Abstract
Warburg effekten, en av kjennetegnene for kreftceller, er preget av metabolsk bryter fra mitokondriell oksidativ fosforylering til aerob glykolyse. I de senere år økt ekspresjonsnivå av pyruvat kinase M2 (PKM2) er blitt funnet å være den skyldige av forbedret aerob glykolyse i kreftceller. Men det er ikke noe middel hemme aerob glykolyse ved å målrette PKM2. I denne studien fant vi at oleanolic syre (OA) induserte en bryter fra PKM2 til PKM1, og konsekvent, opphevet Warburg effekten i kreftceller. Undertrykkelse av aerob glykolyse av OA er mediert av PKM2 /PKM1 bryteren. Videre ble mTOR signale funnet å bli inaktivert i OA-behandlede kreftceller, og mTOR-hemming er nødvendig for virkningen av OA på PKM2 /PKM1 bryteren. Redusert uttrykk for c-myc-avhengige hnRNPA1 og hnRNPA1 var ansvarlig for OA-indusert bytte mellom PKM isoformer. Kollektivt, identifiserte vi at OA er en antitumorforbindelse som undertrykker aerobic glykolyse i kreftceller, og det er mulighet for at PKM2 kan utvikles som et viktig mål i aerob glykolyse vei for å utvikle nye legemidler mot kreft
Citation. Liu J Wu N, Ma L, Liu M, Liu G, Zhang Y, et al. (2014) oleanolsyre undertrykker Aerobic glykolyse i kreftceller ved å bytte pyruvatkinase type M isoformer. PLoS ONE 9 (3): e91606. doi: 10,1371 /journal.pone.0091606
Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 06.11.2013; Godkjent: 12 februar 2014; Publisert: 13 mars 2014
Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av nasjonale innovative narkotika utviklingsprosjekter (2014ZX-09102043-001). Studien ble også støttet delvis av National Foundation of Natural Sci. of China (81302906, 81273550 og 41306157, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aerobic glykolyse, også kjent som Warburg effekten, er etablert som et kjennetegn på kreftceller [1]. Nesten alle typer kreftceller endre sin metabolisme ved å øke glykolyse og undertrykke mitokondriell oksidativ fosforylering, selv under normoksisk betingelser (derfor definert som aerob glykolyse) [2]. Mange glykolytiske mellomprodukter er uunnværlig for syntese av molekyler som er viktig for cellulære strukturer og funksjoner, så som nukleotider, aminosyrer og lipider. Dermed svært prolifererende kreftcellene møte deres krav til mobilnettet byggevarer ved å bytte sin metabolisme fra oksidativ fosforylering til glykolyse, selv om ATP produksjonen er mindre effektiv i glycolytic prosessen.
PKM
genet koder for to proteiner kinaser, PKM1 og PKM2, og disse kinaser er også ansvarlig for omdannelsen av fosfoenolpyruvat (PEP) til pyruvat som kan anvendes for produksjon av melkesyre eller enter mitokondriell oksidativ fosforylering. PKM1 og PKM2 genereres ved eksklusiv mRNA-spleising (ekson 9 for PKM1 og ekson 10 for PKM2) [3]. https://en.wikipedia.org/wiki/PKM2 – cite_note-Corcoran-5PKM1 er katalytisk mer aktiv enn PKM2. PKM2 uttrykkes i alle celler med en høy grad av nukleinsyresyntese [4]. Kreftceller benytter PKM2 for å samle de mellomprodukter for syntese av nukleinsyre og proteiner og opprettholde aerob glykolyse [5]. Økende PKM2 aktivitet eller bytte mRNA spleising fra PKM2 til PKM1 er i stand til å undertrykke Warburg effekt, og følgelig kompromiss tumorvekst [6]. Derfor er PKM2 antas å et lovende mål innen kreftterapi. Imidlertid har forbindelser som kan øke forholdet mellom PKM1 til PKM2 ikke blitt funnet.
oleanolic syrer (OA) er fordelt vidt i mange planter, og det har blitt godt dokumentert at OA viser anti-tumor-aktivitet til et utvalg av menneskelige kreftceller. Tidligere studie i vårt laboratorium har vist at behandling av menneskelige bukspyttkjertelen pan-28 kreftceller fører til apoptose via mitokondrie medierte apoptotiske sti [7]. En annen studie viser også at OA kan hemme metastase på glioma celler [8]. Imidlertid er målet for OA har ikke vært godt identifisert. I denne studien fant vi at OA kan undertrykke aerob glykolyse ved å undertrykke PKM2 uttrykk og berørte
PKM
mRNA spleising gjennom mTOR /c-myc /hnRNP signalering.
Metoder og materialer
Cell Culture and Chemical Compounds
human prostata carcinoma cellelinje, PC-3 og human brystcancer cellelinje MCF-7, ble innkjøpt fra American Type Culture Collection C (ATCC). PC-3-celler ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO-BRL) ved 37 ° C under en fuktig 5% CO
2 tilstand. MCF-7 celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM).
oleanolsyre (OA) ble innkjøpt fra Sigma Aldrich (O5504, St. Louis, MO). OA ble utarbeidet i DMSO ved en konsentrasjon på 10 mg /ml som stamløsning.
Cell Transfeksjon
Plasmider, inkludert pWZL Neo Myr Flag PKM2 og pMXs-hcMYC ble oppnådd fra Addgene (Cambridge, MA). pcDNA Flag GFP (Flag-GFP) ble bevart i vårt laboratorium og ble brukt som kontroll. Celle transfeksjon ble utført ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Kort sagt ble PC-3 eller MCF-7-celler sådd ut på en 96-brønns plate. Når cellene er dyrket til tilnærmet 85% konfluens, ble mediet erstattet med OPTI-MEM. Deretter ble 3 pg plasmider og 30 pl lipofektamin-reagens blandes i et rør inneholdende 1500 ul OPTI-MEM ved kraftig virvling. Etter inkubering i 15 minutter ble blandingen tilsatt til cellekulturene og inkubert i visse tider.
immunoblotting Analyser
Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 1000 g i 10 minutter og lysert med M- PER pattedyr Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, IL). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av BCA protein assay kit (Thermo Scientific, FL). Det totale protein ble separert med elektroforese med 10-12% polyakrylamidgel og overført på 0,45 um nitrocellulosemembraner. Membranene ble inkubert i blokkeringsløsning (PBS, 0,1% Tween-20, og 5% fettfri tørrmelkpulver) i 2 timer ved romtemperatur, og deretter inkubert med primære antistoffer (1:1000). Etter inkubering over natten, ble membranene vasket med PBS inneholdende 0,1% Tween-20 til tre ganger, og deretter ble det inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (IgG geite-anti-kanin eller anti-mus; 1:2000; Bio-Rad , CA) i 1 time ved romtemperatur. Proteinbåndene ble visualisert med SuperSignal West Dura Utvidet Varighet substrat (Thermo Scientific, IL). Intensiteten av blotter ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare
Den primære antistoffer som brukes i vår studie var som følger:. PKM1 (# 7067, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), PKM2 (# 4053, Cell Signaling Technology , Danvers, MA), β-tubulin (# 2146, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Phospho-mTOR (Ser2448) (# 2971, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); mTOR (# 2983, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); c-myc, (sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas); hnRNP A1 (# 8443, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); hnRNP A2 (# 9304, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).
Immunofluorescensanalyse
PC-3 og MCF-7 celler (5 × 10
4 /brønn) ble sådd på 24-brønners plater, og deretter, OA (100 ug /ml) ble tilsatt. Etter 6 timers inkubasjon ble cellene fiksert med 4% Polyoxymethylene i 0,5 timer, etterfulgt av inkubasjon med PKM2 antistoff (1:1000) i 2 timer. Den tilsvarende sekundært antistoff ble tilsatt og inkubert i ytterligere 1 time for å visualisere PKM2. 4 «, ble 6»-diamidino-2-fenylindol (DAPI) brukes til å farge kjernene. Fluorescens ble oppdaget under en konfokal mikroskop (CLS-2SS, Thorlabs).
Stoffskifte Analyser
Analyser av O
2 innhold, pyruvat kinase (PK) aktivitet, glukoseopptak, laktat produksjon, og cellulær respirasjon ble brukt til å studere endringene i metabolsk bryter i kreftceller behandlet med OA. Den pyruvat-kinase (PK) Assay Kit (ab83432, Abcam) og OX-500 O
2 Microsensor (Unisense, Danmark) ble anvendt for å bestemme PK-aktivitet og O
2-innhold, henholdsvis i PC-3 og MCF -7 celle behandlet med OA, etter produsentens anvisninger.
for å måle glukoseopptak, PC-3 og MCF-7 ble sådd i en tetthet på 5 × 10
3 celler /brønn i 96- brønners plater. Etter inkubering over natten, ble cellene transfektert med visse plasmider eller behandlet med MHY1485. Deretter ble cellene behandlet med 50 eller 100 ug /ml OA, respektivt. Etter inkubasjon i 6 eller 12 timer ble kulturmediet høstet ved sentrifugering ved 3000 g i 15 min. Mengden av glukoseforbruk av de testede cancerceller ble påvist ved anvendelse av glukoseopptak Colorimetric Assay Kit I (# K676, BioVision, Milpitas, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Absorpsjonen tetthet (OD) ved 412 nm ble lest ved hjelp av en BioRad680 mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA).
produksjon av melkesyre ble bestemt ved hjelp av laktat Colorimetric Assay Kit II (# K627, BioVision , Milpitas, CA) som produsentens protokoller. I korthet, PC-3 og MCF-7 celler ble behandlet med pWZL Neo Myr Flag PKM2, pMXs-hcMYC og pcDNA Flag GFP i 72 timer eller MHY1485 i 1 time, respektivt. OA ble tilsatt ved de angitte konsentrasjoner og inkubert i de angitte tidsrom. Deretter ble kulturmedier ble oppsamlet ved sentrifugering ved 3000 g i 15 minutter, blandet med 45 ul av laktat målingsbuffer. Absorbansen ved 450 nm ble lest ved hjelp av en BioRad680 mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA).
oksygenforbruk ble undersøkt ved hjelp av oksygenforbruk Rate Assay Kit (# 600800, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI) etter produsentens anvisninger. VICTOR X3 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer) ble brukt til å detektere OD verdi på 650 nm. Den oksygenforbrukshastighet ble vist som livstid som funksjon av tid (us /hr).
kolonidannelse Assay
PC-3 eller MCF-7-celler ble sådd ut på en 6-brønners plate, og transfektert med plasmider, inkludert pWZL Neo Myr Flag PKM2 og pcDNA Flag GFP. Etter inkubering i visse tider, ble cellene trypsinert, suspendert i DMEM inneholdende 10% FBS, sådd ut på et bunnsjikt inneholdende 0,6% agar og dekket med et toppsjikt inneholdende 0,6% agar. Cellene ble dyrket i en 6-brønns plate og ble mediene skiftet ukentlig. Etter inkubering i 10 dager, ble det tilsatt krystallfiolett, og antallet kolonier ble tellet og analysert med ImageJ programvare.
Statistical Analysis
Forsøkene med unntak Immunoblotanalyse ble utført minst tre ganger. Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD, og sammenlignes på et gitt tidspunkt med uparet, to-halet t-test. Data ble ansett for å være statistisk signifikant når p 0,05 (*) og p. 0,01 (**)
Resultater
OA hemmer Aerobic glykolyse i kreftceller
Aerobic glykolyse er karakterisert ved økt glukoseopptak og laktatproduksjon, og kompromittert oksygenforbruk på kreftceller med høy tilgjengelighet for oksygen. Derfor, målte vi effekten av OA på disse aktivitetene av kreftcelle. Redusert glukoseforbruk ble funnet i flere typer kreftceller når OA ble tilsatt til kulturene (Fig. 1A). Produksjonen av melkesyre i disse kreftceller ble også funnet å være redusert i celler behandlet med OA (fig. 1B). Videre OA forbedret forbruket av oksygen i kreftceller (Fig. 1C). De ovennevnte data viser at OA var i stand til å indusere metabolske endringer av cancerceller ved å undertrykke aerob glykolyse.
glukoseforbruk (A), melkesyreproduksjon (B) og oksygenforbruk (C) ble vurdert i PC- 3 og MCF-7-celler behandlet med 50 eller 100 ug /ml OA til 6 eller 12 timer henholdsvis. Detaljene i metodikken er beskrevet i den delen av materialer og metoder. Forholdet mellom hver gruppe til kontroll ble presentert her. Barene viste gjennomsnittsverdiene av tre uavhengige forsøk (Mean ± SD). *, P 0,05; **, P . 0,01
I tillegg sammenlignet vi O
2 innhold i kreftceller med eller uten OA behandling. Dataene viste at OA har ingen innflytelse på konsentrasjonen av oksygen i cellekultur, og dermed utelukke muligheten for at OA føre til metabolsk endring ved å påvirke NorMIC forhold (Figur S1).
OA Induserer overgangen fra PKM2 til PKM1 og øke PK aktivitet i kreftceller
pyruvat kinase muskel isozyme 2 (PKM2), hvis enzymatisk aktivitet er mindre aktive enn PKM1, er ansvarlig for konvertering av phosphopyruvate til pyruvat i glycolytic prosessen. PKM2, spesielt i sin dimere form, akkumulerer glykolytiske mellomprodukter og kanaler dem inn i biosyntesen av nukleotid- og aminosyrer, for derved å bidra til vekst av celler. PKM2 har blitt funnet å være sterkt uttrykt i alle prolifererende celler, så som tumorceller [4]. For å identifisere de mekanismene som OA påvirket aerob glykolyse, vi deretter evaluert endringer i ekspresjonsnivået av PKM1 og PKM2 i kreftceller behandlet med OA. Den immunoblot-analyse viste at OA var i stand til å redusere PKM2 overflod, og øke PKM1 ekspresjon, i begge PC-3 og MCF-7cancer cellelinjer, i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 2A og 2B). Reduksjonen i PKM2 ekspresjon ble også funnet i immuno-fluorescensfarging eksperimenter. Behandlingen av kreftceller med OA nedregulert den PKM2 ekspresjon betydelig i begge PC-3 og MCF-7-celler (Fig. 2C). Videre ble PK-aktivitet er vist å være forhøyet i OA-behandlede kreftceller, sammen med bryteren fra PKM2 til PKM1 (figur S2A og S2B).
PKM1 og PKM2 ekspresjonsnivået ble evaluert ved immuno-analyser i PC- 3 og MCF-7-celler behandlet med 10, 25, 50 100 ug /ml OA henholdsvis i 12 timer (A) eller 100 ug /ml OA til 0,5, 1, 2, 3, 6, 12 timer henholdsvis (B). β-tubulin ble anvendt som endogene referanser. (C) De PKM2 nivåer (grønn) var i PC-3 og MCF-7-celler behandlet med 100 ug /ml OA i 12 timer henholdsvis, som bestemt ved immunfluorescent farging. Kjernene (Blue) ble farget med DAPI. De fusjonerte bildene ble vist i bunnen av panelet. Fluorescensintensiteten ble kvantifisert med ImageJ programvare. Forholdet mellom hver gruppe til kontroll ble presentert her. Barene representert gjennomsnittsverdiene av 5 tilfeldig utvalgte eksperimenter.
Økningen i PK aktivitet forårsaket av PKM2 /PKM1 Switch formidler OA Undertrykkelse av Aerob glykolyse
Basert på funn at bryteren fra PKM2 til PKM1 skjer i kreftceller behandlet med OA, vi senere undersøkt hvilken rolle increaed PK aktivitet i OA undertrykkelse av aerob glykolyse. PC-3-celler ble transfektert med PKM2- eller GFP-uttrykkende vektor før OA stimulering (Fig. 3A). OA-indusert økning i PK aktivitet ble reddet av PKM2 overekspresjon i PC-3 celler (Figur S3). Resultatene viste også at den glukoseforbruk, laktatproduksjon, så vel som oksygenforbruk ble alle gjenopprettet i celler som overuttrykker PKM2 (fig. 3B, 3C og 3D). Resultatene tyder på at økt PK-aktivitet på grunn av PKM2 /PKM1 bryteren er nødvendig for den inhiberende virkning av OA på aerob glykolyse i kreftceller.
(A) OA-behandlede PC-3-celler ble transfektert med pWZL Neo Myr Flag PKM2 (Flag-PKM2) eller kontroll vektor (Flag-GFP). Immunoblotanalyse analyser ble utført for å bestemme ekspresjon av PKM2 protein. β-tubulin ble anvendt som endogene referanser. Glukoseforbruk (B), melkesyreproduksjon (C) og oksygenforbruk (D) ble undersøkt i PC-3-celler behandlet med 100 ug /ml OA i 12 timer. Detaljene i metoden som er beskrevet i den delen av materialer og metoder. Forholdet mellom hver gruppe til kontroll ble presentert her. Barene viste gjennomsnittsverdiene av tre uavhengige forsøk (Mean ± SD). *, P 0,05; **, P . 0,01
OA Undertrykkelse av mTOR formidler Endring i uttrykket Profiler av PKM isoformer og Metabolsk Switch i kreftceller
Vi var interessert i hvordan OA indusert reduksjon i overgangen fra PKM2 til PKM1 i kreftceller. mTOR-signalering er blitt vist å delta i koplings av PKM-isoformer i kreftceller [9]. Derfor, vi har oppdaget endringer i aktiv status av mTOR i OA-behandlede kreftceller. Immunoblotting analyse viste at mTOR-aktivering ble redusert når OA ble tilsatt til kulturen i kreftceller (Fig. 4A). Reaktivere mTOR av MHY1485 beskyttet kreftceller fra OA-mediert nedgang i PKM2 uttrykk og økning i PKM1 nivåer (Fig. 4B). Vår videre studier viste at glukose forbruk, laktat produksjon og oksygenforbruk hastighet er også restaurert i celler behandlet med MHY1485 (fig. 4C, 4D og 4E). Resultatet viser at mTOR er ansvarlig for OA-indusert bryteren av PKM isoformer og metabolisme.
(A) Nivået av fosforylert mTOR ble undersøkt i PC-3 og MCF-7-celler behandlet med 50 eller 100 ug /ml OA til 6 eller 12 timer henholdsvis, som bestemt ved analyser Immunoblotanalyse. β-tubulin ble anvendt som endogene referanser. (B) Immunoblot-analyse av PKM1 og PKM2 ekspresjon ble utført i PC-3-celler inkubert med OA (100 ug /ml) og /eller en mTOR-aktivator MHY1485 (2 uM). Glukoseforbruk (C), melkesyreproduksjon (D) og oksygenforbruk (E) ble påvist i PC-3-celler behandlet med OA (100 ug /ml) og /eller MHY1485 (2 uM) i 12 timer. Forholdet mellom hver gruppe til kontroll ble presentert her. Barene viste gjennomsnittsverdiene av tre uavhengige forsøk (Mean ± SD). *, P 0,05; **, P . 0,01
OA-indusert mTOR Suppression Induserer the Switch av PKM isoformer ved å hemme c-myc-avhengige hnRNPA1 og hnRNPA2 Expression
mTOR har vist seg å heve PKM2 nivå ved å stimulere c-myc-avhengige hnRNPA1 og hnRNPA2 uttrykk [9], som begge er ansvarlig for den eksklusive skjøting av PKM mRNA [3]. Vi deretter bestemt påvirkning av OA på ekspresjonen av hnRNPA1 og hnRNPA2. Resultatene viste at OA kan redusere ekspresjonsnivået av c-Myc, så vel som dens målgen hnRNPA1 og hnRNPA2 ekspresjon (Fig. 5A). mTOR aktivering mediert av MHY1485 var i stand til å gjenopprette uttrykket av c-myc, hnRNPA1, og hnRNPA2 i OA-behandlede kreftceller (Fig. 5B). Videre transfeksjon av OA-behandlede kreftceller med plasmider som uttrykker c-Myc opphevet virkningen av OA på endringen i PKM1 og PKM2 uttrykk (fig. 5C). Resultatene tyder på at OA kan indusere PKM2 /PKM1 bryter via c-Myc-avhengige hnRNPA1 og hnRNPA2 mTOR signalveien.
(A) ekspresjon av c-myc, hnRNPA1 og hnRNPA2 ble bestemt ved immunoblotanalyse i PC- -3 og MCF-7-celler behandlet med 50 eller 100 ug /ml OA til 6 eller 12 timer henholdsvis. (B) Den expressionof c-Myc, hnRNPA1 og hnRNPA2 ekspresjon ble bestemt ved immunoblotanalyse i PC-3-celler behandlet med OA (100 ug /ml) eller /og henholdsvis MHY1485 (2 uM). (C) Nivået av c-Myc, hnRNPA1, hnRNPA2, PKM1 og PKM2 ble bestemt ved Immunoblotanalyse assays i PC-3-celler behandlet med plasmider pMXs-hcMYC (Flag-cMyc) i nærvær eller fravær av OA. β-tubulin ble brukt som endogene referanser.
Redusert Aerob glykolyse delvis regnskap for Anti-tumor aktivitet av OA
For å løse bidraget av nedsatt aerob glykolyse til tumor suppressor aktivitet OA på kreftceller, vi har oppdaget endringer i ondartede fenotyper av OA-stimulerte kreftceller som fortsatt gikk aerob glykolyse grunn PKM2 overekspresjon. OA ble funnet å redusere veksten av PC-3-celler (Fig. 6A). Dessuten er antall kolonier dannet i PC-3 celler, ble også redusert under behandlingen av OA (OA + GFP gruppe) (Fig. 6B). Men PKM2 restaurering avskaffet effekten av OA på kreftceller, dokumentert av økningen i veksttakten og antall dannet kolonier i PC-3 celler co-behandlet med OA og PKM2-uttrykke vektorer (OA + PKM2 gruppe) (signifikant fig. 6A og 6B).
(A) PC-3-celler ble tellet 12, 24, 36 og 48 timer etter behandling av OA (100 ug /ml) eller /og MHY1485 (2 uM) ved hjelp hemacytometry. De midlere verdier av tre uavhengige eksperimenter ble vist som gjennomsnitt ± SD. **, P 0,01. Representanten tallet ble vist for hver gruppe. (B) Celler ble behandlet med OA (100 ug /ml) eller /og MHY1485 (2 uM) i 10 dager, ble antallet av kolonier av PC-3-celler telles og analyseres ved hjelp av ImageJ programvare. Representanten tallet ble vist for hver gruppe. (C) OA undertrykker aktivering av mTOR i kreftceller. Denne hemmende virkning på mTOR signalering, i sin tur, oppheves c-Myc /hnRNPA1 /hnRNPA2-avhengig PKM2 uttrykk. Følgelig ble den aerobe glykolyse hemmet i kreftceller behandlet med OA.
I sammendraget, undertrykker OA aktivering av mTOR signalering i kreftceller. I sin tur, den hemmende effekten av OA på mTOR sti fører til overgangen fra PKM2 til PKM1 uttrykk, som er mediert av c-myc /hnRNPA1 /hnRNPA2 veien. Til slutt ble aerob glykolyse trykt i OA-behandlede kreftceller (Fig. 6C).
Diskusjoner
OA, en naturlig forbindelse utbredt i planter, er dokumentert å ha en rekke bioaktivitet inkludert anti-tumor egenskap [10]. Mekanismene for OA anti-tumoraktivitet involverer apoptose-induksjon, cellesyklus-stans og metastase hemming [7], [8]. Imidlertid er effekten av OA i den metabolske veien i kreftceller fremdeles uklar. I denne studien, har vi funnet at OA var i stand til å undertrykke Warburg virkning på kreftceller, vises ved økt oksygenforbruk, redusert laktatproduksjon og nedre glukoseopptak (Fig. 1A-1C). Så vidt vi vet er dette første gang å avsløre at OA påvirker metabolske bryteren av kreftceller. Våre funn kan bidra til forståelsen av OA virkning på kreftceller og bidra til utvikling av OA og dets derivater med mer potent effektivitet for klinisk anvendelse.
Aerob glykolysen antas å være en ny, effektiv og viktig mål i kreft kjemoterapi. Økende bevis tyder på at aerob glykolyse spiller en avgjørende rolle i utbruddet og progresjon av ondartede sykdommer. Flere forbindelser har blitt rapportert å undertrykke veksten av tumorceller ved å påvirke aerob glykolyse [11] – [15]. For tilfeller ble ekstraktet fra Spatholobus suberectus vist å inhibere aktiviteten av laktatdehydrogenase A (LDHA), for derved å undertrykke den aerobe glykolyse i brystkreftceller [13]. En anti-inflammatorisk forbindelse, curcumin, har nylig blitt vist å reversere Warburg effekt forårsaket av tumornekrosefaktor (TNF) stimulering i brystkreftceller [14]. Vår studie bekrefter at OA besitter også hemmende aktivitet på aerob glykolyse. Studien øker forståelsen av anticancer mekanisme av OA.
Mange studier har avdekket at PKM2 spiller en nøkkelrolle i aerob glykolyse i kreftceller [3]. I foreliggende studie har vi funnet at PKM2 uttrykket kan bli inhibert i celler behandlet med OA i en dose- og tidsavhengig måte (fig. 2A-2C). Enda viktigere, økt PK-aktivitet, på grunn av PKM2 /PKM1 bryteren, medierte effekten av OA på aerob glykolyse i kreftceller, siden reduksjon av PK-aktivitet ved å overuttrykke PKM2 nivå i kreftceller avskaffet OA-indusert metabolsk bryter (Fig. 3A-3D ). OA er derfor identifisert som den første forbindelse reduserende PKM2 overflod, og utøver sin virkning på metabolismen i kreftceller gjennom et nytt mål. Derfor tilbyr vi innledende bevis som målgruppe PKM2 kan være en roman strategi for å utvikle kreft agenter, og OA kan være en ledende sammensatt for å utvikle anti-kreft narkotika rettet mot PKM2.
Aberrant aktivering av mTOR signal er tett involvert i en rekke kreftformer [16]. mTOR aktivering fremmer resistensen av kreftceller til apoptose indusert av både cytokiner og kjemoterapeutiske midler, akselererer spredning av et bredt spekter av kreftceller, og letter metastase [16]. De fleste av de nåværende mTOR inhibitorer undertrykke veksten av kreftceller i første rekke ved å indusere apoptose og cellesyklusstans, eller svekke metastase [17] – [19]. I denne studien, har vi funnet at OA reduserer ekspresjonsnivået av fosforylert mTOR i kreftceller (Fig. 4A) forbundet med dens inhiberende aktivitet på aerob glykolyse. Nylig har mTOR signale vist seg å modulere det metabolske bryteren i kreftceller, og denne virkning er mediert av endringen i PKM2 uttrykk [14], [20], [21]. Videre er mTOR /PKM2 vei ansvarlig for, i det minste, lever tumorigenesis [22]. Disse nye funnene tyder på at målretting stoffskifte kan være en roman strategi mTOR-hemmer å undertrykke veksten av kreft.
Sammen viste vi bevis for at OA var i stand til å slå metabolske mønstre fra aerob glykolyse til oksidativ fosforylering gjennom å påvirke mTOR /c-Myc /PKM2 reaksjonsveien i kreftceller. Tatt i betraktning den lave giftighet for normalt vev, kan OA og dets analoges være en lovende kandidat middel for å utvikle kreftlegemidler rettet mot metabolisme. Våre studier bidra til en bedre forståelse av mekanismen av OAs antitumor eiendom, og også studien gir primære bevis for at PKM2 kan velges som en kritisk terapeutisk mål i aerob glykolyse vei i å utvikle nye legemidler mot kreft.
Støtte Informasjon
Figur S1.
OA mislyktes i å påvirke innholdet av oksygen i cellekultur. PC-3 og MCF-7 celler ble behandlet med eller uten OA i 12 timer. O
2 innhold ble påvist med på angitte tidspunkter. De gjennomsnittlige verdier av tre uavhengige forsøk ble vist som gjennomsnitt ± SD
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091606.s001 plakater (PPT)
Figur S2.
OA inkubasjon indusert heving i PK aktivitet i kreftceller. (A) PC-3 og MCF-7 celler ble behandlet med OA i de angitte doser, og PK-aktivitet ble bestemt 12 timer etter OA-behandlingen. De midlere verdier av tre uavhengige eksperimenter ble vist som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05, **, P 0,01. (B) Aktiviteten av PK ble også vurdert i kreftceller eksponert med 100 ug /ml OA ved de indikerte tidspunkter. De midlere verdier av tre uavhengige eksperimenter ble vist som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05, **, P 0,01
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091606.s002 plakater (PPT)
Figur S3.
PKM2 overekspresjon redde heving i PK aktivitet indusert av PKM2 /PKM1 bryteren. PK-aktivitet ble evaluert i OA-behandlede PC-3-celler transfektert med PKM2- eller GFP-uttrykkende vektor, 12 timer etter behandling med 100 ug /ml OA. De midlere verdier av tre uavhengige eksperimenter ble vist som gjennomsnitt ± SD. *, P 0,05
doi:. 10,1371 /journal.pone.0091606.s003 plakater (PPT)
