Abstract
Bakgrunn
emodin har blitt vist å indusere apoptose av kreft i bukspyttkjertelen -celler og hemmer tumorvekst i våre tidligere studier. Denne studien var designet for å undersøke om emodin kunne hemme angiogenese for kreft i bukspyttkjertelen vev og dens mekanisme.
Metodikk /Principal Finne
I tråd med vår forrige undersøkelse, emodin hemmet kreft i bukspyttkjertelen cellevekst, indusert apoptose, og forbedret anti-tumor effekt av gemcitabin på pankreas caner celler
in vitro
og
in vivo
ved å hemme aktiviteten av NF-kB. Her, for første gang, demonstrerte vi at emodin hemmet tumor angiogenese
in vitro
og i implanterte vev kreft i bukspyttkjertelen, redusert ekspresjon av angiogenese-assosierte faktorer (NF-kB og dens regulert faktorer VEGF, MMP-2- , MMP-9, og eNOS), og redusert eNOS fosforylering, som dokumentert av både immunhistokjemi og western blot analyse av implantert svulster. I tillegg fant vi at emodin hadde ingen effekt på VEGFR uttrykk
in vivo
.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater antydet at emodin har potensial anti-tumor effekt på bukspyttkjertelen kreft via sin dobbeltrolle i å fremme apoptose og undertrykkelse av angiogenese, sannsynligvis gjennom regulerer uttrykket av NF-kB og NF-kB-regulert angiogenese-forbundet faktorer
Citation. Lin SZ, Wei WT, Chen H, Chen KJ, Tong HF, Wang ZH, et al. (2012) Antitumor aktivitet av emodin mot bukspyttkjertelkreft avhenger av dobbeltrolle: Fremme av apoptose og Undertrykkelse av angiogenese. PLoS ONE 7 (8): e42146. doi: 10,1371 /journal.pone.0042146
Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Frankrike
mottatt: 22 mars 2012; Godkjent: 02.07.2012; Publisert: 02.08.2012
Copyright: © Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne er takknemlige for finansiell støtte fra: Administrasjon av tradisjonell kinesisk medisin av Zhengjing provinsen, Kina (Grant No. 2011ZZ010), Zhejiang Provincial Science Fund for Distinguished Young Scholars (Grant No. LR12H280001) og The Natural Science Foundation of China National (Grant Nei . 81173606). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Foreløpig er behandling av kreft i bukspyttkjertelen avhengig av kirurgisk reseksjon. Imidlertid er bare ca 25% av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er mulig for kirurgisk reseksjon på grunn av invasjon av kreft i bukspyttkjertelen. Mange pasienter med lokalavansert eller metastatisk kreft i bukspyttkjertelen er avhengige av gemcitabin kjemoterapi [1]. Men det er kreft i bukspyttkjertelen en representant for de mest vaskularisert og angiogene solide tumorer, som responderer dårlig på gemcitabin kjemoterapi. Tidligere studier har foreslått at behandling med gemcitabin resultater i median overlevelsestid på ca. 6,2 måneder [2]. Dermed søker nye behandlingsstrategier som mål å forbedre antiangiogene evne er presserende i klinisk praksis for å forbedre den terapeutiske effekten og hemme metastasering av kreft i bukspyttkjertelen.
konstitutiv aktivering av kjernefysiske faktor-kB (NF-kB ) kan fremme celleproliferasjon, inhibere celle apoptose, og regulere ekspresjonen av gener assosiert med angiogenese [3], [4]. I tillegg akkumulerende bevis tyder på at NF-kB spiller en viktig rolle i veksten, apoptose inhibering, og angiogenese av kreft i bukspyttkjertelen [5]. Gemcitabin kan forsterke ekspresjon og aktivering av NF-kB i kreft i bukspyttkjertelen celler [6], som er forbundet med utvikling av chemoresistance av kreft i bukspyttkjertelen. Derfor kan et nytt legemiddel som hemmer NF-kB uttrykk og aktivering indusere apoptose av avbryte cellene og redusere angiogenese for kreft i bukspyttkjertelen, og dermed forsterke anti-tumor aktivitet av gemcitabin og potensielt drar pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
emodin (1,3,8-trihydroksy-6-metylantrakinon), en naturlig antrakinon-derivat isolert fra Rheum palmatum L, er i stand til å hemme veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler som vist ved tidligere studier [6], [7], [ ,,,0],8]. Påfallende er det blitt rapportert at emodin har potensiale til å hemme flere angiogene prosesser [9], [10]. Det har blitt foreslått at emodin kan hemme kreftcellevekst ved å blokkere vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor (VEGFR) signalering i humane tarmkreftceller, noe som indikerer at emodin kan brukes som en potensiell inhibitor for tumor angiogenese [11]. Imidlertid er det fortsatt uklart om emodin kunne hemme angiogenese for kreft i bukspyttkjertelen. Interessant nok har det vist seg at emodin kan hemme ekspresjon og aktivering av NF-kB [6], [12]. Derfor, i denne studien, forsøkte vi å undersøke hvorvidt emodin kan hemme veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler og angiogenese av kreft i bukspyttkjertelen via en mulig NF-kB er involvert mekanisme. Vi fant at behandling med emodin forbedret gemcitabin-indusert veksthemming og apoptose av kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
. Vi demonstrerte ytterligere at tumorvekst-inhiberende og anti-angiogenese virkninger av emodin for kreft i bukspyttkjertelen
in vivo
, med downregulating ekspresjonen av NF-kB og NF-kB-regulerte proteiner (dvs. VEGF, MMP-2, MMP -9, og eNOS) og med roller i angiogenese hemming og redusere eNOS fosforylering.
Resultater
cytotoksisitet emodin mot SW1990 Cells, Panc-1 celler, HPNE og egenkapitalbevis
for å teste cytotoksisiteten av emodin, SW1990 celler og Panc-1-cellene ble behandlet med forskjellige doser av emodin (10 uM, 20 uM, 40 uM og 80 uM) i 72 h, og de viabilities til disse celler ble bestemt ved å bruke CCK-8-analyse. Som vist på fig. 1A, behandling med emodin alene reduserte cellelevedyktighet både SW1990 celler og Panc-1-celler på en doseavhengig måte. CCK-8-analyse viste at etter SW1990 celler og Panc-1-cellene ble behandlet med emodin (40 uM) i 12 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer, emodin redusert cellelevedyktigheten til begge cellelinjene i en tidsavhengig måte (fig. 1B). Interessant, emodin (40 uM) behandling i 72 timer redusert cellelevedyktighet SW1990 celler og Panc-1 celler med 46,4% og 40,8%, respektivt. Men den kombinerte behandling av både emodin og gemcitabin betydelig redusert cellelevedyktighet SW1990 celler og Panc-1 celler med 72,4% og 54,7%, henholdsvis, noe som indikerer en økt cytotoksisitet av den kombinerte behandlings mot SW1990 celler og PANC-1-celler, sammenlignet til monoterapi terapi (fig. 1C) (
P
0,05). Videre fant vi at emodin, gemcitabin, og deres kombinasjon endret ikke vekst av menneske bukspyttkjertelen normale epitelceller (HPNE) (Fig. 1 D). Vi fant at gemcitabin (20 umol /L) reduserte betydelig celledød i bukspyttkjertelkreft-avledede ECS, mens den emodin (40 umol /L) behandling, og den kombinerte behandling av emodin og gemcitabin forbedret celledød i disse celler, noe som indikerer at emodin har en hemmende virkning på proliferasjonen av bukspyttkjertelkreft-avledet ECS.
celler uten behandling ble anvendt som kontroll. (A) emodin inhiberte proliferasjonen av celler og SW1990 Panc-1-celler på en doseavhengig måte. (B) emodin inhiberte proliferasjonen av celler og SW1990 Panc-1-celler i en tidsavhengig måte. (C) emodin forbedret spredning hemming av SW1990 celler og Panc-1 celler med gemcitabin. (D, E) Levedyktighet av HPNE og ECS ble vurdert etter behandlet med fortynningsmiddel kontroll, gemcitabin (20 umol /L), emodin (40 umol /L), eller deres kombinasjon i 72 timer. Kvantifisering ble utført ved å beregne forholdet mellom en verdi til kontrollen. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD for hver gruppe av celler fra tre separate eksperimenter. Emo: emodin; Gem: gemcitabin. *,
P
. 0,05
Effekt av emodin på apoptose av SW1990 Cells og Panc-1 celler
Videre flowcytometri analyse viste at behandling med emodin alene økte apoptose frekvensen av SW1990 celler fra 3,7% til 15,3% og av Panc-1 celler fra 7,7% til 26,0%. Sammenlignet med enkeltmedikamentbehandling, kombinert behandling med begge legemidlene induserte betydelig høyere forekomst av apoptose (
P
0,05), som var 41,2% for SW1990 celler og 38,7% for Panc-1 celler (Fig.2A og B). Disse data er i overensstemmelse med tidligere studier av cellevekst-inhibering ved hjelp av MTT-analysen, noe som indikerer at tapet av levedyktige celler ved emodin og /eller gemcitabin er i det minste delvis på grunn av induksjon av celle-apoptose.
(A) representative dot-plott som illustrerer apoptotiske status på SW1990 celler og Panc-1 celler. (B) Prosentandelen av apoptotiske SW1990 celler og Panc-1 celler. *,
P
. 0,05
Effekt av emodin på Angiogenese av bukspyttkjertelkreft-avledet egenkapitalbevis
angiogenese Analysen ble utført for å undersøke effekten av emodin på angiogenese
in vitro
. Vi fant at gemcitabin (20 umol /L) behandling oppregulert indeksen av angiogenese, mens de emodin (40 umol /L) behandling, og den kombinerte behandling av gemcitabin og emodin nedregulert indeksen, noe som indikerer at emodin kan hemme spontan og gemcitabin-indusert angiogenese (figur 3).
(A) Representative mikrofotografier (200 x) av angiogenese etter behandling av fortynningsmiddel kontroll, gemcitabin (20 umol /L), emodin (40 ^ mol /L), eller deres kombinasjon i 72 timer. Celler ble sådd ut på de forhåndsbelagte Matrigel-brønner (5 x 10
3 celler /brønn) og dyrket i 10% FBS-DMEM-medium. Original forstørrelse. (B) Angiogenese av endotelceller (ECS) isolert fra kreft i bukspyttkjertelen vev.
In vitro
angiogenese ble analysert kvantitativt som beskrevet i materialer og metoder. *,
P
. 0,05
Effekt av emodin på Expression og aktivitet av NF-kB
Resultatene fra EMSA analyse viste at behandling med emodin vesentlig ned-regulert DNA-bindende aktivitet av NF-kB i SW1990 celler og Panc-1-celler på en doseavhengig måte (fig. 4A og B). De relative nivåer av NF-kB /p65 i SW1990 celler og Panc-1 celler ble bestemt ved hjelp av Western blot analysen. Vi fant at gemcitabin opp-regulert ekspresjon av NF-kB /p65 i SW1990 celler og Panc-1 celler. Imidlertid førte behandling med emodin alene eller i kombinasjon gemcitabin betydelig redusert spontan ekspresjon av NF-kB /p65 i begge celletyper. NF-kB er en potent transkripsjonsfaktor for å regulere ekspresjon av apoptose-relaterte gener (Fig.4C og D). Disse data indikerte at emodin hemmet ekspresjon av NF-kB og markedsbukspyttkjertelkreft celle apoptose
in vitro
, og dermed forsterke den inhibisjon av cellevekst og proliferasjon av den kombinerte behandling.
(A) representative bilder som viser at behandlingen med emodin i 72 timer inhiberte aktiviteten av NF-kB på en doseavhengig måte i SW1990 celler og Panc-1 celler. (B) Data er uttrykt som middelverdi ± SD% av de relative nivåer av NF-kB-aktivering i SW1990 celler og Panc-1 celler fra tre separate forsøk. Lik protein lasting ble sikret ved immunoblotting 10 mikrogram av kjernefysisk protein med anti-retinoblastom antistoff. De nukleære ekstrakter fra ikke-stimulert gastrisk kreft SGC7901 celler ble anvendt som negativ kontroll, og SGC7901 celler stimulert med 50 ng /mL TNFa ble anvendt som positiv kontroll. +: Positiv kontroll; -: Negativ kontroll. (C) emodin attenuert den spontane og gemcitabin-indusert NF-kB-ekspresjon i celler og SW1990 Panc-1 celler. (D) Kvantifisering ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. *,
P
. 0,05
Effekt av emodin på veksten av Orthotopically Transplanted Bukspyttkjertelkreft
Behandlingsprotokollen er vist i Fig.5A. På dag 56 etter at tumorene ble implantert, den gjennomsnittlige vekten av tumorer behandlet med normal saltløsning, emodin (40 mg /kg), gemcitabin (100 mg /kg), og emodin (40 mg /kg) pluss gemcitabin (80 mg /kg) var (1,721 ± 0,149) g, (1,021 ± 0,109) g, (0,794 ± 0,082) g, og (0,393 ± 0,057) g hhv. Vi har observert en signifikant reduksjon (
P
0,05) i tumorvekt i emodin eller gemciatabine gruppe sammenlignet med den ubehandlede kontroll, og den største inhibitoriske effekt på tumorvekst i kombinasjonsgruppen (Fig.5B og C) (
P
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen eller enkelt medikament gruppe).
(A) Skjematisk illustrasjon av eksperimentell protokoll. (B) Fotografier av orthotopically implantert pankreastumorer på dag 28 etter behandling. Den kombinerte behandling av emodin og gemcitabin i betydelig grad hemmet tumorvekst. (C) Et tumorvekter for de enkelte grupper av mus på den siste dagen av forsøket (dag 37). *,
P
. 0,05
Effekt av emodin på veksten av Orthotopically implantert bukspyttkjertelkreft oppdages ved MicroPET
Etter å ha blitt behandlet i 4 uker, den nakne mus ble fotografert med høy oppløsning positronemisjonstomografi (MicroPET) (fig. 6A) og fluor-18-merket fluorodeoxyglucose (
18F-FDG) for å bestemme forholdet mellom tumoren til normalt muskelvev (T /NT-forhold) i samme størrelse regioner av interesse (ROI) og standard opptaksverdier (SUV). Sammenlignet med T /NT-forhold til kontrollgruppen (2,78 ± 0,042), de av de gemcitabin-gruppen (1,88 ± 0,043) og emodin gruppen (2,20 ± 0,052) ble signifikant redusert (
P 0,05
), og kombinasjonsgruppen (1,55 ± 0,058) ble ytterligere redusert (
P
. 0,05, sammenlignet med de enkelte legemiddelgrupper) (figur 6B). SUVer av gemcitabin-gruppen (3,61 ± 0,12) og emodin gruppen (4,10 ± 0,35) ble betydelig redusert sammenlignet med kontrollgruppen (5,49 ± 0,22) (
P
0,05), og kombinasjonsgruppen ( 2,72 ± 0,08) hadde enda lavere opptak enn de enkelte legemiddelgrupper (
P ..
0,05) (figur 6C)
(A) MicroPET viser en stor koronale snitt orthotopic transplantasjon svulst i en naken mus. (B og C) T /NT-forholdet og SUVer i gemcitabin-gruppen, emodin gruppe og kombinasjonsgruppen var lavere enn den for kontrollgruppen (0,9% natriumklorid) (
P
0,05), og kombinasjonen gruppen viste enda lavere T /NT-forhold og SUVer enn emodin gruppen og gemcitabin-gruppen. *,
P
. 0,05
Effekt av emodin på Angiogenese av Orthotopically implantert bukspyttkjertelkreft oppdages ved Tumor Vaskulær Imaging
Som vist i figur 7a og B, tumor vaskulær avbildning analyse viste at gemcitabin økes fartøyet fordeling (
P
0,05), selv om det reduserte tumorvolumet i forhold til kontrollgruppen som vist ved MicroPET (
P
0,05) (figur 7a og b). Videre, immunohistokjemi analyse viste at gemcitabin behandling signifikant oppregulert uttrykket nivåer av CD31 og CD105, som kan bli betydelig redusert ved den emodin behandling og den kombinerte behandling av emodin og gemcitabin (Fig.7C og D). Disse observasjonene antydet at emodin kunne hemme angiogenese av orthotopically implantert svulster
A:. Den vaskulære bilde av svulstene ble tatt til fange av X-ray maskin. B: Vaskulær tetthet ble beregnet som det totale tumorblodkaret nummer delt av tumorvolum, og deretter normalisert til kontrollgruppen. (C) emodin alene eller i kombinasjon med gemcitabin hemmet ekspresjon av CD31 og CD105. (D) kvantifisert data blir presentert. Kvantifiseringen ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. *,
P
. 0,05
Effekt av emodin på uttrykk for angiogenese-assosiert Proteiner i ortotopiske bukspyttkjertelkreft Vev oppdaget av Immunohistochemistry og Western Blot
som vist på fig. 8, immunohistokjemi analyse viste at emodin og gemcitabin nedregulert ekspresjon av Ki-67 sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,05), og deres kombinasjoner ytterligere nedregulert Ki-67 ekspresjon sammenlignet enkeltmedikamentelle behandlinger (
P
0,05). Både immunhistokjemi analyse og Western blot-analyse viste at gemcitabin opp-regulert ekspresjon av VEGF, MMP-2, MMP-9, eNOS, og NF-kB i orthotopically thanspanted tumorer sammenlignet med kontrollgruppen (
P
0,05). Videre emodin behandling og den kombinerte behandling av emodin og gemcitabin inhiberte signifikant eNOS fosforylering. Imidlertid har vi funnet at ingen av de tre behandlinger forandres ekspresjonsnivået av VEGFR i kreft i bukspyttkjertelen vev.
(A) Immunhistokjemi analyse av ekspresjonen av Ki-67, NF-kB, VEGF, MMP-2, MMP-9, og eNOS i ortotopiske kreft i bukspyttkjertelen vev. (B) Western blot analyse av ekspresjonen av NF-kB, VEGF, MMP-2, MMP-9, eNOS, VEGFR, og p-eNOS i ortotopiske kreft i bukspyttkjertelen vev. (C) kvantifiserte data av immunhistokjemi analyser presenteres. (D) Kvantifisering av Western blot resultatene ble utført ved å beregne forholdet mellom verdien til kontrollgruppen. *,
P
0,05; #
P
. 0,05
Effekt av emodin på NF-kB aktivitet i Transplanted Bukspyttkjertelkreft Vev
For å finne ut om kombinasjonsbehandling av emodin og gemcitabin har noen effekt på NF-kB-aktivering, ble det DNA-bindende aktivitet av NF-kB vurdert ved hjelp av EMSA analysen. I samsvar med immunoblottingforsøk resultater, emodin alene eller i kombinasjon med gemcitabin redusert DNA-bindende aktivitet av NF-kB i bukspyttkjertelkreft orthotopically implantert med Panc-1-celler (fig. 9A, B).
(A) NF- kB-DNA-bindende aktivitet ble bestemt ved EMSA og supershift eksperiment. Lik protein lasting ble sikret ved immunoblotting 10 mikrogram atom protein med anti-retinoblastom antistoff. +, Positiv kontroll; -, Negativ kontroll. (B) kvantifiserte data blir presentert. *,
P
. 0,05
Effekt av emodin på mRNA uttrykk nivåer av NF-kB, VEGF, MMP-2, MMP-9, og eNOS i bukspyttkjertelen vev påvist ved RT-PCR
i henhold til resultatene av immunohistokjemi og Western blot-analyse, mRNA ekspresjon av NF-kB, VEGF, MMP-2, MMP-9 og eNOS i bukspyttkjertelkreft vev ble opp- regulert i gemcitabin-gruppen, men nedregulert i emodin gruppe og kombinasjonsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen i bukspyttkjertelkreft vev (
P
0,05). (fig. 10A, B)
(A) mRNA-nivåene av NF-kB, VEGF, MMP-2, MMP-9 og eNOS i bukspyttkjertelkreft vev i forskjellige behandlingsgrupper ble påvist ved RT-PCR. (B) kvantifiserte data ble presentert. *,
P
. 0,05
Diskusjoner
I tråd med våre tidligere observasjoner [8], behandling av celler med emodin betydelig forbedret hemming av celle vekst av gemcitabin, som ble korrelert godt med resultatene av apoptose analyse. Tilsvarende fant vi at emodin hemmet kreft i bukspyttkjertelen cellevekst
in vivo
. Her, for første gang, har vi funnet at emodin inhiberte angiogenese av kreft i bukspyttkjertelen in vivo, downregulated ekspresjonen av NF-kB og NF-kB-regulerte proteiner med roller i angiogenese-inhibering (VEGF, MMP-2, MMP-9, og eNOS). Denne studien var fokusert på den anti-angiogenese virkning av emodin
in vivo
og den mulige mekanisme.
Det har blitt rapportert at gemcitabin induserer aktivering av NF-kB og deretter fører medikamentresistens [ ,,,0],1. 3]. I samsvar med våre tidligere observasjoner, denne studien viste klart at emodin inhiberte den spontane aktivering av NF-kB på en doseavhengig måte i SW1990 celler og PANC-1-celler, og avskaffet gemcitabin-indusert NF-kB-aktivering i begge typer celler. I tillegg har vi funnet at emodin alene eller i kombinasjon med gemcitabin presenterte anti-tumor virkning på en ortotopisk bukspyttkjertelkreft modell, som vist ved en reduksjon i tumorvekt. På samme måte, emodin alene eller i kombinasjon gemcitabin har vist seg å ha potent anti-tumor effekt i en subkutan tumor modell i vårt tidligere studium [8].
Et kritisk trinn i angiogenese involverer lokal proliferasjon av endotelceller. Hee-Jin Kwak et al. viste at emodin effektivt inhiberer VEGF-A-indusert angiogenese in vitro og in vivo [10]. Alexander D. Crawford et al. rapportert at emodin hemmet pattedyr endotelceller spredning og tube dannelse in vitro [14]. Og det har blitt rapportert at emodin kan hemme tumor-assosiert angiogenese in human colon carcinoma
in vitro product: [9]. Vår undersøkelse viste at proliferasjon av kreft i bukspyttkjertelen-avledet ECS og blodkardannelse ble inhibert med emodin alene eller i kombinasjon med gemcitabin. Konstitutiv aktivering av NF-kB er observert i mange kreftformer, inkludert human kreft i bukspyttkjertelen [15]. Strategier som er målrettet mot NF-kB regulert bane kan være nyttig for å forbedre virkningene av kjemoterapeutiske midler, for eksempel gemcitabin på tumoravledet endotelceller [16]. Vår studie antydet at emodin kan hemme angiogenese av bukspyttkjertelkreft-avledet egenkapitalbevis gjennom NF-kB regulert signalveien. Videre tumor vaskulære avbildnings Resultatene viste at den vaskulære tettheten i emodin gruppen og emodin /gemcitabin-kombinasjonsgruppen betydelig redusert sammenlignet med kontrollgruppene og gemcitabin. I tillegg, sammenlignet med kontrollgruppene, og gemcitabin, er emodin behandling og den kombinerte behandling av emodin og gemcitabin betydelig redusert uttrykket nivåer av CD31 og CD105. Våre resultater antydet at emodin kan inhibere angiogenese av orthotopically implantert kreft i bukspyttkjertelen.
Tidligere studier har antydet at NF-kB kan regulere ekspresjonen av flere angiogenese-assosierte proteiner som MMP-2, MMP-9, VEGF og eNOS [12], [17], [18], [19]. Vår tidligere studie har vist at emodin downregulated aktivering og ekspresjon av NF-kB i SW1990 celle implantasjon indusert bukspyttkjertelkreft [20], NF-kB analyse av de ortotopiske tumorvev i denne studien viste at emodin alene eller i kombinasjon med gemcitabin trykt NF- kB-uttrykk og sin aktivitet i kreft i bukspyttkjertelen vev. Vi fant også at emodin alene eller i kombinasjon med gemcitabin downregulated uttrykk for NF-kB-regulerte gener (VEGF, Enos MMP2 og MMP9), som er nært forbundet med angiogenese.
MMP-2 og MMP-9 kan være forbundet med tumor angiogenese [9], [17]. Det har blitt rapportert at emodin kan hemme tumor-assosiert angiogenese ved å undertrykke MMP-9 uttrykk [9]. I denne studien ble immunhistokjemisk analyse viste at emodin alene eller i kombinasjon med gemcitabin downregulated ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 i ortotopiske kreft i bukspyttkjertelen vev, mens gemcitabin hadde ingen effekt på ekspresjonen av MMP-2 og MMP-9. Disse resultatene antydet at emodin kan hemme angiogenese av kreft i bukspyttkjertelen vev via undertrykkelse av MMP-2 og MMP-9.
Som en angiogenese regulerende faktor, er VEGF nært forbundet med angiogenese [21] og metastasering av kreft i bukspyttkjertelen [22]. Som rapportert av Aggarwal et al., Kan NF-kB-avhengig økning av VEGF-ekspresjon fremme tumorcelleoverlevelse og vaskulær angiogenese [23]. En fersk studie antydet at emodin kan hemme uttrykket av VEGF i humane neuroblastom celler [24]. I denne studien fant vi at emodin alene eller i kombinasjon med gemcitabin betydelig nedregulert VEGF uttrykk i orthotopically implantert bukspyttkjertelkreft. Våre resultater antydet at emodin kan hemme VEGF uttrykk for å undertrykke angiogenese for kreft i bukspyttkjertelen. Ytterligere eksperimenter viste at emodin, gemcitabin, og deres kombinasjon hadde ingen effekt på VEGFR ekspresjon, noe som indikerer at inhibering av angiogenese ved emodin i kreft i bukspyttkjertelen ikke var forbundet med VEGFR.
eNOS stimulerer frigjøring av NO som i sin tur kan fremme spredning av EPCs [25]. Inhibering av eNOS i humane navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) kan hemme formeringen og røret dannelsen av endoteliale celler [10]. I denne studien, har vi funnet at emodin alene eller i kombinasjon med gemctabine hemmet eNOS-ekspresjon i ortotopiske kreft i bukspyttkjertelen vev, noe som indikerer at inhibering av eNOS-ekspresjon kan være involvert i hemning av tumor angiogenese ved emodin. Ytterligere eksperimenter viste at emodin behandling og den kombinerte behandling av emodin og gemcitabin i betydelig grad hemmet eNOS fosforylering, noe som indikerer at emodin kan hemme gemcitabin-indusert eNOS fosforylering som er involvert i EF-migrering, proliferasjon og rør formasjon
in vitro
[26].
NF-kB er nært forbundet med ikke bare apoptose hemming, men også angiogenese av svulster. Vår studie viste for første gang at NF-kB kan også spille en viktig rolle i angiogenese hemming av emodin i bukspyttkjertelkreft
in vivo
, og forbedret effekt av gemcitabin på kreft i bukspyttkjertelen kan oppnås gjennom emodin mediert nedregulering av ekspresjonen av NF-kB og NF-kB-regulerte proteiner med roller i angiogenese-inhibering (dvs. VEGF, MMP-2, MMP-9 og eNOS). Men hvordan emodin nedregulerer NF-kB uttrykk er ennå ikke undersøkt.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
De eksperimentelle protokollene ble godkjent av Institutional Review Board of First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine.
cellelinjer og dyr
Den menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer SW1990 og Panc-en ble kjøpt fra American Type Culture Collection. Menneske bukspyttkjertelen normale epitelceller (HPNE) (CHI Scientific INC, Maynard, MA) ble fylt i vårt laboratorium. Kvinnelige atymiske BALB /c nu /nu mus (4-6 uker gamle) ble kjøpt fra Shanghai Cancer Institute for Tumor Implantasjon. Alle dyrene ble opprettholdt i et sterilt miljø i dyreforsøk Center of Zhejiang University School of Medicine, ifølge forsøksdyr forskrift av departementet for vitenskap og teknologi i Folkerepublikken Kina (https://www.most.gov. cn /kytj /kytjzcwj /200411 /t20041108_32465.htm).
Reagenser
emodin ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, USA), oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) på 0,2 mmol /L på lager og lagret ved -20 ° C. Sluttkonsentrasjonen av DMSO var mindre enn 0,1%. Gemcitabin ble kjøpt fra Ely Lilly (Bad Homburg, Tyskland) og oppløst i sterilt saltvann på 50 g /L på lager. RPMI-1640 og føtalt bovint serum (FBS) ble oppnådd fra Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). Cell apoptose reagenssett (Annexin V-FITC og PI) ble kjøpt fra Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kina). Celletelling kit-8 (CCK-8) ble kjøpt fra Beyotime Institutt for bioteknologi (Haimen, Kina). Fluor-18-merket fluorodeoxyglucose (
18F-FDG) ble levert av Zhejiang University School (Hangzhou, Zhejiang, Kina). Antistoffer ble oppnådd fra følgende kilder: kommersielle anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-VEGF, og anti-β-aktin-antistoffer ble innkjøpt fra Epitomics (Burlingame, California, USA); anti-NF-kB, anti-CD31 og anti-CD105-antistoffer ble innkjøpt fra Abcam (Cambridge, MA, USA); anti-eNOS og anti-VEGFR (Flk-1) (C1158) antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz (Santa Cruz, USA); anti-Phospho-eNOS (Ser1177) antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling (Beverly, MA, USA); anti-Ki-67 antistoffet og DAB kit ble kjøpt fra Zhongshan Bio-Tech Co., Ltd (Beijing, Kina). Den TRIzol reagens ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNA rask 200 rensing kit ble kjøpt fra Fastagen Biotech (Shanghai, Kina).
Isolering av mikrovaskulære endotelceller (ECS) fra implanterte kreft i bukspyttkjertelen vev.
Implanterte kreft i bukspyttkjertelen vev ble kuttet i 1 mm vevsblokker og inkubert i 0,1% kollagenase i i MEM ved 37 ° C i 2 timer. Microvascular egenkapitalbevis ble isolert fra vevsblokker ved hjelp av en magnetisk perle immunoaffinitetskolonnerensing endotelceller isolasjon kit (Dynal Biotech, Brown Deer, WI). I korthet Dynabeads M-450 og sau-anti-rotte IgG koblet med et monoklonalt rotte anti-muse-CD31-antistoff (30 ul alikvot per 5 ml rør) ble inkubert i 1 ml av vev supernatant ved 4 ° C over natten og deretter vasket tre ganger med 10% FBS-DMEM; 1 ml cellesuspensjon ble satt inn i røret som inneholdt de vaskede perlene. Etter inkubering med leilighetsvis omrøring ved 4 ° C i 30 minutter, ble kule-bundne celler utvunnet, vasket og deretter spaltet i 1 ml trypsin /EDTA (Gibco) for å frigjøre kulene. De kule-frie celler ble sentrifugert i 10% FBS-RPMI-1640 og deretter suspendert på nytt i 7 ml kulturmedium som beskrevet nedenfor. Utbyttet av vaskulær egenkapitalbevis var 98%. Identiteten til de isolerte cellene ble bekreftet ved in vitro-rør-dannelse i matrigel og farging for VE-cadherin, en eksklusiv EC markør.
Cell Culture
HPNE, ECS, SW1990 celler, og Panc -1-celler ble dyrket i RPMI-1640 dyrkningsmedium supplert med 10% varme-inkubert FBS (Invitrogen, New York, USA), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Celler ble passert på 70-80% samløpet. Luciferase-transfekterte SW1990-celler ble høstet 70-80% sammenflytende kulturer etter en kort eksponering til 0,25% trypsin supplert med 0,2% EDTA. Trypsinering ble avsluttet med RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS. Cellene ble vasket en gang i serumfritt medium og resuspendert i PBS. Suspensjoner som består av Panc-1 celler, med 90% levedyktighet, ble brukt til injeksjoner
Cell overlevelse oppdaget av CCK-8
HPNE, ECS, SW1990 celler, og Panc. -1 celler oppsamlet i eksponensiell fase ble sådd ut ved en initial densitet på 4 x 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater. Da celler ble delt inn i fire grupper med forskjellig behandling i 72 timer: kontrollgruppen (0,1% DMSO), den gemcitabin-gruppen (gemcitabin, 20 pmol /l), emodin gruppen (emodin, 40 umol /L), og kombinasjonen gruppe (gemcitabin 20 umol /L + emodin 40 umol /L), med fem brønner for hver gruppe. Brønnene uten stoffer, men 0,1% DMSO ble anvendt som kontroll. En time før eksponeringen var over, ble 0,01 ml CCK-8 tilsatt i hver brønn.
