Abstract
Calcyclin-bindende protein (CacyBP /SIP), identifisert på grunnlag av sin evne til å samhandle med S100 proteiner i en kalsiumavhengig måte, ble tidligere funnet å inhibere proliferasjon og tumorigenesis av magekreftceller i vårt laboratorium. Viktigere, effekter av S100 proteiner på den biologiske oppførsel CacyBP /SIP i magekreft fortsatt uklare. Heri, rapporterer vi byggingen av eukaryote ekspresjonsvektorer for villtype CacyBP /SIP og en avkortet mutant mangler S100 protein bindende domene (CacyBP /SIPΔS100). Uttrykk for vill-type og avkortede rekombinante proteinene ble demonstrert ved transfeksjon av MKN45 magekreftceller. Co-immunoutfellingsstudier analyser påvist interaksjon mellom S100A6 og villtype CacyBP /SIP i MKN45 celler. Fjerning av S100 proteinbinding domene dramatisk redusert affinitet CacyBP /SIP for S100 proteiner som indikert av redusert co-immunoprecipitation av S100A6 av CacyBP /SIPΔS100. MTT-assay, FACS-analyse, klonogene analysen og tumor xenograft eksperiment ble utført for å vurdere effekten av CacyBP /SIP på cellevekst og tumordannelse
in vitro
og
in vivo
. Overekspresjon av CacyBP /SIP hemmet spredning og tumorigenesis av MKN45 magekreftceller; Utbredelsen og tumorigenesis priser ble ytterligere redusert med uttrykket av CacyBP /SIPΔS100. Vi viste også at S100 proteiner negativt regulere CacyBP /SIP-mediert hemming av magekreft celleproliferasjon, gjennom en effekt på β-catenin protein uttrykk og transcriptional aktivering av Tcf /LEF. Selv om den underliggende mekanismen for handling krever videre undersøkelser, denne studien gir ny innsikt i samspillet mellom S100 proteiner og CacyBP /SIP, som kan berike vår kunnskap om S100 proteiner og være nyttig for vår forståelse av utviklingen av magekreft.
Citation: Ning X, Sun S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y, et al. (2012) S100A6 Protein Negativt Regulerer CacyBP /SIP-mediert hemming av magekreft celleproliferasjon og tumorigenesis. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10,1371 /journal.pone.0030185
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italia
mottatt: 27 oktober 2011; Godkjent: 15 desember 2011; Publisert: 25 januar 2012
Copyright: © 2012 Ning et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra National Nature Science Foundation of China (No. 30872964, nr 30772461). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
S100 proteiner er den største undergruppen innenfor EF-hånd Ca
2 + -binding protein familie og er preget av sin celle- og vevs-spesifikke uttrykk mønstre. Disse proteinene er kjent for å regulere intracellulære prosesser, slik som cellesyklusen overgang og cellevekst, differensiering og motilitet [1]. En unik funksjon av disse proteinene er at enkelte medlemmer er lokalisert i bestemte cellulære avdelinger fra hvor noen er i stand til å flytte på Ca
2 + aktivisering [2], [3]. Ved trans, kan disse proteinene transduce Ca
2 + signal i en tidsmessig og romlig måte ved å samhandle med ulike S100 protein-spesifikke mål. Interessant nok er de fleste S100 gener som ligger i et gen klynge på menneskelig kromosom 1q21, et område av hyppige kromosomavvik [4]. Denne foreningen antyder en sammenheng mellom kromosomavvik og dereguleringen av S100 genuttrykk i ulike svulster. Opp til dags dato har mange medlemmer av familien S100 blitt identifisert til å være forbundet med tumorutvikling og metastase [5], [6]. Imidlertid er de presise roller og betydningen av S100 proteiner i utvikling og markedsføring av kreft dårlig forstått. Forståelse av den biologiske funksjonen (e) til S100 proteiner vil avhenge av identifikasjon av S100 protein mål. Inntil nå har flere mulige mål protein, inkludert glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, annexin II, annexin VI, annexin XI, caldesmon og CacyBP /SIP, er blitt vist å interagere med S100 proteiner
in vitro
i en Ca
2 + -avhengig måte [5], [7].
Calcyclin-bindende protein (CacyBP /SIP), et 30 kDa-protein som er identifisert på grunnlag av dets evne til å interagere med S100A6 i en Ca
2 + -avhengig måte i Ehrlich ascites tumor (EAT) -celler [8], ble tidligere antatt som et multippel medikamentresistens (MDR) -relaterte molekyl i magekreft i vårt laboratorium [9]. Ved bruk av et monoklonalt antistoff mot CacyBP /SIP [10], har vi vist at overekspresjon av CacyBP /SIP-hemmer proliferasjonen og tumorgenesis av nyrekreftceller [11]. Videre studier har foreslått at CacyBP /SIP undertrykker veksten av magekreft [12]. Til tross for denne fremgangen, effekter av S100 proteiner på CacyBP /SIP i magekreft fortsatt uklare. I tillegg ble CacyBP /SIP også funnet å være en komponent av en ubiquitinering kompleks via binding Siah1 og Skp1 [13]. Og dette ligase ble beskrevet å regulere nedbrytning av ikke-fosforylert β-catenin [13].
CacyBP /SIP kunne binde S100, Siah1 og Skp1 av ulike regioner. Den N-terminale region (aa 1-80) av CacyBP /SIP er blitt vist å ha affinitet for Siah1. Den C-terminale region av CacyBP /SIP (aa178-229) er kjent for å danne en α-heliks; dette domenet kan samhandle med S100 proteiner, inkludert S100A6 [14]. Skp1 bindende domene ikke overlapper med S100 bindende regionen og Skp1 binder seg til den midtre delen (aa78-155) av CacyBP /SIP [15], [16]. Å observere effekten av S100 proteiner på den biologiske oppførsel av CacyBP /SIP i magekreft, eukaryote ekspresjonsvektorer for villtype CacyBP /SIP og dens avkortet mutant mangler S100 protein bindende domene (CacyBP /SIPΔS100) ble vellykket konstruert og effektivt uttrykt i MKN45 celler. En MTT analyse, FACS-analyse, klonogene analysen og tumor xenograft eksperiment ble utført for å evaluere effektene av CacyBP /SIP på cellevekst og tumordannelse både
in vitro
og
in vivo
. Resultatene av disse studiene kan bidra til klarlegging av virkningene av S100 proteiner på den biologiske oppførsel av CacyBP /SIP i magekreftceller.
Materialer og metoder
Cellelinjer og dyr
magekreft cellelinjen MKN45, som ble funnet å være det laveste ekspresjon av CacyBP /SIP i vårt tidligere studium [12], ble bevart i vårt laboratorium. Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum, penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 ug /ml) i en CO
2 inkubator (Forma Scientic, Marjetta, OH, USA). BALB /c naken mus ved 4-6 ukers alder ble gitt av Shanghai Cancer Institute for
in vivo
tumorigenesis studien. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i fjerde Military Medical University (Permit Number: 11016). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og hver innsats ble gjort for å minimere lidelse.
immunfluorescens farging
Cellene ble sådd ut renset Dekk og festes med 95% alkohol i 20 min på rommet temperatur. Cellene på objektglassene ble vasket med PBS og permeablized i 10 minutter med 0,5% Triton X-100 i PBS. Cellene ble inkubert med anti-S100A6 antistoff (fortynnet 1:2000) etter blokkering med 3% bovint serumalbumin i 1 time. Cellene ble deretter inkubert med FITC-konjugert anti-mus IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) og er montert på objektglass med en blanding av glycerol og polyvinylalkohol inneholdende DABCO (1,4- diazobicylo- [2,2 , 2,] – oktan). Immunfluorescens ble analysert med en MRC-1024 Laser Scanning Confocal Imaging System (Bio-Rad).
Plasmid konstruksjon og celle transfeksjon
Oligonukleotidprimere inneholder
Eco
RI eller
Eco RV
restriksjonssete ble syntetisert, henholdsvis, for amplifikasjon av CDS sekvens av CacyBP /SIP eller en C-terminal delesjon (aa178-229) mutant av CacyBP /SIP (Accession AF_314752). De to primere var: 5 «gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3» (sense) og 5 «gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3» (anti-sense); 5 «gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3» (sense) og 5 «ccgatatcacacaatataagaactgta 3» (anti-sense), respektivt. PCR-betingelsene var: 5 minutter ved 94 ° C i innledende denaturering, etterfulgt av 35 sykluser på 45 sek ved 94 ° C, 45 sek ved 60 ° C og 60 sek ved 72 ° C, med en endelig forlengelse på 10 min ved 72 ° C. Lengdene av PCR produktene var 687 bp for CDS, og 534 bp for C-terminal sletting. Hver PCR produktet ble kuttet med
EcoRI
jeg og
EcoRI
V begrensning fordøyelse og klonet inn likeså fordøyd pflag-CMV. De nye vektorer ble kåret pflag-CacyBP (villtype) og pflag-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100). Innsatsens sekvenser ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
Cell transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) som beskrevet av fabrikanten. I korthet ble cellene sådd ut og dyrket til 70-90% konfluens uten antibiotika. De ble deretter transfektert med en mikrogram pflag-CacyBP eller pflag-ΔS100. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble G418 (350 mg /ml) tilsatt til kulturmediet for valg av transfekterte celler. Blandede kloner ble utvidet i ytterligere 6 uker. Celler transfektert med tom vektor, pflag-CMV, ble anvendt som en negativ kontroll. Disse stabile cellelinjer ble kåret MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 og MKN45-pflag for villtype, avkortede og negative kontroll transfektanter hhv.
Co-immunoprecipitation
MKN45 transfektanter var vasket i PBS, høstet og lysert på is i en buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM MgCl
2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, og 1% Nonidet P-40. Ekstraktene ble sentrifugert ved 12000 rpm i 25 min ved 37 ° C i en mikrosentrifuge. Supernatantene ble anvendt for immunopresipitering en analyse etter tilsetning av protease-inhibitorer (10 mg /l leupeptin, 5 mg /l aprotinin, 20 mg /l soyabønnetrypsin-inhibitor, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid) og kvantifisert ved hjelp av Bradford-metoden. Supernatantene ble inkubert med 30 ul protein A /G-Sepharose og 1 ug ubeslektet antistoff i 1-3 timer ved 37 ° C (pre-klaring). De ubundne fraksjonene ble deretter inkubert med serum inneholdende antistoff mot CacyBP /SIP i 1,5 timer ved 4 ° C. Blandingen ble deretter inkubert med ytterligere protein A /G-Sepharose over natten ved 4 ° C. Harpiksen ble deretter vasket tre ganger i en buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 150 mM NaCl, to ganger i en buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 500 mM NaCl, og til slutt i 20 mM Tris -HCI ved pH 7,5. Alle bufferne som ble brukt var supplementert med proteasehemmere. Harpiksen og bundne proteiner ble oppløseliggjort i en SDS-prøvebuffer, kokt i 5 min ved 98 °, og brukes på en SDS polyakrylamidgel. Ekspresjon av S100A6 ble analysert ved western blotting med antistoff mot S100A6.
Western blot
Cellene ble oppsamlet og lysert på is i en buffer inneholdende [50 mmol /liter Tris-Cl (pH- 7,5), 150 mmol /l NaCl, 0,2 mmol /l EDTA, 1 mmol /l PMSF og 1% NP 40], og deretter kvantifisert ved hjelp av Bradford-metoden. Et mål på 100 ug av lysater ble elektroforisert i 10% SDS-PAGE og blottet på en nitrocellulosemembran. Membranene ble blokkert med 10% fettfri melk ved romtemperatur i 2 timer og inkubert med anti-CacyBP (1:1500) og anti-β-aktin-antistoff (Sigma, 1:5000) ved 4 ° over natten. Etter tre gangers vask i 15 minutter hver i TBS supplert med 0,1% Tween 20 (TBST), ble membranen inkubert med peroksidase-konjugert geit anti-mus /kanin-IgG-antistoff (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, Kina) i 2 timer ved værelses temperatur. Forbedret kjemiluminescens (Amersham, Freiburg, Tyskland) ble brukt for påvisning.
Metyl-tiazolyl tetrazolium (MTT) assay
Cellene ble sådd ut på en 96-brønn plate med 2,5 x 10
3 celler /brønn i RPMI 1640 medium inneholdende 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum. Hver prøve hadde tre paralleller. Mediet ble byttet ut ved 2 dagers mellomrom, i 6 dager. Cellene ble inkubert med 50 ul av 0,2% MTT i 4 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Etter MTT inkubering ble en 150 ul alikvot av 100% DMSO tilsatt til hver kultur for å oppløse krystallene. Levedyktige celler ble talt hver dag ved å lese absorbans ved 490 nm ved hjelp av en 96-plateleser, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA).
Cell syklus analyse
Subkonfluente celler ble vasket med iskald PBS, suspendert i 0,5 ml etanol og deretter holdt ved 4 ° C i 30 minutter. Suspensjonen ble filtrert gjennom en 50 um nylonnett, og DNA-innhold av fargede kjerner ble analysert med et strømningscytometer (EPICS XL, Coulter, Miami, FL). Cellesyklus profilen ble analysert ved hjelp av Multicycle-DNA Cell Cycle Analyserte Software. De proliferative indekser (PI) ble beregnet som følger:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)
klonogene analysen
For å måle spredning rate av en enkelt celle
in vitro
, plate klonogene og myke agar klonogene ble utført [17]. For platen klonogene analysen ble 1 x 10
3-celler sådd ut i en 9 cm plate og dyrket i RPMI 1640 medium i to uker for å tillate for kolonidannelse. Koloniene ble fiksert i 70% etanol, farget med Giemsa-løsning og telles. For myk agar klonogene analysen ble cellene fjernet og sådd ut i 0,3% agarose med en 0,5% agarose underlag (1 x 10
3 /brønn i en 24-brønns plate). Antallet foki 100 um ble tellet etter 20 dager
tumorvekst i nakne mus
Logaritmisk voksende celler (1 x 10
7-celler) ble trypsinert, resuspendert i 0,1. ml D’Hanks oppløsning, og injisert i halsen hypodermia av hver atymiske nakne mus. Musene ble deretter overvåket i tumorvolum, generelle helse, og total kroppsvekt. Størrelsen av det subkutane tumormassen ble målt ved målepunktet i fem uker. Tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen: 0,5 x lengde x bredde
2. Hver forsøksgruppe besto av fem mus.
Reporter gen assay
For å analysere effekten av CacyBP /SIP og CacyBP /SIPΔS100 på transkripsjonen aktivitet TCF /LEF, reporteren genet analysen ble utført som beskrevet [18]. Kort, celler i en 24-brønns plate (50.000 celler per brønn) ble ko-transfektert med eller uten pflag-CMV, pflag-CacyBP, pflag-ΔS100 og reporter plasmid, pTOPFLASH, som inneholder vill-type Tcf /LSF bindingssteder hjelp Lipofectamine 2000; PRL-TK
Renilla
luciferase reporter fungerte som kontrollgruppe for transfeksjon effektivitet. Luciferase-aktiviteten ble målt og kvantifisert i et luminometer ved hjelp av Dual-luciferase reporter Assay System (Promega, Southampton, U.K.). Forsøk ble utført in triplo og gjentatt to ganger. Resultater er uttrykt som gjennomsnittet av forholdet mellom den ildflue luciferase-aktivitet og den Renilla luciferaseaktiviteten.
Statistisk analyse
Alle data ble analysert ved bruk av SPSS statistisk programvare-pakke (SPSS Inc., Chicago, Illinois), og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Signifikansen av forskjellen i frekvens av CacyBP /SIP-positiv farging mellom tilstøtende tumorprøver og tumorer ble analysert ved chi-kvadrat-test. Elevens
t
test og enveis variansanalyse fulgt av Dunnetts flere sammenligningstester ble benyttet for analyse av andre data.
Resultater
Endogen uttrykk for S100A6 i magekreft cellelinje MKN45
S100A6 ble valgt som en modell for å observere virkningen av S100 proteiner på den biologiske funksjon av CacyBP /SIP. Den endogene uttrykk for S100A6 i magekreft cellelinje MKN45 ble først oppdaget av western blot og immunfluorescens farging. Som vist på fig. 1A, S100A6 ble uttrykt i MKN45 celler. Immunfluorescens farging indikerer at S100A6 var hovedsakelig fordelt i kjernemembranen med svært lite funnet i atom plasma av MKN45 celler (Fig. 1B).
(A) Endogene uttrykk for S100A6 i MKN45 magekreftceller ble oppdaget av western blot. (B) Immunofluorescent farging av S100A6 i MKN45 celler. (A) Immunofluorescent farging av S100A6 med anti-S100A6 antistoff (i grønt); (B) Påvisning av kjerner med propidiumjodid (i rødt); (C) Sammenslåtte bilde.
Samspill mellom S100A6 og CacyBP /SIP i magekreftceller MKN45
I en tidligere rapport, CacyBP /SIP, som ble uttrykt på et relativt lavt nivå i MKN45 celler, ble allment uttrykt i flere forskjellige typer av gastrisk kreft-cellelinjer [12]. For å evaluere interaksjonen mellom S100A6 og CacyBP /SIP, villtype og mutant (aa178-229) CacyBP /SIP-cDNA ble klonet inn i pflag-CMV-vektoren og stabilt transfektert inn i MKN45 celler. Vi vurderte ekspresjonen av CacyBP /SIP i disse stabile cellelinjer ved western blot. Som vist på fig. 2A, FLAG-merket CacyBP /SIP ble detektert i villtype og mutante CacyBP /SIP-transfektanter med anti-Flag-antistoff, mens ikke noe signal ble funnet i celler transfektert med tom vektor.
(A) Western blot analyse av transfektanter CacyBP /SIP og CacyBP /SIPΔS100 transfektanter med anti-FLAG og anti-CacyBP antistoffer. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (B) Co-immunoprecipitation analyse for å påvise en interaksjon mellom S100A6 og CacyBP /SIP i MKN45 celler. Etter inkubasjon med anti-CabyBP antistoff, ble bindingsstedene oppdaget av anti-S100A6 antistoff.
Samspillet mellom S100A6 og CacyBP /SIP i transfektant MKN45 cellene ble deretter evaluert av co-immunoprecipitation. Etter inkubasjon med anti-CacyBP antistoff ble påvist ved immunpresipitatet S100A6 antistoff. Som vist på fig. 2B, en interaksjon mellom S100A6 og villtype CacyBP /SIP ble observert i MKN45-CacyBP cellelysater; imidlertid, mutant CacyBP /SIP som ble avskåret fra den aa178-229 region, produsert lite signal i ko-immunpresipitasjon analysen. Derfor den avkortede mutant CacyBP /SIP ble kåret CacyBP /SIPΔS100 og gir et nyttig verktøy for undersøkelse av effektene av S100A6 på biologisk atferd CacyBP /SIP i magekreftceller.
Effekter av S100A6 på celleproliferasjon indusert av CacyBP /SIP i magekreft cellelinje MKN45
in vitro
MTT og FACS analysene ble utført for å undersøke effekten av S100A6 på celleproliferasjon indusert av CacyBP /SIP i MKN45 celler
in vitro
. Sammenlignet med de tomme vektor transfektanter, MKN45-pflag, både villtype og CacyBP /SIPΔS100 transfektanter viste signifikant redusert forekomst av celleproliferasjon ved MTT analysen (
P
0,05) (Fig. 3A). Men CacyBP /SIPΔS100 transfektanter viste en betydelig mer redusert vekst sammenlignet med vill-type CacyBP /SIP-transfektanter (
P
0,05).
(A) Påvisning av cellevekst
in vitro
. Celleantall ble bestemt ved absorbans ved 490 nm ved anvendelse av MTT-analysen ved de angitte tider. Verdien som vises er gjennomsnittet av tre bestemmelser. (B) Celle syklus fordeling og proliferative indekser (PI) i de transfekterte celler. Cellene ble ekstrahert vaskemiddel, farget med propidiumjodid og analysert ved strømningscytometri. PI = (G2 + S) /(G1 + G2 + S).
Resultatene av cellesyklusanalyse ved FACS tilsvarende indikerer at overekspresjon av enten vill eller mutant CacyBP /SIP reduserer MKN45 proliferasjon. De gjennomsnittlige proliferative indeksene (PI) av MKN45-ΔS100 celler (0,19 ± 0,03) var lavere enn for MKN45-CacyBP celler (0,29 ± 0,02) (
P
0,05) (Fig. 3B) . Samlet utgjør disse dataene indikerer sterkt at villtype CacyBP /SIP hemmer spredning av MKN45 celler, mens CacyBP /SIPΔS100 forsterker denne hemming av spredning.
Effekter av S100A6 på tumorigenesis indusert av CacyBP /SIP i MKN45 magekreft cellelinje
in vitro Hotell og
in vivo
Anchorage-uavhengig vekst er en viktig egenskap av
in vitro
tumorvekst. Derfor undersøkte vi om oppregulering av CacyBP /SIP uttrykk hemmet MKN45 cellevekst i media og myk agar. Som vist på fig. 4A og B, CacyBP /SIP-ekspresjon resulterte i en markert reduksjon av cellevekst MKN45 i en kolonidannelsesbestemmelsen, med en gjennomsnittlig reduksjon på 32,1% i medium og 62,0% i bløt agar (
P
0,05) . Men transfeksjon av CacyBP /SIPΔS100 resulterte i en enda større nedgang i vekst med en gjennomsnittlig reduksjon i forekomsten av 84,2% i medium og 82,8% i myk agar (
P
0,01).
(A) Påvisning av klonogene dannelse i mediet. (B) Påvisning av klonogene formasjonen i myk agar. Celler ble plassert i medium inneholdende myk agar eller på en plate og inkuberes i 20 dager. Antallet foki 100 um ble tellet. Loddrette linjer representerer gjennomsnitt ± SD fra i det minste tre separate eksperimenter som hver ble utført i tre eksemplarer. (C)
In vivo
tumorigenicity ble evaluert av en naken mus analysen. Mus ble injisert subkutant med 1 × 10
7 transfekterte celler. Volumet av hver tumor ble beregnet i henhold til formelen 0,5 x lengde x bredde
2. To uavhengige eksperimenter ble utført og hver eksperimentelle gruppe besto av fem mus.
*
P
0,05
vs MKN45-pflag
,
**
P
. . 0,01
vs
MKN45 -pFLAG,
#
P
. . 0,05
vs
MKN45-CacyBP
For å bekrefte denne effekten
in vivo
vi subkutant injisert MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 og MKN45-pflag celler i til halsen hypodermia av nakne mus. Etter tre uker var den gjennomsnittlige tumorvolumet i hver gruppe var signifikant forskjellig fra den til de andre. Ved 5
th uke, det gjennomsnittlige tumorvolumet i den MKN45-pflag gruppe var 776.9 ± 90.9 mm
3, noe som er vesentlig mer enn den MKN45-CacyBP gruppe (578,9 ± 51,2 mm
3 ) (
P
0,05), og enda mer enn den MKN45-ΔS100 gruppe (364.9 ± 71,9 mm
3) (
P
0,05) (fig. 4C).
Effekter av S100A6 på CayBP /SIP-mediert β -catenin degradering
Som en del av ubiquitin ligase-komplekset, CacyBP /SIP involvert i nedbrytningen av ufosforylerte β -catenin via bindende Skp1 og Siah1. Så uttrykk for β -catenin ble oppdaget til indirekte evaluere påvirkning av S100 på Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase. For det første, co-immunutfelling analyse viste at avkortede mutant CacyBP /SIP-bind både Skp1 og Siah1 (fig. 5A), noe som tyder på S100A6 ikke påvirke dannelsen av Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase kompleks. For det andre er β- catenin protein i MKN45-ΔS100 cellene betydelig redusert, sammenlignet med MKN45-CacyBP celler, mens med ingen endring forekommet i mRNA (fig. 5B). I tillegg, fordi β-catenin er nødvendig som en kofaktor for aktivering av transkripsjonsfaktoren, Tcf /LSF, bestemt vi effekten av CayBP /SIPΔS100 på Tcf /LSF aktivitet ved hjelp forbigående transfeksjon reporter gen-analyser. Uttrykk for CacyBP /SIPΔS100 resultert i lavere Tcf /LSF aktivitet enn villtype CacyBP /SIP (Fig. 5C). MG132, hemmer av proteosomet, kunne eliminere virkningen av både villtype CacyBP /SIP og CacyBP /SIPΔS100 på Tcf /LEF aktivitet. Til sammen inferred vi at S100A6 kan påvirke CayBP /SIP mediert β -catenin degradering via samspill med CayBP /SIP.
(A) Samtidig immunoprecipitation analysen viste at avkortet mutant CacyBP /SIPΔS100 bind både Skp1 og Siah1, tyder S100A6 ikke påvirke dannelsen av Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin ligase kompleks. (B) Western blot og semikvantitativ RT-PCR ble anvendt for analyse av β-catenin protein og mRNA i transfekterte celler, respektivt. β-catenin protein i MKN45-ΔS100 celler blir betydelig redusert, sammenlignet med MKN45-CacyBP celler, mens med ingen forandring skjedde i mRNA. (C) luciferasereportergenet analyser ble brukt for å evaluere effekten av CacyBP /SIPΔS100 på Tcf /LEF rapportøraktivitet. Transfeksjon av vill-type CacyBP /SIP redusere TCF /LEF aktivitet, sammenlignet med kontroll plasmid. Og uttrykk for CacyBP /SIPΔS100 resultert i lavere Tcf /LSF aktivitet enn villtype CacyBP /SIP. MG132 (inhibitor av proteasomet) kunne eliminere virkningen av både villtype CacyBP /SIP og CacyBP /SIPΔS100 på Tcf /LEF aktivitet. *
P
0,01, sammenlignet med kontroll;
#
P
0,05, CacyBP /SIPΔS100
vs
villtype CacyBP /SIP.. Disse eksperimentene ble gjentatt tre ganger
Diskusjoner
S100 familie proteiner har fått interesse på grunn av deres differensial uttrykk i tumorvev og deres engasjement i kreft progresjon og metastasering [19] -. [ ,,,0],22]. S100 proteiner som interagere med noen målproteiner i kalsiumavhengig eller kalsium-uavhengig måte, og videre regulere funksjonen til disse målene [5], [23]. CacyBP /SIP er et nytt mål-protein som kan interagere med S100 proteiner, inkludert S100A6, S100A1, S100B, og S100P, men ikke til S100A4, calbindin D, parvalbumin eller kalmodulin [8], [16]. Tidligere arbeider i vårt laboratorium viste at overekspresjon av CacyBP /SIP kunne hemme spredning og tumorigenesis av magekreft og nyrecellekreft [11], [12]. Til tross for denne fremgangen, effekter av S100 proteiner på CacyBP /SIP gjenstår å bli undersøkt.
Å belyse regulering av S100 proteiner på CacyBP /SIP-funksjon, bygget vi den avkortede CacyBP /SIP mutant uten S100 proteinbinding domene , slik at mutant protein klarte ikke å virke S100 proteiner og beholder evnen til å samhandle med Siah1 og Skp1. I denne studien ble eukaryote ekspresjonsvektorer for vill-type CacyBP /SIP og dens avkortede mutant effektivt uttrykt i MKN45 celler. Co-immunoprecipitation viste en interaksjon mellom S100A6 og villtype CacyBP /SIP i MKN45 celler. Imidlertid CacyBP /SIPΔS100 seg lite signal ved den ko-immunoutfelling analysen, noe som indikerer en svak eller ingen interaksjon med S100A6. MTT-analysen, FACS-analyse, klonogene analysen og tumor xenograft eksperiment i nakne mus ble utført for å teste effekten av vill og mutant CacyBP /SIP på cellevekst og tumordannelse både
in vitro
og
in vitro
. Disse eksperimentene viste at overekspresjon av CacyBP /SIP kunne hemme spredning og tumorigenesis av MKN45 magekreftceller. Viktigere, celler transfektert med CacyBP /SIPΔS100 oppviste mer intens virkning i forhold til villtype-transfektanter, hvilket antyder at S100 proteiner kan ha negativ regulere inhibering av celleproliferasjon indusert ved CacyBP /SIP i magekreftceller.
Mekanismen som anvendes ved S100A6 å modulere CacyBP /SIP-funksjonen kan ligge i protein interaksjoner og funksjoner. CacyBP /SIP er kjent for å være involvert i ubiquitinering og nedbrytning av β-catenin [24] – [28]. β- catenin ble funnet å være overuttrykt eller aktivert i prolifererende celler, og i mange tumorer [29] – [31]. Fukushima et al. [32] fant at CacyBP /SIP-knockout-celler viser svekket (-catenin nedbrytning og en defekt G1 cellesyklus kontrollpunkt, noe som indikerer at β-catenin nedbrytning reaksjonsvei mediert av CacyBP /SIP definerer en viktig kontrollpost for thymocytt utvikling og cellesyklusprogresjon Vår. tidligere studier viste også at CacyBP /SIP-hemmer vekst og formering av magecancerceller dels gjennom nedbrytning av β -catenin. Enten S100 regulerer CacyBP /SIP-mediert ubikvitin-ligase beholder ukjent. Akkumulerende bevis viste at flere medlemmer av S100 protein familien kunne regulere aktivering av de target-proteiner [33], [34]. En nylig oppdaget gjær homolog av CacyBP /SIP, Sgt1, ikke bare samvirker med S100 proteiner i kalsium regulert-måte, men også forbinder med Skp1 å danne Skp1 /cullin1 /F -.. eske ubiquitin ligase kompleks [35] det har blitt funnet at S100A6 kunne hemme fosforyleringen av Sgt1 av kasein kinase II for å påvirke aktiviteten [36] i foreliggende eksperiment, har vi også funnet at CacyBP /SIPΔS100 beholde evnen til å assosiere med Skp1 og Siah1, noe som tyder S100 molekyl kan ikke påvirke dannelsen av Siah1 /Skp1 /CacyBP ubiquitin ligase kompleks. Ikke desto mindre, β-catenin protein uten en endring av mRNA-nivå i CacyBP /SIPΔS100 transfekterte celler som er markert lavere enn villtype-transfektant-celler. Den transkripsjonelle aktivitet TCF /LEF, et målgen av β-catenin, ble redusert i forbindelse med mutant CacyBP /SIP uten S100 binding, sammenlignet med vill CacyBP /SIP. Accoding til disse resultatene, postulerer vi at S100 protein kan negativt regulere aktiviteten til Siah1-CacyBP /SIP-Skp1 ubiquitin ligase ved interaksjon med CacyBP /SIP. Så blokkerer kombinasjonen av S100 og CacyBP /SIP kunne fremme β -catenin degradering, resultere i inhibering av proliferasjon av kreftceller. Dette spekulasjon kan støttes delvis av Lee et al at i celler med redusert nivå av S100A6 mengden β -catenin reduseres [26]. Resultatene er i overensstemmelse med data angående den opp-regulering av S100 proteiner og mangelfull degradering av β -catenin i tumor og prolifererende celler [37]. I tillegg ble CacyBP /SIP vist å interagere med tubulin og ERK1 /2 og spille viktige rolle i rearrangementer av cytoskjelettet, celledifferensiering eller degenerasjon [38] -. [42]
Konklusjoner
S100A6 protein regulerer negativt CacyBP /SIP-mediert hemming av magekreft celleproliferasjon, dels gjennom virkning på β-catenin nedbrytning og transcriptional aktivering av Tcf /LEF. Men de underliggende mekanismer for regulering av S100A6 på protein ubiquitinering og andre funksjoner via CacyBP /SIP-avhengige veien krever videre undersøkelser.
