resulterte i en 1,82 ganger og 1,72 ganger økning i antallet av invaderende celler i både p53
+ /+ HCT116 og p53
– /- HCT116-celler (p = 6,88 x 10
-6; p = 6,70 x 10
-6, henholdsvis) (figur 4A og 4B). Likeledes, hemming av cyklin B1 også økt invasjon aktiviteten av SW480 celler ved 4,47 ganger (p = 2,07 x 10
-7) (figur 4C). Til sammen antyder disse resultatene cyklin B1 hemmer invasjon av kolorektal kreftceller.
(A, B, C) ble Effekten av syklin B1 på celle invasjon detektert i tre kolorektale cancercellelinjer, p53
+ /+ HCT116, p53
– /- HCT116 og SW480-celler, ved hjelp av Transwell kammer analyser. Kamrene ble belagt med Matrigel, som fungerer som ekstracellulære matriks celle. Representative bilder av invaderte celler er vist. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer SD. ***
P .
0,001
Hemming av Cyclin B1 reduseres E-cadherin nivå i kolorektal kreft cellelinjer
Gitt at Cyclin B1 negativt korrelert med forbedret kolorektal kreft celle migrasjon og invasjon, undersøkte vi om EMT er en underliggende mekanisme. Dysregulering av E-cadherin har vært ansett for å være den viktigste kritiske molekylet i EMT-mediert kreftcellemetastase. Her, utforsket vi rolle Cyclin B1 i reguleringen av E-cadherin uttrykk i de ovennevnte tre kolorektal kreft-cellelinjer. Figur 5A og 5B begge viste at cyklin B1 siRNA transfeksjon i p53
+ /+ HCT116 og p53
– /- HCT116 sterkt redusert E-cadherin proteinekspresjon nivå, henholdsvis (p = 0,038; p = 0,011, respektivt) . Også i syklin B1 siRNA-behandlede SW480-celler, ble E-cadherin proteinekspresjon tydelig redusert sammenlignet med ekspresjon i negative kontroll-transfekterte celler (p = 0,0006) (figur 5C). Våre data indikerer at cyklin B1-mediert inhibering av celle invasjon kan skje via regulering av E-cadherin uttrykk.
(A, B, C) 72h etter transfeksjon med 50 nM av cyklin B1 siRNA eller siRNA negativ kontroll, endogene protein nivåer av E-cadherin og Cyclin B1 i p53
+ /+ HCT116, p53
– /- HCT116 og SW480 celler ble analysert ved western blotting og kvantifisert. Søylene viser de relative protein nivåer som er normalisert til GAPDH. Data representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SD. *
P
0,05; ***
P .
0,001
Hemming av Cyclin B1 nedregulerer E-cadherin uttrykk in vivo
For å avgjøre om Cyclin B1 endrer E-cadherin uttrykk in vivo, evaluert vi E-cadherin uttrykk i våre tidligere svulst xenograft modeller [37] av immunhistokjemisk farging. Som vist i figur 6A, ble E-cadherin nivå betydelig redusert i syklin B1-undertrykkende p53
+ /+ HCT116 tumorer, sammenlignet med de cyklin B1 ikke-undertrykkende kontrolltumorer. Tilsvarende, E-cadherin-protein ble også åpenbart nedregulert i syklin B1-undertrykke SW480 tumorer, sammenlignet med kontrolltumorer (figur 6B). Disse dataene antyder videre effekten av Cyclin B1 på E-cadherin uttrykk
(A) Bilder (X200, X400). Representerer immunhistokjemisk farging av E-cadherin i p53
+ /+ HCT116 svulster uttrykker Cyclin B1 shRNA eller vektor kontroll. (B) Representere bilder (X200, X400). Av E-cadherin i SW480 tumorer uttrykker Cyclin B1 shRNA eller vektor kontroll
Diskusjoner
De viktigste årsakene til tykktarmskreft relatert dødelighet er på grunn av komplikasjoner som følge av metastaser. Ifølge kreftstatistikken, er ca 60% av pasienter med kolorektal kreft forventes å utvikle metastaser. Selv om flere approachs for behandling har nylig blitt utviklet for kolorektal kreft, pasienter med avansert eller metastatisk kolorektalcancer har fortsatt dårlig prognose. I denne studien viste vi at Cyclin B1 trykt tykktarmskreft invasjon og metastasering gjennom regulering av E-cadherin uttrykk.
Reguleringen av ryddig cellecyklusprogresjonen er viktig for celler for å opprettholde genomisk integritet som er viktig for celleoverlevelse og kontrollert spredning. Cykliner er en familie av proteiner som varierer i deres ekspresjonsnivåer i løpet av cellesyklusen for å aktivere deres spesifikke cyklin-avhengige kinaser som er nødvendige for progresjon gjennom cellesyklusen. Blant dem er cyklin B1 av største interesse fordi det opprinnelig ble antatt at cyklin B1 styres G2-M-fase sjekkpunktet og regulert riktig utbruddet av mitose, som begge er essensielle for DNA-syntese og celledeling. Akkumulerte bevis har vist at Cyclin B1 ble overuttrykt i brystkreft, esophageal plateepitelkarsinom, lungekreft, magekreft, leverkreft og andre kreftceller [31, 32, 41-43]. Statistiske bevis antydet at Cyclin B1 var relatert til tumor malignance. I tillegg har overekspresjon av syklin B1 blitt identifisert som et lovende dårlig prognostisk markør for pasienter med leverkreft, ikke-småcellet lungekreft, og hode-hals karsinomer [32, 34, 43]. Imidlertid Chae et al. [44] rapporterte at cyklin B1 uttrykk ikke hadde noen innflytelse på overlevelse av pasienter med brystkreft. Björck et al. [38] rapportert at pasienter med follikulært lymfom uttrykker høyere nivå av syklin B1 viste bedre resultat etter kjemoterapi, sammenlignet med pasienter som uttrykker lavere nivå av syklin B1. Disse uoverensstemmende funnene kan forklares ved ulik uttrykksmønster av syklin B1 i forskjellige tumortyper. Vi har tidligere funnet at cyklin B1 ble overuttrykt og viktig for celleproliferasjon og tumorvekst via fremme cellesyklusprogresjon og /eller reduksjon av apoptose i kolorektal kreft-celler [37]. Imidlertid er rollen og mekanismen for syklin B1 i kolorektal cancer metastase har ikke vært godt undersøkt.
I denne studien, har vi funnet cyklin B1 ekspresjonsnivået i kolorektal kreft vev var også høyere enn i Nomal vev i et stort panel av 150 pasienter, i samsvar med våre tidligere data. Men Cyclin B1 overekspresjon var negativt korrelert med aggressive clinicopathological funksjoner, for eksempel lymfeknutemetastase, fjernmetastaser, og TNM stadium. Pasienter som hadde lav uttrykk for cyclin B1 var bemerkelsesverdig dårlig total overlevelse sammenlignet med pasienter som hadde høy uttrykk for cyclin B1. Univariat analyse viste at Cyclin B1 var en prognostisk indikator for total overlevelse hos pasienter med tykktarmskreft, selv om multivariat analyse viste Cylcin B1 var ikke en uavhengig prognostisk faktor. Samlet utgjør disse resultatene tydelig vist at lav Cyclin B1 nivå er assosiert med dårlig prognose og ugunstige kliniske resultatet av tykk- og endetarmskreft. Men våre resultater ikke er enige med to andre studier [35, 45]. Heike et al. viste Cyclin B1 overekspresjon var verken forbundet med histopatologiske svulst funksjoner eller dårlig prognose ved kolorektalkreft, mens Jia-Qing et al. avslørte Cyclin B1 overekspresjon intensivert i løpet av kreftutvikling, men avtok under invasjonen, og deretter økte igjen i løpet av metastaser ved kolorektalkreft.
For å støtte våre forestillinger, rollen og mekanismen av cyclin B1 i metastase videre ble påvist i annen kolorektal kreft cellemodeller, p53
+ /+ HCT116, p53
– /- HCT116 og SW480. Vi gitt bevis for at knockdown av cyclin B1 uttrykk induserte flere celler til å infiltrere gjennom matrigel og transwell membranen er i alle tre kreftcellelinjer, viser at Cyclin B1 undertrykker kolorektal kreft metastase av negativt regulere celle migrasjon og invasjon. EMT hadde blitt implisert som den viktigste skritt i utviklingen av svulster mot invasjon og metastase [9]. E-cadherin var en kjent celle-celle adhesjonsmolekyl, som dannet epiteliale adherente veikryss og sequestrated CTNNB1. I EMT endringer, undertrykkelse av E-cadherin er et viktig skritt i utviklingen av mange kreftformer, inkludert tykktarmskreft [15, 46]. Det vil være av særlig betydning for å utforske den underliggende mekanisme som fører til E-cadherin undertrykkelse. Til tross for mange molekyler har blitt identifisert til å modulere E-cadherin uttrykk [17, 47, 48], er flere studier fortsatt nødvendig for å belyse viktige signalmolekyler for regulering E-cadherin. Her viste vi at Cyclin B1 deltatt i reguleringen av E-cadherin uttrykk. Hemming av Cyclin B1 downregulated E-cadherin protein i p53
+ /+ HCT116, p53
– /- HCT116 og SW480 celler. I tillegg har in vivo-xenograft-analyser viste også E-cadherin nivå var signifikant redusert i syklin B1-undertrykkende p53
+ /+ HCT116 og SW480 tumorer, sammenlignet med respektive styre tumorer.
