Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom er preget av omfattende lokal tumorinvasjon, metastase og tidlig systemisk spredning. De aller fleste av kreft i bukspyttkjertelen (Paca) pasienter som allerede har metastatisk komplikasjoner ved diagnosetidspunktet, og dødeligheten av denne dødelige typen kreft har økt de siste tiårene. Dermed forsøk på å identifisere romanen molekylært målrettet terapi er prioriteringer. Nylige studier har antydet at serotonin (5-HT) bidrar til den tumorvekst i en rekke kreftformer, inkludert prostata, tykktarm, blære og leverkreft. Det er imidlertid mangel på bevis om virkningen av 5-HT-reseptorer på å fremme kreft i bukspyttkjertelen. Etter å ha vurdert rollen til 5-HT-1-reseptorer, spesielt 5-HT
1B og 5-HT
1D subtyper i ulike typer kreftsykdom som er målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer i Paca vekst og progresjon og analysere sitt potensial som cytotoksiske mål. Vi fant at knockdown av 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer uttrykk, med bestemte små interfererende RNA (siRNA), indusert signifikant hemming av spredning og clonogenicity av Paca celler. Også, det undertrykte betydelig Paca celler invasjon og redusert aktivitet av uPAR /MMP-2 signal og Inte /src /Fak-mediert signalering, som integrerte tumorcelle trasé i forbindelse med invasjonen, migrasjon, heft og spredning. Videre rettet mot 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer nedregulerer sink finger ZEB1 og Snail proteiner, kjennetegnene transkripsjonsfaktorer som regulerer epitel-mesenchymale overgang (EMT), samtidig med opp-regulering av claudin- 1 og E-cadherin. Som konklusjon, tyder våre data på at 5-HT
1B- og 5-HT
1D-mediert signalisering spiller en viktig rolle i reguleringen av den proliferative og invasive fenotype av paca. Den viser også terapeutiske potensialet for målretting av 5-HT
1B /1D reseptorer i behandlingen av Paca, og åpner en ny vei for biomarkører identifikasjon, og verdifulle nye terapeutiske mål for håndtering av kreft i bukspyttkjertelen.
Citation: Gurbuz N, Ashour AA, Alpay SN, Ozpolat B (2014) nedregulering av 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer hemmer spredning, Clonogenicity og Invasion of human kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 9 (8): e105245. doi: 10,1371 /journal.pone.0105245
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 13 mars 2014; Godkjent: 21 juli 2014; Publisert: 29 august 2014
Copyright: © 2014 Gurbuz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av The Texas Senter for kreftnanomedisin (TCCN), en National Cancer Institute (NCI) Senter for nanoteknologi (454CA151668), og av siRNA senterets prosjekt, MD Anderson Cancer Center, UT, Houston, Texas, USA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (Paca), som har en sterk invasiv kapasitet med hyppige metastaser og tilbakefall, er kjent for å være en av de mest dødelige kreft hos mennesker med mindre enn 5% 5-års overlevelse [1]. Selv om det bare rangerer tiende i forekomst blant de vanligste kreft hos mennesker, er Paca den fjerde største årsaken til kreft dødsfall i vestlige land og sin dødsraten har ikke gått ned i løpet av de siste tiårene [2], [3]. Samlet har Paca ca 100% dødelighet fordi det er generelt oppdaget på forhånd stadier siden det vanligvis ikke forårsaker noen symptomer på tidligere stadier [4]. Paca er egentlig motstandsdyktig mot apoptose og dårlig reagerer på eksisterende behandlingsformer, inkludert kombinerte kjemoterapeutiske regimer [5]. For å overvinne dette globalt helseproblem, er undersøkelsene fokusert på identifisering av nye molekylære mål å utvikle nye behandlingsstrategier.
mitogen nevrotransmitter, serotonin (5-HT) var tidligere kjent for å fungerer som en vekstfaktor [ ,,,0],6] for flere typer ikke-tumorceller (for eksempel vaskulære glatte muskelceller, lungefibroblaster og nyre mesangiale celler) [7], [8], og tumorceller (for eksempel pankreatiske karsinoide celler, liten celle lunge carcinoma celler og kolorektal karsinom) [9], [10], [11]. Nylig har 5-HT dukket opp som en viktig regulator av cellevekst og tumorvekst i en rekke forskjellige krefttyper [12], [13], [14], [15]. I løpet av tumorprogresjon, tyrosin hydroksylase, det hastighetsbegrensende enzym i den serotonin biosyntesebanen, blir ofte oppregulert [16]. Viktigere, har ulike 5-HT-reseptorer blitt identifisert (5-HT-1-7) basert på deres strukturelle, funksjonelle og farmakologiske egenskaper [17], [18]. Seks av familiene til 5-HT reseptorer er G-protein-koblet, inkludert Gi: 5-HT-1, Gs: 5-HT-4,6,7, og Gq /11: 5-HT-2,5. Bare 5-HT-3 er entydig en ligand-gated kation kanal, i forbindelse med nikotin acetylkolin reseptor [16]. 5-HT-reseptorer er videre delt inn i forskjellige subtyper, f.eks 5-HT-1-familien har fem undergrupper [18], bestående av 5-HT-1A, -1B, -1D, -1E og -1F reseptorer og par fortrinnsvis til Gi /o for å inhibere cAMP-dannelse [19], [20 ]. Spesielt, den humane 5-HT
1B og 5-HT-
1D-reseptorer er spesielt tilsvarende i sekvens til tross for å være kodet for av to forskjellige gener. Den nøyaktige funksjon av disse reseptorene forblir udefinert, og fremgang mot dette har vært hemmet av mangel på selektive ligander [21]. Det ble tidligere vist at 5-HT-1-reseptorer er i utstrakt uttrykt i den humane brystcancer [22], prostatakreft [23] og blærecancerceller [18], noe som kan forklare den mitogene effekten av agonister av disse reseptorer i slike kreftformer. Kreft i bukspyttkjertelen forskning har hovedsakelig fokusert på studiet av genmutasjoner og signaltransduksjonsveier i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) celler, mens den potensielle rolle nevrotransmitterreseptorer i utvikling og progresjon av denne dødelige neoplastisk sykdom har vært stor grad ignorert [4]. Gitt den potensielle engasjement av 5-HT-1-reseptorer signaliserer til spredning av flere typer kreft, med ukjente implikasjoner av disse reseptorer på PACA-progresjon, undersøkte vi her rollen som 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer i proliferasjon og invasive fenotype av PACA.
lokal invasjon kan betraktes som en første og nødvendig element i malignitet av karsinomer, som fører til genereringen av vanligvis dødelig fjern metastase. For kreftceller å invadere fjerne vev, har de til å trenge inn i omgivende ekstracellulære matriser. Slike kreftcelle /ECM-interaksjoner er tilrettelagt av integrinfamilien av celleadhesjonsmolekyler inkludert tyrosin-fosforylerte substrater (tyrosin kinase Src og fokal adhesjonskinase) [24]. Inte er trans-membran a /p heterodimere reseptorer som medierer celle-celle interaksjoner og celle vedlegg til ekstracellulære matriks (ECM) [25], og de fungerer som reseptorer for noen ECM proteiner (f.eks fibronektin, vitronektin, laminin og kollagen) [ ,,,0],26]. Altered integrin aktivitet eller affinitet substrat kan bidra til den neoplastiske fenotypen. Normalt er mobilnettet Src holdt i en inaktiv tilstand, men i flere krefttyper, unormale hendelser fører til forhøyet kinase aktivitet av protein og forårsake pleiotrope cellulære responser som induserer transformasjon og metastasering [27].
Som karsinomer fremgang, svulstene kan miste epitelial morfologi og skaffe mesenchymale egenskaper som bidrar til metastatisk potensial. En epitelial til mesenchymal overgang (EMT), en kritisk prosess i likhet med prosessen med embryoutvikling, er antatt å være en viktig mekanisme for å fremme kreftinvasjon og metastase [28]. I de senere årene har ZEB familie av sink finger transkripsjonsfaktorer er dokumentert som viktige spillere i EMT [29]. Den epitelial vedheft protein, E-cadherin, er en aktiv suppressor av invasjon og vekst av mange epiteliale kreftformer, og dens nedregule regnes et kjennetegn på EMT [30], [31]. E-cadherin er et viktig mål gen av ZEB familietranskripsjons repressors. EMT-induserende mediatorer, for eksempel TCF8, utløse epitel dedifferentiation ved å svekke uttrykket /funksjon av E-cadherin [32]. De E-cadherin repressors kan regulere utviklingstranskripsjons programmer av EMT i kreftceller som disponerer dem til invasjon og metastasering [33]. Dermed mutasjoner i ZEB koding gener knytte disse faktorene til ondartet svulst progresjon [29].
Den aktuelle studien fokusert på å undersøke hvilken rolle 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer på Paca spredning og invasjon. Våre data viser vesentlige reduksjoner i PACA-celler vekst, invasjon og korrelert nedstrøms signalisering i respons til nedregulering av disse serotoninreseptorer uttrykk, noe som tyder på betydelig involvering av disse reseptorene i å fremme kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP, dyrkningsforhold og reagenser
Den menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ble hentet fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). PANC-1 og MIAPaCa-2-celler ble dyrket i DMEM /F12 supplert med 10% FBS. Alle medier inneholder penicillin og streptomycin (100 enheter /ml). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2/95% luft, og ble anvendt mellom passasjene 4 og 15. Menneske pankreasgang epitelceller (HPDE) celler ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Kapil Mehta, Institutt for eksperimentell Terapeutisk, MD Anderson Cancer Center, som en sjenerøs gave. HPDE-celler ble opprettholdt i keratinocytt serumfritt medium (SFM keratinocytt-, 1X) inneholdende L-glutamin, og supplert med prekvalifisert human rekombinant epidermal vekstfaktor 1-53 (EGF 1-53) og 25 mg /500 ml bovint hypofyseekstrakt ( BPE) (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, California). NF-kB-aktivering inhibitor II, JSH-23 (4-metyl-N
1- (3-fenylpropyl) benzen-1,2-diamin) (EMD Millipore Billerica, MA), ble oppløst i DMSO til en endelig lager konsentrasjon på 10 mM, og direkte lagt til cellekulturer på 25 og 50 mikrometer konsentrasjoner, som selektivt blokkerer kjernefysisk translokasjon av NF-kB p-65 og dens transkripsjonsaktivitet.
transfections med siRNA
eksponensielt voksende ubehandlede PANC-1 og MIAPaCa-2-celler ble sådd ut 24 timer før transfeksjon. Pletterte celler ble transfektert med dobbelt-trådet siRNA rettet mot mRNA’et av de serotonergiske reseptorer (5-HT-1) undertypen -B eller -D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), eller transfektert med kontroll (ikke-demping) siRNA; (5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 «) [34], [35] (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). siRNA rettet mot vev transglutaminase (TG2) (Qiagen, Valencia, CA) ble også benyttet [35]. -Celler ble transfektert med enten siRNA, ved en sluttkonsentrasjon på 25 til 50 nM i 72 timer, ved hjelp av HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens protokoll. Konsentrasjonene av sirnas ble valgt basert på dose-responsstudier. Ikke stanse kontroll siRNA-transfekterte celler ble brukt som negative kontroller. Etter behandling ble cellene høstet /behandlet for videre analyse og analyser.
Celleviabilitet og spredning /vekstanalyser
levedyktighet og /eller spredning av celler ble oppdaget av MTS analyse (Promega, Madison, WI, USA), etter behandling celler, for å måle cellevekst. Cellene ble tellet ved bruk av et hemocytometer, og levedyktige celler ble identifisert ved trypan blå eksklusjon. Levedyktige celler ble sådd i 96-brønns plater (1,5 x 10
3 celler /brønn) og transfekteres med indikerte sirnas. Etter 72 timers behandling ble en oppløsning inneholdende MTS (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-karboksy-metoksyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) og PMS ( fenazin metosulfat) (20:01 v /v) ble tilsatt til cellene. Etter 2-3 timers inkubering ved 37 ° C, ble de levedyktige celler i vekst estimert ved å overvåke absorpsjonen av produktet ved 490 nm, basert på generering av formazanet via levende celler. Alle forsøk ble utført in triplo, og resultatene ble angitt som middelverdi av absorpsjon ± standard avvik.
klonogene overlevelsesanalyse
PACA-celler ble sådd i 6-brønn plater (1,5 x 10
3 celler /brønn), transfektert med ikke-stanse kontroll siRNA, eller siRNA mot 5-HT
1B eller 5-HT
1D (gang /uke), og dyrket i 2 uker. De dannede-kolonier ble farget med krystallfiolett og koloniene-området distribusjons regioner ble målt densitometrically [36]. Hvert forsøk ble utført i tre paralleller, og resultatene ble angitt som middelverdi av absorpsjon ± standard avvik.
Matrigel invasjon assay
PACA-celler ble transfektert med 50 nM av angitte sirnas, og 72 timer senere, like mange av de behandlede levedyktige celler (4 × 10
4 celler), ble sådd på Matrigel-belagte Transwells (med 8- mikrometer pore størrelse filtre) i Matrigel invasjonen kamre (BD Biosciences, San Jose, California). Antallet celler som invaderte den nedre side av membranen etter 24 timer ble bestemt ved å telle cellene i minimum fire tilfeldig utvalgte områder. Forsøkene ble utført in triplo, og resultatene ble angitt som middelverdi av prosentandeler av invasjon ± standardavvik.
Migration Assay
In-vitro
sårhelende assay ble benyttet for å vurdere celle motilitet og evnen til å migrere. PANC-1-celler ble sådd ut i 6-brønns plater (5 x 10
5-celler /brønn) og dyrket i et medium inneholdende 10% FBS for å oppnå en nesten sammenflytende cellemonolag. En ripe ble deretter forsiktig gjort på cellelaget ved hjelp av et 10 mL sterilt mikropipette spissen, og en hvilken som helst cellerester ble fjernet ved vasking med PBS for å fjerne flytende celler. De sårede monolag ble deretter transfektert med 50 nm angitt siRNAs. Umiddelbart etter behandlingene, cellene ble fotografert ved hjelp av et fasekontrastmikroskop (Nikon), for å bestemme såret bredde på tidspunktet 0. Kulturene ble fortsatt, og cellene ble fotografert på nytt etter 12 timer og etter 24 timer for å såre cellen lag. Den sårheling ble visualisert ved å sammenligne fotografier tatt ved 0 timer med de som er tatt etter 12 timer og 24 timer senere, og analysert med hensyn til avstanden migrerte ved den fremre kant av såret ved hvert tidspunkt. Avstanden som cellene ble bestemt ved måling av såret bredde på tidspunktet 12 timer og 24 timer, og subtrahere det fra såret bredde på tidspunktet 0. De oppnådde verdier ble deretter uttrykt som% migrasjon, innstilling av spaltebredden ved 0 h som 100%. Tre forsøk ble gjort i tre eksemplarer.
Vest-blot analyse
Celler ble sådd i 25-cm
2 kulturflasker (0,5 × 10
6 celler /kolbe). Etter behandling ble cellene samlet opp, sentrifugert, vasket to ganger i iskald PBS og hel-cellelysater ble oppnådd ved suspendering av cellene i en lyseringsbuffer ved 4 ° C. Lysatene ble sentrifugert ved 13.000 g i 10 min ved 4 ° C, og de overliggende fraksjoner ble oppsamlet. Total proteinkonsentrasjon for hver prøve ble bestemt ved en detergent kompatibel proteinanalysesett (Bio-Rad, Hercules, CA), og Western blotting ble utført som 40 ug protein /kjørefelt på 4-15% SDS-PAGE-gel. Proteinene ble elektro-overført til PVDF-membraner og ble først inkubert med følgende primære antistoffer; p-Src (Tyr-416), Src, β1 integrin, uPAR, MMP-2, sneglen, TCF8 /ZEB1, NF-kB (p-105 /p-50), og claudin-1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); p-FAK (Tyr-397), FAK (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ); 5-HT
1B (Sigma Chemical, St. Louis, MO); TG2 og α-SMA (Abcam, Cambridge, MA); Fibronectin og 5-HT
1D (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og deretter med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin eller anti-mus sekundært antistoff (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). β-aktin (Sigma Chemical, St. Louis, MO), eller α-β-Tubulin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) ble brukt som laste kontroller. Alle antistoffer ble fortynnet i TBS-Tween 20 som inneholdt 5% tørrmelk. Kjemiluminescens deteksjon ble utført med Chemi-gløden gjenkjenning reagenser (Alpha Innotech, San Leandro, CA), og blotter ble visualisert med en FluorChem 8900 imager, og kvantifisert ved et densitometer hjelp av bildeanalyseprogram (ImageJ 1,48s prosessering programvare, National Institutes Helse, Bethesda, MD, USA). Alle forsøkene ble uavhengig gjentas minst to ganger.
Omvendt fase protein arrays (RPPA)
De siRNA-transfektert PANC-1 celler (0,5 × 10
6 celler /2 ml medier) ble sådd i 6-brønns plate. Etter 72 timers inkubering ble cellene vasket to ganger med PBS, og 150 pl av lyseringsbuffer [1% Triton X-100, 50 mM Hepes (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM EGTA , 100 mM NaF, 10 mM Sod. pyrofosfat, 1 mM Na
3VO
4 og 10% glycerol, som inneholder proteinase og fosfatase-hemmere (Roche Applied Science, Indianapolis)] ble tilsatt til hver brønn. Cellelysatene ble samlet, og RPPA ble behandlet som tidligere beskrevet [35].
RNA isolering og revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse
Totalt RNA ble isolert fra innsamlede celler med TRIzol Reagens (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, California), og cDNA ble hentet fra en mikrogram total RNA ved hjelp RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). CDNA for 5-HT
1B, 5-HT
1D, β1 inte ble TG2 og GAPDH forsterket ved hjelp av Platinum Taq DNA Polymerase kit (Invitrogen /Life Technologies), med spesifikke primere. Kort sagt ble 2 ul av den totale 20 ul av revers-transkribert produkt som benyttes for PCR i 1 x PCR-buffer inneholdende 1,5 mM MgCb
2, 200 mM deoksynukleotidtrifosfater (dNTP), en enhet av platina Taq-polymerase, og 0,2 pM av hver angitte primere (Integrated DNA Technologies, IDT), eller GAPDH-spesifikke primere (Thermo Scientific). Sekvensene til den forstand og anti-sense 5-HT
1B primere 5′-TGCTGGTTATGCTATTGGCG-3 «; og 5»-GATGACACAGAGGTGCAGGATG-3 «, henholdsvis. Sekvensene til den forstand og anti-sense 5-HT
1D primere 5′-TGCCGTGGTCCTTTCCGTC-3 «; og 5»-GGTGATGGTATAGGCGATGCTG-3 «, henholdsvis. Sekvensene til den forstand og anti-sense-ß1 integrin primere 5»-CCTACTTCTGCACGATGTGATG-3 «; og 5»-CCTTTGCTACGGTTGGTTACATT-3 «, henholdsvis. Sekvensene til den forstand og anti-sense primere TG2 er 5»-TAAGAGATGCTGTGGAGGAG-3 «; og 5»-CGAGCCCTGGTAGATAAA-3 «, henholdsvis. CDNA-prøvene ble inkubert ved 94 ° C (2-5 min.) For å denaturere malen og aktivere enzymet. Dette trinn ble etterfulgt av 35 sykluser med PCR-amplifikasjon (for eksempel 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 60 s med 5-HT
1B primer; 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 60 s med TG2 primer; 94 ° C i 30 s, 58 ° C i 45 s og 72 ° C i 60 s med 5-HT
1D og ß1 integrin primere, i hver syklus). PCR-reaksjonen ble avsluttet med en endelig forlengelse trinn i 5 min. ved 72 ° C. De amplifiserte Reaksjonsproduktene ble analysert på en 1,2% agarosegel inneholdende etidiumbromid. CDNA-syntese ble bekreftet ved påvisning av GAPDH-transkript som ble brukt som en intern kontroll.
Statistisk analyse
Dataene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter og statistisk analysen ble utført ved hjelp av Student
t
-test, for å fastslå statistisk signifikans. P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant og er markert med en stjerne.
Resultater
5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer overexpressed i bukspyttkjertelkreft cellene
Økt 5-hydroksytryptamin-biosyntese-kapasitet, så vel som alvorlige endringer i uttrykket mønstre av 5-HT-reseptorene, er tidligere blitt rapportert i løpet av utviklingen av brystcancer [16]. Her, evaluerte vi ekspresjon av 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer i forskjellige PACA-celler så vel som i normale humane pankreasgang epitelceller (HPDE) celler. Vi har funnet at disse reseptorene er oppregulert i alle PACA-celler som ble testet, å sammenlikne med den lave ekspresjon i normal pankreas epitel (fig. 1A), noe som tyder på at den dys gulering av disse reseptorene kan fremme aliserte tjeneste tumorprogresjon i PACA-celler.
(A) 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer sterkt uttrykt i flere bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Cellelysater av flere PACA-cellelinjer og normale humane pankreasgang epitelceller (HPDE) celler ble underkastet Western blot-analyse som angitt. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B-C) 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer uttrykk nivåer i PANC-1 (B) og MIAPaCa-2-celler (C) etter knockdown av reseptorer uttrykket med de tilsvarende sirnas. -Celler ble transfektert med 50 nM av angitte sirnas, og 72 timer senere, cellelysatene ble underkastet Western blot-analyse. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. Histogrammene viser den relative kvantifisering av de angitte proteiner nivåer. (D-E) mRNA-ekspresjon av 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer i PANC-1 (D) og MIAPaCa-2-celler (E) etter knockdown av reseptorer uttrykket med de tilsvarende sirnas. -Celler ble transfektert med 50 nM av angitte sirnas, og 72 timer senere ble total-RNA ble ekstrahert og transkripsjonsnivåer av 5-HT
1B og 5-HT
1D ble bestemt ved standard RT-PCR som beskrevet i Materialer og metoder. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (F-G) siRNA-mediert 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer knockdown hemmer Paca celler spredning. PANC-1 (F) og MIAPaCa-2-celler (G) ble transfektert med 50 nM av angitte sirnas, og etter 72 timer ble proliferasjonen målt ved en MTS-analyse. Data er representert som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05 vs kontrollceller. Alle forsøkene ble uavhengig utført tre ganger.
knockdown av 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer uttrykk hemmer spredning /levedyktighet Paca celler
forsøkte å undersøke involveringen av disse reseptorene i spredning og vekst av PACA-celler. Mot dette formål, vi slått ned uttrykket av hver reseptor subtype i PANC-en og MIAPaCa-2 celler, med bestemte små interfererende RNA (siRNA). Til tross for at kodet for av to forskjellige gener, den humane 5-HT
1B og 5-HT-
1D-reseptorer er spesielt tilsvarende i sekvens [21]. Derfor, som vist i figur 1B og C, 5-HT
1B siRNA behandlinger førte til en relativt lavere ekspresjon av 5-HT
1D proteinnivå, med en tilsvarende lavere 5-HT
1B proteinnivåer fremkalt av 5-HT
1D siRNA. Dette kan tilskrives det faktum at både 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer subtyper har en høy aminosyresekvens-identitet (~68% aminosyresekvenshomologi), har lignende ligand-bindingsegenskaper og er nesten utvisket farmakologisk [37]. Slike likheter-induserte interaksjoner mellom de to reseptortyper på proteinnivået kan være oppstått etter genekspresjon (f.eks, under protein modning eller folding). Derfor deteksjon av reseptorer proteinekspresjon ved Western-blotting var ikke helt tilstrekkelig for å skille disse nærstående reseptor-subtyper til å etablere sine respektive fysiologiske relevans. For å overvinne et slikt problem for å undersøke de biologiske effektene av målretting hver subtype individuelt, anvendte vi RT-PCR-analyse og undersøkt effekten av siRNA behandlinger på transkripsjonsnivået av det tilsvarende genet subtype. Våre resultater viser klart at 5-HT
1B spesifikk siRNA og 5-HT
1D spesifikke siRNA ble bekreftet til å hemme ekspresjon av det tilsvarende mRNA uten noen vesentlig effekt på den andre tverr analoge subtype i både PANC-1 og MIAPaCa-2-cellelinjer (fig. 1D og E). Vi neste analysert spredning etter 72 timer av siRNA behandling av MTS analysen. Som vist på figur 1F og G, våre resultater viste at knockdown av 5-HT
1B og 5-HT
1D ekspresjon signifikant hemmet proliferasjonen av begge PANC-1 og MIAPaCa-2-celler. Den kombinerte nedregulering av både 5-HT
1B og 5-HT
1D subtyper hemmer proliferasjon mer enn nedregulering av enten reseptoren alene (figur S1), noe som tyder de biologiske fordeler som tilbys fra samtidig rettet mot begge reseptorer.
Målrette 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer hemmer celle clonogenicity av Paca celler
for å bekrefte rollen som 5-HT-1 serotonerge-reseptorer i ytterligere Paca celleproliferasjon og kolonidannelse, vi evaluert klonogene kapasitet på Paca celler etter knock-down av 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer uttrykk. Denne analysen er en
in-vitro
celleoverlevelsesanalyse basert på evnen av en enkelt celle for å vokse og danne foci i en koloni [36]. Knockdown av 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer, ved hjelp av deres spesifikke sirnas, markert hemmer evnen til PANC-1 og MIAPaCa-2-celler til å danne kolonier (fig. 2A og B, henholdsvis). Samlet er disse funnene tyder på at 5-HT
1B- og 5-HT
1D-mediert signalisering er involvert i spredning og klonogene evnen Paca celler.
PANC-1 (A) og MIAPaCa-2-celler (B) ble transfektert (gang /uke) med angitte sirnas. Cellene ble inkubert i 14 dager ble kolonier farget med krystallfiolett og koloniene-området fordelings regioner ble målt densitometrically ved slutten av de 14 dagene. Histogrammene viser prosentandelene av de dannede kolonier, etter 14 dager etter den første transfeksjon. Dataene er uttrykt som gjennomsnittet av prosentandeler av kolonidannelse ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 vs. kontrollceller
Målrette 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer hemmer celle invasjon /migrasjon av Paca celler
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom er karakterisert ved sterkt invasive fenotype, og sterkt metastatisk kapasitet [38]. Fordi ekspresjon av 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer er forhøyet i PACA-celler, bedømmes vi hvorvidt disse reseptorene er involvert i å fremme slike invasive fenotype. Derfor har vi slått ned disse reseptorene i PANC-en og MIAPaCa-2 celler ved sirnas og evaluert endringene i deres invasive evne av
in vitro
invasjonen analysen bruker Matrigel-belagte Boyden kamre. Denne analysen ligner
in vivo
invasjon prosess og måler antall kreftceller som passerer gjennom en basalmembran matrix mot medier som inneholder chemo-lokke [39]. Det mest slående funn var at knockdown av 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer betydelig redusert invasjonen av PANC-1-celler med omtrent 76% og 66%, henholdsvis (fig. 3A), og redusert invasjonen av MIAPaCa-2-cellene med omtrent 75% og 71%, henholdsvis (fig. 3B). Vi neste undersøkte involvering av 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer i medier PANC-en cellemotilitet bruker scratch analysen på 12 timer og 24 timer tidspunkter. Analysen viste at den avstand som dekkes av migrerende celler ble signifikant redusert når cellene transfektert med 5-HT
1B eller 5-HT
1D reseptorer sirnas i forhold til celler som eksponeres til den ikke-lyddemping kontroll siRNA (fig. 3C ). Disse resultatene viser en sammenheng mellom Paca celle motile atferd og 5-HT
1B /1D uttrykk. Alt i alt indikerer disse data at 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer spiller en rolle ved formidling av PACA-celler migrering og invasjon.
PANC-1-celler (A) og MIAPaCa-2- -celler (B) ble transfektert med 50 nM av angitte sirnas (i 72 timer), og et likt antall levedyktige celler ble sådd ut på Matrigel-belagte Transwell filtre i Matrigel invasjons kamre. Antallet av cellene som invaderte etter 24 timer ble bestemt som i protokollen. Forstørrelse, 100 ×. Histogrammene viser gjennomsnittet av prosentandeler av invasjon ± SD fra tre eksperimenter. * P 0,05 vs kontrollceller. (C) Involvering av 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer i regulering av PANC-1 celle motilitet som analyseres av sårtilhelingen analysen. En enkelt ripe ble gjort i midten av sammenflytende cellemonolag, og de sårede monolagene ble transfektert med angitte sirnas. Den sår reparasjon ble overvåket i 24 timer og visualisert mikroskopisk med originale forstørrelse × 100. Bilder ble tatt umiddelbart (0 h), og etter 12 timer og 24 timer for å skrape kulturene. Histogrammet viser prosentandeler av celler migrasjon, og dataene er uttrykt som gjennomsnittet av prosentandelene av migrering ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * Representerer signifikant forskjell mellom angitte gruppene (P 0,05).
5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer er involvert i reguleringen av β1 inte uttrykk i Paca Cells
Etter å ha funnet at 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer er over-uttrykt i Paca celler, tyder på betydelige endringer i vekstfremmende nedstrøms signalering, vi neste undersøkt noen nedstrøms molekylære effekter av knockdown av disse reseptorene. Integrinfamilien av trans-membranreseptorer forbinder den ekstracellulære matriks (ECM) til det intracellulære aktin cytoskjelettet ved knutepunkter adhesjon interaksjonspunkter. I tillegg til dette strukturell rolle, kan integrin clustering initiere intracellulære signaleringshendelser som fremmer cellevekst, overlevelse og migrasjon i både normale og tumorigen celle sammenhenger [40]. Fra inte familie, er β1-subtype kjent for å indusere Src og FAK aktivitet gjennom rekruttering og aktivering av Src /FAK dual kinase kompleks [41]. Fordi, nedregulering av 5-HT
1B /1D-reseptorer undertrykker PACA-cellemigrering /invasjon (fig. 3), undersøkte vi hvorvidt disse reseptorene regulere ekspresjonen av integrin β1. Vi anvendte Western blot og RT-PCR-analyse for å bestemme ekspresjonen av integrin β1 protein og mRNA-nivåer henholdsvis, etter at tie disse reseptorene. Har vi funnet at 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer knockdown vesentlig indusere nedregulering av β1 integrin ekspresjon ved både protein og mRNA-nivå i begge PANC-1 og MIAPaCa-2-celler (Fig. 4A og B).
(A-B) effekten av sirnas-mediert 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer nedregulering på β1 integrin /ECM-mediert nedstrøms signalisering i PANC 1 (A) og MIAPaCa-2-celler (B). (Øvre panel) celler ble transfektert med 50 nM av angitte sirnas, og etter 72 timer ble det totale RNA ekstrahert og transkripsjonsnivåer av 5-HT
1B og 5-HT
1D ble bestemt ved standard RT- PCR som beskrevet i materialer og metoder. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (Nedre panel) celler ble transfektert med 50 nM av angitte sirnas, og etter 72 timer ble cellelysatene underkastet Western blot-analyse. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. (C-D) Effekten av 5-HT
1B og 5-HT
1D-reseptorer nedregulering på EMT prosess i PANC-1 (C) og MIAPaCa-2-celler (D). Stanse av 5-HT
1B og 5-HT
1D reseptorer øke uttrykket av EMT tight junction protein, claudin-en, og redusere sink finger ZEB1 transkripsjonsfaktorer, TCF8 og sneglen. p-aktin ble brukt som lasting kontroll.
