Abstract
Om lag 500 000 personer diagnostisert med blærekreft i USA krever rutine cystoskopisk oppfølging for å overvåke sykdoms tilbakefall eller progresjon, noe som resulterer i over $ 2 milliarder i årlig utgifter. Identifisering av nye diagnostiske og overvåkingsstrategier er strengt nødvendig, og markører knyttet til DNA-metylering endringer holde store løftet på grunn av sin stabilitet, objektiv måling, og kjente assosiasjoner med sykdommen og med sine kliniske funksjoner. For å identifisere nye epigenetiske markører for aggressiv blærekreft, benyttet vi en high-throughput DNA metylering perle-array i to distinkte populasjonsbasert serie hendelsen blærekreft (n = 73 og n = 264, henholdsvis). Vi deretter validert sammenhengen mellom metylering av disse kandidat loci med svulst karakter i en tredje populasjon (n = 245) gjennom bisulfite pyrosekvensering av kandidat loci. Array baserte analyser identifisert fem loci for ytterligere bekreftelse med bisulfit pyrosekvensering. Vi identifiserte og bekreftet at økt arrangøren metylering av
HOXB2
er betydelig og uavhengig assosiert med invasiv blærekreft og metylering av
HOXB2
,
KRT13 Hotell og
FRZB
sammen betydelig forutsi høyverdig non-invasiv sykdom. Metylering av disse genene kan være nyttig som kliniske markører for sykdommen og kan peke på gener og trasé verdig ekstra eksamens som nye mål for terapeutisk behandling
Citation. Marsit CJ, Houseman EA, Christensen BC, Gagne L , Wrensch MR, Nelson HH, et al. (2010) Identifisering av denaturert gener assosiert med aggressiv blærekreft. PLoS ONE 5 (8): e12334. doi: 10,1371 /journal.pone.0012334
Redaktør: Michael Freitag, Oregon State University, USA
mottatt: Mai 17, 2010; Godkjent: 29 juli 2010; Publisert: 23 august 2010
Copyright: © 2010 Marsit et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Flight Attendant Medical Research Institute [YCSA 052341 til Mesowest]; og National Institutes of Health [R01CA121147, K07CA102327, og P42ES007373]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i USA i 2009 ble anslagsvis 71.000 kreft i urinblæren diagnostisert og større enn 14.000 dødsfall tilskrives denne sykdommen [1]. De aller fleste dødsfallene forekomme hos pasienter med hendelse høy scene, høy klasse, invasive svulster som infiltrerer muskel lag av blæren. Lav grad, non-invasiv sykdom, derimot, kan behandles med hell, men denne suksessen kommer på stor økonomisk byrde for helsevesenet. Omtrent 500 000 pasienter krever overvåking i USA fører til antatt diagnose til død per pasient koster alt fra $ 96,000 til $ 187 000, og dermed resultere i $ 2.2 milliarder i årlige utgifter, noe som gjør blærekreft den dyreste av alle krefttilfeller [2], [3]. Dermed vil kostnadseffektive prognostiske strategier for evaluering av innfallende og tilbakevendende sykdom være av betydelig klinisk anvendelighet.
epigenetisk kontroll av DNA uttrykk er velkjent for å drive føtal utviklings differensiering. I en parallell måte, på konsert med genetiske hendelser (mutasjon, sletting og Geneamplifikasjon) er det tenkt at epigenetiske forandringer kan utløse viktige patologiske trekk ved ondartet degenerasjon [4]. Blærekreft, med sine divergerende kliniske (og patologiske) fenotyper, presenterer en tumormodell som kan oppstå ved inaktivering av loci som uavhengig av hverandre styrer den tilbøyelighet for invasjon og dermed dikterer stadium og grad, og at denne inaktivering kan forekomme gjennom en rekke epigenetiske prosesser, inkludert mikroRNA endringer [5], endringer i kromatin [6], [7], og endringer i DNA metylering [8]. I dette tilfelle er det potensial for bruk av epigenetiske forandringer og spesielt DNA CpG metylering som biomarkører for kreft i urinblæren, så vel som, eventuelt, for en rekke andre humane cancere [8], [9], [10], [ ,,,0],11], [12], [13], [14]. Microarray-baserte tilnærminger har også forsøkt å identifisere nye gener assosiert med invasiv sykdom, men med begrensede utvalgsstørrelser på grunn av matrisen strategi ansatt [15]. Den siste utviklingen i array-tilnærminger åpner for anvendelse av disse teknologiene til populasjonsbaserte epidemiologiske studier av kreft utnytte store mengder prøver [16], [17], [18]. Det er mange fordeler med å benytte en populasjonsbasert tilnærming, blant annet reduksjon i bias, større generalizability av resultatene, og tilgang til prøvene som spenner over alle faser og grader av svulsten. Derfor har vi utnyttet denne matrisen basert tilnærming for å identifisere klinisk og biologisk informative mønstre og nye genet mål av DNA CpG metylering i en populasjonsbasert serie blære overgangsordning celle carcinoma.
Resultater
identifisering av kandidat loci
Vi utnyttet en to-trinns tilnærming til identifisering og validering av loci som var assosiert med utvikling av blærekreft (Figur S1). I trinn 1, ble to uavhengige serier av tumorer (tabell 1) analysert ved DNA-metylering matrise for å identifisere potensiell kandidat loci å ha differensial metylering, og i trinn 2, ble disse kandidatene bekreftet i en ytterligere serie av tumorer ikke profilerte på matrisen.
Totalt var det en generell økning i metylering i invasive svulster (Figur 1a), noe som tyder på at denne tilnærmingen har verktøy for avgrensning av effektive biomarkører. Generaliserte lineære modeller sammenligne metylering nivåer av invasiv versus ikke-invasive svulster på hvert locus bekreftet denne visuelle inntrykket. I serien 1, hadde 445 CpG loci betydelig økt metylering i invasiv sammenlignet med ikke-invasive tumorer (
Q
0,05), mens bare 68 loci hadde betydelig redusert metylering. Tilsvarende, i serie 2, 606 loci var signifikant økt metylering og bare 41 hadde signifikant redusert metylering (tabell S1). Modellering hver serie, uavhengig av hverandre, med rekursivt partisjonert blandingsmodeller ga fire metylering profiler (figur 1B). Spesielt, betydelig mer invasive svulster var i metylering klasse 4 (P 0,00001, permutasjon chi-kvadrat)
(A) scatterplot av gjennomsnittlig metylering betaverdier i ikke-invasive svulster i blæren (x-aksen) og gjennomsnittlig. metylering betaverdier i invasive svulster (y-akse) i serie 1 (n = 73) og serie 2 (n = 264) prøver. (B) Rekursive skillevegg blandingsmodeller av hver serie resultere i 4 klasser adskilt av røde vertikale linjer, med bredden av klassene som svarer til antallet av sampler i hver klasse. Loci er representert som rader med gjennomsnitts metylering for klassen avbildet. Over hver klasse er utbredelsen av invasive tumorer (n invasiv /totalt n) i klassen. Metylering profiler vesentlig skille blære svulst fra ikke-syk blære epitel (P 0,00001)
Å identifisere loci mest robust assosiert med invasiv sykdom, vi benyttet 3 forskjellige, vanligvis anvendt statistiske metoder for å identifisere dem. genloci (fra hver av de tre statistiske tilnærminger og på tvers av to serier) som overlappes i differensierende invasiv og ikke-invasiv sykdom. Fem loci (
FRZB
_E186,
HOXB2
_P99,
KRT13
_P676,
RIPK1
_P868,
STAT5A
_P704) ble funnet å bli assosiert med invasiv sykdom i alle tre statistiske tilnærminger.
for fire av disse loci (
FRZB
,
STAT5A
,
KRT13
, og
HOXB2
), bisulfitt pyrosekvensering analysene var i stand til å være utformet, og ble brukt til å bekrefte oppstillings funn i en undergruppe av blæren svulster undersøkt på tabellen. En pyrosekvensering analyse for
RIPK1
kunne ikke være vellykket utformet. For alle CpG nettsider undersøkt, samt gjennomsnittet på tvers av nettsteder for
FRZB
,
KRT13
, og
HOXB2
, observerte vi betydelig større metylering i invasiv sammenlignet med ikke- invasive svulster, i samsvar med oppstillings resultater (figur S2A, S2C, S2D). For
STAT5A
vi bekreftet den betydelig større grad av metylering på den spesielle CpG nettstedet målt ved array, men ikke observere denne foreningen i nabo CpG områder (Fig S2B), og så dette loci var ikke videre undersøkt.
Behandling av en blærekreft cellelinje med metylering Inhibitor fører til Re-uttrykk for HOXB2
pyrosekvensering ble utført for å bestemme metylering status for
HOXB2
,
FRZB
, og
KRT13
i blæren kreft cellelinjer HTB-9 og UM-UC3. HTB-9 hadde en HOXB2 metylering grad av 68,9, tilsvarende det som hadde blitt observert blant primær blære tumorprøver, og dermed ble valgt for videre undersøkelse. Behandling av HTB-9 celler med 1 eller 2 mikrometer 5-aza-2′-deoxycytidine førte til en økning på mer enn 100 ganger uttrykk for HOXB2 forhold til mock-behandlede celler (figur 2).
Kvantitativ RT -PCR-analyse ble brukt for å bestemme genekspresjon av
HOXB2
i human blærekarsinom-cellelinjen HTB-9, etter en 5 dagers behandling med 1 eller 2 uM 5-aza-2′-deoksycytidin eller mock behandlings . Barer representerer gjennomsnittet ganger endring i uttrykket i forhold til mock behandling for 4 eller 6 replikere eksperimenter, og feilfelt betegne standardfeil.
HOXB2 Metylering er uavhengig assosiert med invasiv blærekreft
pyrosekvensering av promotorområdene av
FRZB
,
KRT13
, og
HOXB2
ble utført i en uavhengig serie med 263 blære kreftpasienter ikke undersøkt på tabellen samt på 4 ikke-syke tumorprøver hentet fra NDRI. Omfanget av metyleringen ved pyrosequenced regionene i ikke-syk blære epitel, er ikke-invasive tumorer til invasive tumorer er vist på figur 3, og åpenbarer signifikante forskjeller i metylering på tvers av de i 3 kategorier for hver av de gener (
HOXB2
P 0,00001,
KRT13
P 0,05,
FRZB
P 0,003, Kruskal Wallis Test). Metylering av
HOXB2 Hotell og
KRT13
er hver signifikant større i invasiv sammenlignet med ikke-invasive tumorer (beskyttet Wilcoxon rang summer test, P 0,00001 og P 0,02 henholdsvis). TP53 immunhistokjemisk (IHC) fargeintensitet har tidligere blitt assosiert med en mer aggressiv sykdom [19], [20], og vi følger denne variabelen når vi utført logistisk regresjon forutsi invasiv sykdom, for hver av de loci individuelt, dichotomizing metylering omfang på medianen, og kontrollerer for andre potensielle confounders. I modeller kontrollerte for alder, kjønn og TP53 immunhistokjemisk farging intensitet av svulsten, bare
HOXB2
promoter metylering viste en uavhengig forening med invasive svulster (tabell 2). Svulster med
HOXB2
metylering hadde en OR på 7,7 (95% KI 3,3, 18,2) for å være en invasiv svulst. Dette resultatet holdt opp i en modell kontrollerende for alle 3 loci samt TP53 IHC fargeintensitet og pasientens alder og kjønn, der
HOXB2
metylering var assosiert med en 8,6 ganger økt risiko for å bli en invasiv tumor (95% CI 3,4, 21,7).
den gjennomsnittlige (fylt sirkel) og 95% konfidensintervall av omfanget av metylering av promotorområdene av (A)
FRZB
, (B)
KRT13
, og (C)
HOXB2
er avbildet (y-aksen) som sammenligner ikke-syke blære epitel, ikke-invasive svulster og invasive svulster (x-aksen). Forskjellene i omfanget av metylering tvers av disse gruppene er signifikant forskjellig (Kruskal-Wallis test), for
HOXB2 product: (P 0,00001) og
KRT13 product: (P 0,04), og
FRZB product: (P 0,003). Sammenligninger spesielt av ikke-invasiv forhold til invasiv sykdom viste også betydelige forskjeller for
HOXB2 product: * P 0,00001 og
KRT13
** P. 0,02
metylering av HOXB2, FRZB, og KRT13 er forbundet med aggressiv ikke-invasiv blærekreft
Som vi er interessert i å bestemme hvordan metylering bidrar til progresjon og aggressivitet av svulster, undersøkte vi sammenhengen mellom metylering omfang og tumor grad innenfor de ikke-invasive svulster. Figur 4 viser at det er betydelig større grad av metylering av
HOXB2 product: (P 0,01),
KRT13 product: (P 0,01) og
KRT13 product: (P = 0,0001) i høy grad (3) sammenlignet med lav karakter (1,2) ikke-invasive svulster. For å kontrollere for potensielle confounding, utførte vi multivariabel logistisk regresjonsanalyse for å undersøke sammenhengen mellom genet promoter metylering omfang og svulst klasse. I utgangspunktet modellert vi hvert gen promoter individuelt, og observert signifikante assosiasjoner mellom
FRZB plakater (OR 2,9, 95% KI 1,1, 7,9), og
KRT13 plakater (OR 3,3, 95% KI 1,1, 10.1), men bare en border signifikant sammenheng mellom
HOXB2
metylering og høy tumor Karakter (OR 2,6, 95% KI 0,9, 6,9, Tabell S2). Vi undersøkte de additive effekter av metylering av disse tre loci ved å modellere sammenhengen mellom metylering av alle tre loci forhold til å ha ingen, en eller to metylert og høy grad av ikke-invasiv sykdom (tabell 3). Kontrollert for alder, kjønn og TP53 IHC fargeintensitet, ble metylering av alle tre loci forbundet med en signifikant 7,4 ganger økt risiko for å være en høy grad av tumor (95% CI 2,5, 22,1).
Den gjennomsnittlige ( fylt sirkel) og 95% konfidensintervall av omfanget av metylering av promotorområdene av (A)
FRZB
, (B)
KRT13
, og (C)
HOXB2
er avbildet (y-aksen) som sammenligner lav (1,2) til høy (3+) grade tumorer (x-aksen). P-verdier som følge av Wilcoxon Rank summene viser at disse forskjellene er vesentlige for
HOXB2 product: (P 0,01),
KRT13 product: (P 0,01) og
FRZB product: ( P = 0,0001).
Diskusjoner
i forhold til gen-uttrykk basert markører, DNA metylering mønstre er mer stabil og kan påvises ved hjelp av ulike metoder som krever relativt små mengder pasientmaterialer. I tillegg kan disse markører objektivt identifisert og kvantifisert, og gir potensial for forbedring pålitelighet i histologiske diagnoser personlige slik som tumor karakterer eller i forhold til immunhistokjemisk fargingsmønstre som baserer seg på individuell tolkning av intensitet og plassering av farging. For eksempel, markører identifisert og uavhengig er validert i denne studien hold løftet som biomarkører som er nyttige i blærekreft, screening og oppfølging for tilbakefall og progresjon og kan brukes og testet for klinisk anvendelse i lett for å samle urin sedimenter [9], [10 ], [11], [13], [21]. I tillegg oppdagelsen av gener og stier epigenetiske endres i blæren svulster foreslå nye mål for terapeutisk intervensjon, spesielt når de vurderer dårlig prognose assosiert med invasiv blærekreft. Identifisering av viktige og nyttige DNA metylering basert markører er ikke uten utfordring, særlig ettersom det er ofte en høy grad av korrelasjon mellom disse endringene [22]. Derfor egnede statistiske metoder må benyttes for å undersøke disse endringene og å identifisere de endringer som har størst klinisk nytte. Vi mener at vår to trinns tilnærming gir den mest robuste og generaliseres identifisering av DNA metylering endringer som kan bli ytterligere undersøkt i prospektive studier. Ved hjelp av flere ulike statistiske tilnærminger, vårt utvalg strategi for informative markører mulig for oss å identifisere et håndterlig antall potensielt nyttige og robuste biomarkører for laboratorium validering samt replikering i uavhengige utvalg. Viktigst, vår validering av disse markørene i en uavhengig gruppe pasienter gir overbevisende bevis for deres potensielle nytteverdi og biologisk betydning.
Tidligere studier som undersøker paneler av kandidatgener har identifisert spesifikke gener og paneler av loci som er forutsigbare for både tilstedeværelse av tumor når den undersøkes i urinsediment [23] og progresjonen fra ikke-invasiv til invasiv sykdom [15], [24], [25], [26] ved undersøkelse i tumorvevet. Spesifikke gener som
RASSF1A
,
R R
,
BAMBI Hotell og
SFRP
familie har vært forbundet med høyere kvalitet og høyere stadium av blærekreft [8 ], [27], [28]. Vår strategi ikke identifisere disse spesifikke gener, og dette avviket kan skyldes en rekke forskjeller mellom vår tilnærming og de som tidligere utnyttet. Vi har gjort bruk av en populasjonsbasert pasientserier prøven, mens mange tidligere studier har benyttet sykehusbasert bekvemmelighet serien, og dermed kan ha hatt noen skjevhet introdusert i prøvene som ble undersøkt. Matrisen plattformen som brukes i denne studien er begrenset ved at den undersøker bare en undergruppe av alle gener og bare 1 eller 2 bestemte CpG nettsteder for disse genene, og dermed kan gå glipp av de spesifikke gener loci tidligere beskrevet. Til slutt, vår analytisk tilnærming, da den er basert på identifisering av paneler av gener kan identifisere forskjellige loci enn de som brukes i kandidat analyser, men hypermethylation av de tidligere beskrevne kandidater, kan faktisk være sterkt korrelert til metylering mønstrene som er identifisert heri . Videre studier kombinere tidligere identifisert loci med våre egne nye mål i en prospektiv måte er nødvendig for å mer definitivt fastslå de loci med størst klinisk nytte.
De biologiske fundamentet for non-invasiv ennå tilbakevendende sykdom versus invasiv sykdom gjenstår å ikke helt klarlagt [29]. Våre funn tyder på at det er store forskjeller i metylering mellom invasive og ikke-invasive svulster, med invasive svulster som utviser en generell økning i metylering sammenlignet med ikke-invasive svulster. Som DNA-metylering som til enhver CpG er en binær mål (enten cytosin er denaturert eller ikke) forskjellen i graden av metylering kan reflektere potensielt større homogenitet i valget av epigenetiske endrede celler i utvikling av invasiv sykdom, et resultat i samsvar med vårt tidligere arbeid undersøker bare en begrenset panel av genet promotorer i en enkelt serie av blæretumorer [14]. Dette større grad av metylering kan kjøre funksjonene av invasiv fenotype, eller alternativt kan være en konsekvens av selektive presset knyttet til denne fenotype. Selv om vår tilnærming i å undersøke hendelsen sykdom ikke fullt ut kan skille disse mulighetene, det gir data illustrerende for det presserende behovet for videre undersøkelse av denne epigenetisk fenomen.
Identifikasjon av spesifikke gener som DNA metylering mønsteret er assosiert med kreft fenotyper, inkludert stadium og grad belyser også de spesielt viktige biologiske prosesser og trasé som kreves for tilblivelsen av disse histologisk definerte vev stater.
FRZB
genet (også kjent som
SFRP3
) er medlem av det utskilte frizzled reseptoren familie av løselige proteiner som binder seg til og motvirker Wnt reseptor. Vi og andre har tidligere vist at hypermethylation av
SFRP
gener er sterkt og signifikant assosiert med blærekreft, noe som bekrefter viktigheten av denne reaksjonsveien i denne fenotypen [8], [12]. Av de
SFRP
gener, bare
SFRP1
, (i tillegg til
FRZB
) er profilert på tabellen, og på et annet CpG sted enn prim brukes i vår og tidligere rapporter om sin metylering [8], [30]. Dette kan forklare hvorfor denne loci ikke ble identifisert i vår screening tilnærming. Ekstra, mer genomisk tett gransking av Wnt veien er berettiget, da dette kan foreslå en ny rute for terapeutisk intervensjon for denne sykdommen.
HOXB2
er medlem av homeobox familien av transkripsjonsfaktorer , og er kodet på kromosom 17 som en del av et gen klynge med andre familiemedlemmer HOX. Interessant, ser vi at ikke-syke blære epitel har en lignende grad av metylering på
HOXB2 Hotell og
KRT13
som ikke-invasiv sykdom, mens på
FRZB
den ikke -diseased vev har en betydelig lavere grad av metylering enn en av de 2 tumortyper. Vi har også observere i den menneskelige blærekarsinom-cellelinjen HTB-9, som oppviser en grad av metylering lik den som er observert i invasive tumorer, som behandling med metylering inhibitoren 5-aza-2′-deoksycytidin fører til øket ekspresjon av
HOXB2
, noe som tyder på at metylering av dette genet kan være funksjonelt fører til inaktivering av dette gen. Resultatene i
HOXB2
er i overensstemmelse med litteraturen som har beskrevet et bivalent domene struktur av kromatin av homeobox gener, karakterisert ved at både pluripotent og terminalt differensierte vev oppviser merker for både aktiv og undertrykkende kromatin innenfor den samme region [31 ], [32], og dermed en mellomliggende grad av DNA-metylering. Invasive blærekreft vises målrettet for hypermethylation i denne regionen, et fenomen tidligere rapportert over polycomb gruppe kontrollerte gener i kolorektal kreft celler [33]. En slik differensial endring av en viktig utviklings genet kan være avgjørende i å definere fenotyper av disse svulstene og forklare atferd og resultatet fra disse ulike former av denne sykdommen.
KRT13
koder cytokeratin-13 som har vist seg å ha bestemt uttrykk i cervical squamous svulster og i mucinkjertler livmorhals typen adenokarsinomer [34]; til vår kunnskap, har epigenetiske endringer i dette genet ikke blitt rapportert. Epigenetisk endring av dette genet kan påvirke sitt uttrykk mønster, og slike endringer kan være tegn på en mer de-differensiert fenotype, anses karakteristisk for aggressive, høye svulster klasse.
Vi demonstrert i en uavhengig bekreftelse rekke svulster som graden av metylering av
HOXB2
og
FRZB
er assosiert med tumor grad, uavhengig av hverandre og av TP53 protein immunhistokjemisk farging. TP53 fargingen har tidligere blitt undersøkt og har blitt sies å være et nyttig prognostisk markør i denne sykdommen [35], [36], [37], selv om det er motstridende data på sin nytte [36], [38], [39], [40]. En fersk meta-analyse undersøke sin nytte tyder på at det ikke er hensiktsmessig bevis som tyder på bruk av denne markøren klinisk [20], fordi det kan gi noe tillegg prognostisk informasjon annet enn en sterk tilknytning til invasiv fenotype av sykdommen [41], [ ,,,0],42]. Vi kan ennå ikke foreslå at markørene oppdaget ved hjelp av vår tilnærming holde noe mer klinisk nytte enn patologiske gradering og iscenesettelse av svulster, men vi tror at våre data tyder på spesifikke cellulære veier som er forstyrret i denne sykdommen. Dermed kan disse banene bli utforsket intensivt som nye mål for terapeutiske strategier. I tillegg foreslår vi at fremtidig arbeid, undersøke nytten av disse markørene i en prospektiv måte er nødvendig, da de kan være nyttig for å bestemme hvilke svulster kan utvikle seg. Faktisk kan disse markørene også bidra til kliniske arbeidet med å følge pasienter med mindre invasive metoder, for å finne ut om deres svulsten har tilbakefall eller kommet, og dermed krever mer aggressive behandlingsmetoder.
Metoder
Studiepopulasjon og Sample Konstatering
Alle deltakerne i studien forutsatt skriftlig informert samtykke under godkjenning av de institusjonelle gjennomgang styrene i Dartmouth Medical School og Brown University. Vi utnyttet to, uavhengig, ikke-sammenhengende populasjonsbasert serie blære krefttilfeller. Den første, som består av svulster fra 344 personer involvert i en case-kontrollstudie av hendelsen blærekreft i New Hampshire, diagnostisert mellom juli 1994 og juni 1998 [43], og den andre består av svulster fra 264 personer diagnostisert mellom 1 januar 2002 til 30 juli 2004 [44]. Selv separat i tid og omfang, disse to studiene benyttet identisk rekrutteringsprosedyrer og studie personell samt identiske protokoller for konstatering av patologi materialer for molekylære undersøkelser. Blæren svulster fra begge seriene ble anmeldt av studien patologen (A.R.S.) og klassifisert i henhold til de 1973 og 2004 World Health Organization retningslinjer for blæren svulster. Studien patolog identifisert den aktuelle blokken hvorfra tumorprøver anvendt i disse analysene ble oppnådd, og den andel av maligne celler i hver prøve ble beregnet. Alle prøver som brukes i undersøkelsen inneholdt 75% tumorprøve. Carcinoma in situ ble ekskludert fra analysen på grunn av begrenset utvalgsstørrelsen. Tabell 1 beskriver egenskapene til de fagene som inngår i den endelige analysen. I tillegg ble fire ikke-syke blære epitel prøver hentet fra National Disease Forskning Interchange (NDRI) alle fra obduksjons eksemplarer av personer som ikke har en diagnose av kreft.
DNA Extraction og Metylering Analyse
tumorsnitt med den største andelen av ondartet vev ble utvalgt ved undersøkelsen patolog for anvendelse i våre molekylære analyser. DNA ble ekstrahert og natriumbisulfitt modifisert ved å følge standard fremgangsmåter som beskrevet i Marsit, et al. [18]. Totalt 82 svulster fra den første serien og alle 264 svulster fra den andre serien ble profilert for metylering status på 1505 CpG loci ved hjelp av Illumina GoldenGate® metylering perle arrays. Perler arrays ble kjørt ved UCSF Institutt for Human Genetics, Genomics Kjerne Facility i henhold til produsentens protokoll og som beskrevet i Bibikova, et al. [45].
Statistisk analyse
Vi samlet data med BeadStudio Metylering programvare fra tabellen produsenten (Illumina, San Diego, California) og kvalitetsvurdering utført som i Christensen et al. [16] som resulterer i syv prøver (9%), hvor 75% av loci hadde en påvisning p-verdi 1 * 10
-5, som er utelatt fra analysen. En tilsvarende kvalitetskontroll for CpG loci eliminert de loci med median deteksjon p-verdi 0,05 (n = 8, 0,5%)
Senere analyser ble utført i R Package.. For utforsk /visualisering formål, ble hierarkisk clustering hjelp av Manhattan metriske og gjennomsnittlig kobling utført. For locus av locus analyser, ble foreninger ved enkelte CpG loci testet med en generalisert lineær modell (GLM). Under forutsetning av at den gjennomsnittlige betaverdiene følger en betafordeling [46], en kvasi-binomial modell (logit link, binomial varians, og ikke-enhet skala parameter) ble brukt; Merk at logit koblingen funksjon pålegger en passende begrensning på at gjennomsnittlig beta. For å justere for multiple sammenligninger i å skanne 1413 autosomal CpG loci, P-verdier for assosiasjoner mellom gjennomsnittlig beta og invasiv sykdom brukt falske funnraten korreksjon og q-verdier beregnet av
qvalue
pakke i R. En FDR q -verdi av. 0,05 ble ansett som vesentlig for denne undersøkelsen
Tilfeldige Skoger product: [47] (https://www.math.usu.edu/~adele/forests/), ble brukt til å bygge classifiers av invasiv scenen (versus ikke-invasiv) av CpG gjennomsnittlig betaverdier. Undersøkelsen er gjennomført i R med
randomForest
pakke (versjon 4,5 til 18) ved Liaw og Wiener. Ved hver node i treet, et tilfeldig utvalg av
m
ut av den totale
M
variabler ble valgt og den beste splitten er funnet blant de
m
variabler. Standardverdien for
m
i Random Forest R pakken er. I denne analysen vi testet et utvalg av
m
fra halvparten av til to ganger og brukt
m Hotell som ga lavest prediksjonsfeil; i dette tilfellet
m
= 38. OOB feilrate er prosentandelen av tid RF prediksjon er feil. En test for sammenheng mellom metylering (prediktorer) og prøvetype ble utført ved å sammenligne OOB innhentet på datasettet med null distribusjon av OOB feil framstilt ved permutasjon sample typen etiketter og kjører RF prosedyren 100 ganger. Vi har også brukt andre serie av 264 svulster som en valideringssettet, beregning av feilrate som alle tre er konstruert, for å oppnå en estimert feilrate uavhengig av den første serie. Til slutt brukte vi de variable betydning score, prosent endring i gjennomsnittlig squared error (MSE), for å identifisere loci som hadde størst innflytelse på klassifisering, ved å velge de loci som prosentvis endring i MSE var større enn 5%.
for slutning, data ble samlet ved bruk av en blanding modell [48] med en blanding av beta-fordelinger [49], og antall klasser ble bestemt ved Bayesian informasjon kriterium (BIC) [50], [51]. Blandingen modellen ble passe ved rekursivt å partisjonere data ved hjelp av en to-klasse blanding modell, med en variant av BIC brukes som et kriterium for splitt, slik det er beskrevet i [46]. Klasse medlemskap ble innhentet fra blandingen modellen ved hjelp av en empirisk Bayes prosedyre, og senere assosiasjoner med invasiv scenen ble testet via permutasjon test med 10.000 permutasjoner hver bruker standard chi-kvadrat godhet-of-fit test. Utgangen av blandingsmodeller inkluderer en klasse-spesifikke beta distribusjon
F
jk
for hvert locus
j Hotell og klasse
k
. Disse fordelingene innebærer en mottaker driftskurve (ROC) for å skille to klasser
k Hotell og
l
av forholdet eller, avhengig av hva kurven ligger over identiteten linje. I begge tilfeller, til det areal-under-ROC (AUC), beregnet som, som kan brukes til å bestemme innvirkningen av locus
j
på skillet mellom klassene
k
og
l
. En lignende fremgangsmåte kan anvendes for å skille klasse
k
fra de andre: vi bruke en vanlig tilnærming
G
jk
for fordeling av de andre enn
k
, og beregne. Vi deretter rangert hvert locus j av sin beregnede AUC
jk, og valgt de med AUC . 0,90
For å identifisere loci for etterfølgende godkjenning som predikator for invasiv vs. non-invasiv sykdom, vi beregnet krysset av den loci som var mest signifikante (Q 0,05) i det geometriske sted-ved-locus analyse, topp rangering loci fra RF-analyse (% endring i MSE 6%), og den loci har AUC 0,75 for å skille klassen av interesse i forhold til andre i hver svulst serien, og deretter identifisert disse loci overlappende i begge seriene.
bisulfite pyrosekvensering
Kvantifisering av cytosin prosent metylering ble utført av pyrosekvensering sulfitt-konverterte DNA ved hjelp av PyroMark MD pyrosekvensering system (Qiagen, Valencia, CA).
