Abstract
metastaser er den viktigste årsaken til dødelighet hos pasienter med solide svulster. Identifisere de nøyaktige molekyler assosiert med CRC metastaser kan være avgjørende for å forstå prosessen, som også kan oversettes til diagnostisering og behandling av CRC. I denne studien undersøker vi foreningen av mikroRNA uttrykk mønstre med lymfeknutemetastase av tykk- og endetarmskreft. Blant disse kandidat mirnas, ble uttrykket av miRNA-145 signifikant relatert til lymfeknutemetastase av CRC. Begge
in vitro Hotell og
in vivo
studien viste at oppregulering av MIR-145 kan forbedre evnen til migrasjon og invasjon av tykktarmskreftcelle, mens ingen effekt på spredning ble observert. Mekanismen for denne kampanjen er forbundet med stabilisering HSP-27, et protein som spiller en viktig rolle i å fremme metastasering. Disse resultatene kan være avgjørende for å forstå CRC metastaser og kan oversettes til diagnostisering og behandling av CRC
Citation. Yuan W, Sui C, Liu Q, Tang W, An H, Ma J (2014) Up -Regulation av mikroRNA-145 Associates med lymfeknutemetastase i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (7): e102017. doi: 10,1371 /journal.pone.0102017
Redaktør: Rolf Müller, Philipps-universitetet, Tyskland
mottatt: 10 april 2013; Godkjent: 14 juni 2014; Publisert: 14.07.2014
Copyright: © 2014 Yuan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Basic Research Program of China (Grant ingen. 2011CB911004), Beijing Training Project for den ledende Talenter (Z131107000513001), Beijing Nova Program (Z131107000413066) og Foundation of China Beijing Natural Science (Grant nr. 7122150). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) rangerer den tredje vanligste svulsten og den fjerde største årsaken til kreftdødelighet i verden [1]. Selv om mange prestasjoner har blitt gjort i behandlingen av CRC de siste tiårene, har den totale overlevelsen av pasienter med CRC marginalt endret. Dårlig prognose og overlevelse skyldes hovedsakelig metastaser, og dermed mer enn en tredjedel av pasienter med CRC til slutt vil utvikle metastatiske sykdommer [2]. Derfor identifisere de nøyaktige molekyler assosiert med CRC metastaser kan være avgjørende for å forstå prosessen, som også kan oversettes til diagnostisering og behandling av CRC.
microRNAs (mirnas) er 21- til 25-nukleotid single- flertrådet, ikke-kodende RNA-molekyler som utøver sine funksjoner ved binding til de 3′-utranslaterte regioner av de tilsvarende mRNA-mål [3]. Det har blitt anslått at en tredjedel av den totale humane gener kan reguleres ved mirnas, noe som indikerer at mirnas har sentral rolle i fysiologiske og patologiske prosesser [4] – [5]. Et stort antall funn viser at mirnas er involvert i humane kreftformer. Den upassende uttrykk for miRNAs kan føre til avvikende uttrykk for genprodukter som kan bidra til erverv av kjennetegnene til kreft. Disse observasjoner antydet funksjon av mirnas som tumor-suppressorer eller onkogener [6] -. [8]
Nylig har overbevisende bevis viste at en serie av mirnas spiller avgjørende roller i CRC metastasering. For eksempel Asangani et al. identifisert mir-21 som metastase promoter i CRC [9]. Liu et al rapporterte at Mir-499-5p forbedret cellulær invasjon og metastase i CRC ved å målrette FOXO4 og PDCD4 [10]. Okamoto K, viste at oppregulering av MIR-493 under kreftutvikling kan hindre levermetastaser i CRC [11]. Men metastase resultat av en kompleks kaskade av biologiske prosesser og de nøyaktige molekylære mekanismene bak CRC metastaser er langt fra å bli fullt ut forstått.
I denne studien, miRNA uttrykk profiler i primær CRC lesjon med eller uten lymfeknutemetastaser ble analysert ved hjelp av en miRNA microarray og kvantitativ revers-transkripsjon polymerase chain (QRT-PCR). I denne forbindelse, er MIR-145 valgt som den vist dramatisk opp-regulering i CRC med lymfeknutemetastaser i forhold til den uten lymfeknutemetastase. Begge
in vitro Hotell og
in vivo
studien viste at oppregulering av MIR-145 kan forbedre evnen til migrasjon og invasjon av tykktarmskreftcelle. I tillegg ble iTRAQ (isobar signal for relativ og absolutt kvantifisering) merking og 2DLC-ESI-MS /MS (væskekromatografi tandem MS) anvendes for å identifisere cellulære proteiner som var direkte eller indirekte reguleres av MIR-145. Disse resultatene antydet at MIR-145 kan spille en viktig rolle i metastasering av CRC ved stabilisering av Hsp-27.
Resultater
1. Ulike miRNA uttrykk profiler av CRC med eller uten lymfeknutemetastase
For å undersøke sammenhengen av mikroRNA uttrykk mønstre med lymfeknutemetastase av tykktarmskreft, åtte primære kolorektal kreft vev avledet fra scenen II-III tykktarmskreftpasienter med (n = 4) eller uten (n = 4) lymfeknutemetastase ble oppsamlet, og de miRNA ekspresjonsprofiler av dem ble bestemt ved anvendelse av Agilent miRNA microarray. Blant de unike 851 menneskelige miRNA probe, ble 32 mirnas identifiserte forskjellig uttrykt i CRC vev mellom lymfeknutemetastase positiv og negativ gruppe (
P
0,05). Tyve en av dem ble det observert betydelig økt ekspresjon i CRC med lymfeknutemetastase. På den annen side ble 11 av dem underexpressed betydelig i lymfeknutemetastase positive CRC vev. Unsupervised clustering analyse med disse 32 vesentlig feilregulert mirnas (21 mirnas med betydelig overuttrykk og 11 mirnas med betydelig nedregulering) var i stand til å skille de CRC med eller uten lymfeknutemetastase (Fig. 1a).
A. Den sertifiserte resultat av microarray analyse. Hierarkisk gruppering av 32 betydelig feilregulert mirnas ekspresjonsprofiler i humane primære kolorektal kreft vev avledet fra pasienter med kolorektal kreft med (LNM-P, n = 4) eller uten (LNM-N, n = 4) lymfeknutemetastase. B.Validation av utvalgte mirnas spådd å bli dysregulerte i CRC med eller uten lymfeknutemetastase ved hjelp QRT-PCR i samme vev som brukes for microarray analyse. Dataene som vises i B er representative for tre uavhengige eksperimenter, og presentert som fold uttrykk normalisert til U6 ± SD (standardavvik) .C. QRT-PCR-analyse av den relative ekspresjon av MIR-145 i en tilleggs 202 (LNM-N = 99; LNM-P = 103) tilfellene av humane CRC vev, inkludert tumorprøve (T) og samsvarende ikke-tumorvev prøve (NT) fra den samme pasient. Hver prøve ble analysert i triplikat og normalisert til U6. *
P
0,05, **
P
. 0,01
2. Verifisering av miRNA uttrykk ved real-time PCR-analyse
For å validere miRNA microarray data, vi utført kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) for å analysere uttrykket nivået av 11 mirnas som var de mest betydelig dysregulerte mirnas eller som ikke ble rapportert sin tilknytning til metastaser, inkludert MIR-99b, -125b, -100, -99a, -152, -199b-5p, -145, -376c, -29b, -95 og -1274a. Vi undersøkte ekspresjon av mirnas i de samme vev som brukes for microarray analyse. Etter normalisering med endogen kontroll U6, QRT-PCR data bekrefter at uttrykket av 8 mirnas viste å være i samsvar med microarray resultat. Blant dem, vises uttrykk for miRNA-145 den viktigste forskjellen mellom kreft vev i de to gruppene (Fig. 1B).
For ytterligere å bekrefte uttrykket profilen MIR-145, ble utført QRT-PCR-analyse i ytterligere 202 CRC prøver (99 CRC pasienter med lymfeknutemetastase og 103 CRC pasienter uten noen lymfeknutemetastase) (se tabell 1 og tabell S1). Som vist på fig. 1C, MIR-145 ble underexpressed i kolorektal kreft prøver med eller uten metastaser i forhold til tilstøtende normalt vev henholdsvis, som er konsistent med tidligere rapporter fra andre [14]. Men uttrykket av MIR-145 var signifikant oppregulert i CRC med lymfeknutemetastaser enn at uten lymfeknutemetastaser. Denne endringen foreslått at MIR-145 kan spille en viktig rolle i CRC lymfeknutemetastase.
3. Overekspresjon av MIR-145 har ingen effekt på spredning av HCT-8 celler
For å avgjøre om uttrykket av MIR-145 påvirker den biologiske funksjonen til CRC celler, ble Mir-145 uttrykt modell laget i HCT-8 celler ved hjelp av et lentivirus system, som ble referert til som HCT-8-MIR-145 celler i dette papir. Mir-145 nivåer av HCT-8-MIR-145 celler og mock kontrollceller (HCT-8-NC) ble bestemt ved hjelp av QRT-PCR (Fig. 2A). En betydelig oppregulering av MIR-145 i HCT-8-MIR-145-celler ble observert sammenlignet med den i HCT-8-NC-celler. For å observere virkningen av MIR-145 på HCT-8 celler, ble celleveksthastigheten eller cellesyklus bedømt ved CCK-8 eller FACS-analyse, respektivt. Som vist på fig. 2B og 2C, formeringshastigheten eller cellesyklusen HCT-8-MIR-145 celler ble ikke endret sammenlignet med HCT-8-NC. Dette resultatet antydet at overekspresjon av MIR-145 ikke signifikant innvirkning på spredning eller cellesyklusen HCT-åtte celler.
(A) QRT-PCR analyse av Mir-145 uttrykk i HCT-8 celler transfektert med lenti-MIR-145 ekspresjonsvektor eller miRNA negativ kontroll vektor ved hjelp av et lentivirus system. (B) Formerinasanalyse priser av HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC celler oppdages av CCK-8 analysen. (C) cellesyklusanalyse av HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC celler ved strømningscytometri. Dataene representerer gjennomsnittet + SD av tre uavhengige eksperimenter.
4. MIR-145 forfremmet CRC migrasjon og invasjon
in vitro Hotell og
in vivo
Vi har senere analysert hvorvidt MIR-145 bidro til å endre den vandrende mobilitet av CRC celler. Sammenlignet med modellgruppen, ble cellemigrering signifikant økt i HCT-8-MIR-145-celler i et Transwell cellemigrasjon analysen (fig. 3A). Et lignende resultat ble også observert i en celle invasjon assay (fig. 3B). Vi har også bestemt evne MIR-145 for å fremme migrasjon i andre CRC cellelinjer (SW480 og SW620). Som vist i fig. S1 i File S1, overekspresjon av MIR-145 økt betydelig den vandrende evne SW620 celler, mens ingen tydelig endring i sw480 celler (data ikke vist). Sammen er disse resultatene gir sterke bevis for at oppregulering av MIR-145 kan fremme celle migrasjon og invasjon
in vitro
. På grunn av at ekspresjonen av MIR-145 i HCT-8 celler oppviste den laveste ekspresjon sammenlignet med det i andre CRC-celler, ble resten av arbeidet fokusert på denne CRC-cellelinje for å illustrere typiske validering.
(A) Migrasjon og invasjon (B) analyse av HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC celler. Bildene var representanter fra minst tre uavhengige eksperimenter. Gjennomsnittlig antall migrasjon celle nummer per felt fra minst tre uavhengige eksperimenter ± SD er vist ved kolonne figur. **
P
0,01. (C) Foto bilder av mesenteriske lymfeknutemetastase fra nakne mus som ble injisert inn i leveren med HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC-celler etterfulgt av kirurgisk sutur. Dyrene ble drept 2 uker etter intrahepatisk celle inokulasjon. (D) Forekomst av mesenteriske lymfeknutemetastaser hos mus (tabell) og gjennomsnittlig antall synlige metastatiske knuter i mesenteriet (kolonne figur). **
P
. 0,01
For ytterligere å bekrefte denne forestillingen ble en ortotrop transplantasjon naken mus modell etablert for å undersøke om overekspresjon av MIR-145 kan fremme tumormetastaser
in vivo
. Vi har funnet ingen signifikant forskjell i vekt eller volum av de primære tumorer i leveren transplanterte av begge HCT-8-MIR-145-celler og HCT-8-NC-celler. Vi fant også at 100% av mus i HCT-8-MIR-145 gruppen hadde det mesenteriske lymfeknutemetastaser, og gjennomsnittlig antall metastatiske knuter nådd 149 ± 15. Det var imidlertid ingen av musene i HCT-8-NC kontrollgruppe viser mesenteriske lymfeknutemetastaser (fig. 3C, 3D). Til sammen bekreftet disse resultatene at høyt nivå av MIR-145 kan fremme CRC migrasjon og invasjon
in vitro Hotell og
in vivo.
5. Analyse av ulikt uttrykte proteiner
De ovennevnte funnene indikerte at MIR-145 fungerer som en prometastatic miRNA i CRC. Slik tar sikte på å få en bedre forståelse av proteiner berørt direkte eller indirekte av MIR-145 overekspresjon, HCT-8-MIR-145 og HCT-8-NC celler ble lysert, og utsatt for iTRAQ merking, 2DLC-ESI-MS /MS analyse. Totalt 1117 distinkte proteiner ble identifisert og kvantifisert, som deretter ble filtrert fra med manuelt valgte filter utelukkelses parametere. Vi tok en 1,3 ganger endring cut-off for iTRAQ forholdet å klassifisere proteiner som opp eller ned regulering. Dette cut-off ble anvendt fordi flere tidligere iTRAQ studier utført i vårt laboratorium har vist at det tekniske variasjonen var konsekvent under 30%, kriteriet for cutoff ble også akseptert av tidligere forskning [12]. Proteinene ble vurdert opp eller nedregulert bare når deres uttrykksforhold (HCT-8-Mir-145 celler vs. HCT-8-NC celler) var 1,3 (1 x 1,3) eller 0,77 (1 x 1,3) oG viste statistisk signifikans.
Dermed 13 proteiner ble vist ut som differensielt uttrykte proteiner, inkludert 7 signifikant oppregulert proteiner og 6 bemerkelsesverdig nedregulert proteiner (tabell S2, S3). Blant 13 differensielt uttrykte proteiner, ble opp-regulering av varmesjokkprotein 27 (HSP-27) validert ved hjelp av western blotting (fig. 4A). Vi valgte derfor Hsp-27 for videre etterforskning.
(A) Uttrykket nivåer av Hsp-27 ble undersøkt i HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC celler ved western blotting analyse. (B) Ekspresjon HSP-27-proteinet ble påvist i CRC og tilstøtende normale vev ved Western blot-analyse. De relative Hsp27 /aktin prosenter av enkelte band er vist som gjennomsnittet + SD av verdier som stammer fra alle pasientprøver (Non-svulstvev, n = 47; LNM-P svulstvev, n = 41; LNM-N svulstvev, n = 43). (C-D) MiR-145 Forbedret Hsp-27 Stabilitet CRC Cells.HCT-8-MIR-145 eller HCT-8-NC-celler ble inkubert med proteinsynteseinhibitor cycloheximide (CHX, 0,5 ug /ul) (C) eller proteasominhibitor MG-132 (5 uM) (D) i 24 timer. Nivået av total Hsp-27 ble påvist ved western blotting-analyse. De relative Hsp27 /aktin prosenter av enkelte band er vist som gjennomsnitt ± SD av verdier normalisert til beta-aktin.
For ytterligere å bekrefte tilknytningen mellom Hsp-27 protein og Mir-145 uttrykk i CRC vi analyserte deres uttrykk profil i primære humane vevsprøver (inkludert 41 CRC med LNM, 43 CRC uten LNM, 47 tilstøtende ikke-svulstvev) ved hjelp av western blotting eller QRT-PCR hhv. Blant de 131 menneskelige vevsprøver, uttrykk for Hsp-27 var signifikant oppregulert i CRC med lymfeknutemetastase i forhold til at uten lymfeknutemetastaser. Denne trenden er i tråd med Mir-145 uttrykk profil. Det var en sterk, positiv korrelasjon (Spearman) mellom Hsp-27 protein og Mir-145 uttrykk (
r
= 0,402;
P
0,0001). (Fig.4B, fig S2 og S3 i File S1). Disse resultatene indikerte at MIR-145 er involvert, i det minste delvis, i opp-regulering HSP-27 proteinekspresjon.
6. Forbedring av Hsp-27 stabilitet ved MIR-145 i CRC celler
Det var ingen påviselig endring av Hsp-27 transkripsjonsnivået etter MIR-145 oppregulering (data ikke vist). Bare protein, men ikke mRNA av Hsp-27 ble modulert av MIR-145, noe som tyder på denne reguleringen er post- transkripsjonen. For ytterligere å undersøke protein oppregulering HSP-27 påvirket av MIR-145, vi har oppdaget hvorvidt MIR-145 forbedret stabilitet HSP-27-proteinet. HCT-8-MIR-145-celler og HCT-8-NC-celler ble behandlet med enten den proteinsynteseinhibitor, cykloheksimid (CHX), eller proteasominhibitor, MG-132, respektivt. Som illustrert i Fig.4C og 4D, forbedret uttrykk for Hsp-27 i MIR-145 overuttrykt celler ble avskaffet da inkubert med MG132. Et slikt fenomen ble ikke funnet når inkubert med CHX. Resultatene indikerte at MIR-145 ikke kunne påvirke proteinsyntesen av Hsp-27, men kan redusere frekvensen av Hsp-27 degradering, som forbedret sin stabilitet.
7. Nedregulering av Hsp-27 svekket den onkogene effekten av MIR-145
For å verifisere om oppregulering av Hsp-27 bidrar til MIR-145-indusert motilitet i CRC celle, en serie med analyser var utføres
in vitro
. Hsp-27 siRNA eller kontrollere siRNA ble først transfektert inn HCT-8-MIR-145 celler. Reduksjonen av protein ekspresjon HSP-27 ble bekreftet via Western-blotting (fig. 5A). Cellemigrasjon ble deretter observert ved hjelp av sårheling analysen (fig. 5B). Disse resultatene viste at mobiliteten av HCT-8-MIR-145-celler transfektert med Hsp-27 siRNA var bemerkelsesverdig lavere enn for celler transfektert med kontroll siRNA. Et lignende resultat ble også oppnådd i en celle invasjon assay. Transwell-Matrigel penetrasjon assay eksperimenter ble utført med HCT-8-MIR-145-celler transfektert med Hsp-27 siRNA eller kontroll siRNA. Sammenlignet med kontrollen, slå ned HSP-27 inhiberte invasjon evnen til HCT-8-MIR-145-celler (fig. 5C). De andre tre forskjellige siRNA oligos av Hsp-27 var i stand til å rekapitulere lignende fenotyper (Fig. S4 i File S1). Disse resultatene manifestert som Hsp-27 var en viktig nedstrøms mekler under prometastasis relatert til Mir-145.
(A) HCT-8-mir-145 (mir-145) eller HCT-8-NC (NC ) celler ble transfektert med Hsp-27 siRNA (mir-145 + si-hsp27) eller en negativ kontroll siRNA (mir-145 + mock). Uttrykket HSP-27-proteinet ble påvist ved western blot-analyse. (B) sårhelende assay for å evaluere effekten HSP-27 siRNA i HCT-8-MIR-145-celler. (C) knockdown av Hsp-27 av siRNA i HCT-8-MIR-145 celler betydelig hemmet celle invasjon. Bildene var representanter fra minst tre uavhengige eksperimenter. Gjennomsnittlig antall invasjon celletallet i hvert felt fra minst tre uavhengige eksperimenter ± SD er vist ved kolonnekromatografi figur. **
P
. 0,01
Diskusjoner
metastaser er nøkkelen kjennetegn på malignance. Selv om det er mange rapporter om uttrykket av MIR-145 i kreft, er rapporten fra funksjon av MIR-145 i metastase utvikling av CRC sjelden noen. I denne studien undersøkte vi ekspresjonen av MIR-145 i den primære kreftvevet av CRC pasienter med eller uten lymfeknutemetastase. Mir-145 ble identifisert til å være underexpressed i CRC prøver med eller uten lymfeknutemetastaser sammenlignet med nærliggende normalt vev henholdsvis, som er konsistent med tidligere rapporter fra andre [14] – [16]. Imidlertid viste uttrykk for MIR-145 en dramatisk oppregulering i CRC med lymfeknutemetastaser, som var ute av vår forventning. Fordi til vår kunnskap, uttrykk utviklingen av tumorassosierte gener vanligvis bevege seg mot en retning langs utviklingen av svulsten. For å bekrefte resultatet av vår foreløpige observasjon, ble den presise uttrykk for MIR-145 i den primære CRC vev av 103 pasienter med lymfeknutemetastaser og 99 pasienter uten lymfeknutemetastase bestemmes ved hjelp QRT-PCR. Hver prøve ble analysert i triplikat og normalisert mot et endogent kontroll U6. Strenge kalibreringsstandarder og store mengder av vevsprøver brukt i denne studien sikret troverdigheten til våre resultater. Vi har funnet ingen signifikant forskjell i sammenligning av MIR-145 ekspresjonsnivået i tilstøtende normale vev mellom CRC med eller uten lymfeknutemetastase. Imidlertid ble det observert en klar sammenheng mellom Mir-145 uttrykk og lymfatiske metastasering. I disse CRC pasientprøver, MIR-145 viste signifikant høyere uttrykk i kreft med lymfeknutemetastaser enn de uten lymfeknutemetastaser, som ytterligere bekreftet vår rekke resultat. Videre, som vi analyserte data fra flere andre mirnas, vi også observert lignende ekspresjonsprofilen av reduksjon, gjenoppretting, men ikke lenger ned-regulering, sammen med utvikling av CRC (upubliserte data). Disse observasjoner av andre CRC relatert mirnas bekreftet nøyaktigheten av våre resultater, noe som antydet at en miRNA kanskje vise forskjellig uttrykk profil i ulike stadier av kreft. Dess stadium forskjell, synes ekspresjonen av MIR-145 for å være avhengig av type vev. For eksempel, Sachdeva et al fant at nedregulering av MIR-145 var mer fremtredende i CRC enn i brystkreft [17]. Alle disse observasjonene tydet på at noen mirnas kan multitasking ved å kommunisere med ulike målgrupper gener i ulike celler og vev [18].
For å undersøke forholdet mellom oppregulering av MIR-145 med spredning av tykk- og endetarmskreft, MIR-145 gain-of-funksjon studier ble utført på menneske CRC celler ved hjelp lentivirus system. Våre resultater viste at oppregulering av MIR-145 kan fremme CRC migrasjon og invasjon
in vitro Hotell og
in vivo, etter mens ingen effekt på cellevekst ble observert. Disse dataene var inkonsekvent med noen andre rapporter som viste anti-onkogen rolle MIR-145 i metastasering. Imidlertid data utledet fra disse observasjonene var enten fra flere enn tykktarm [17] vev, [19] – [20]. Arndt et al rapporterte en onkogen rolle MIR-145 i CRC, som er i god overensstemmelse med resultatene våre [21]. Disse funnene ytterligere bekreftet at funksjonen av MIR-145 relatert til kreftutvikling er vev-type spesifikke.
Denne studien gir den første bevis for at MIR-145 fungerer primært som en prometastatic miRNA i avansert CRC. Det er generelt at enkelte spesifikke miRNA kan regulere flere mål gener, noe som tyder på at enkelt miRNA kan utføre en rekke funksjoner ved å målrette ulike gener i ulike cellulære sammenhenger [22]. På et tidlig stadium av CRC, er MIR-145 nedregulert, noe som indikerer dens mål relatert til celleproliferasjon. På avansert stadium, kan høy uttrykk for MIR-145 er knyttet til målene mot metastaser. MiR-17-5p, et godt undersøkt miRNA, kunne målrette pro- og anti-proliferative gener og fungere som både et onkogen og tumor suppressor i forskjellige krefttyper [13], [23] – [24]. MiR-143, en annen kreft assosiert miRNA, er dens uttrykk alltid konsekvent med MIR-145 (det gjorde vi ikke eksamen sin co-uttrykk med MIR-145 i vår studie), viste multifunksjons i kreft metastase [25]. Samlet utgjør disse funnene støtter hypotesen om at MIR-145 kan spille en kompleks funksjon i utviklingen av CRC.
For å avsløre mulige effektor gener som deltar i denne funksjonen, identifiserte vi cellulære proteiner som var direkte eller indirekte regulert av MIR-145 bruker iTRAQ merking og 2DLC-ESI-MS /MS. Våre analyser viser at Hsp-27 var oppregulert i MIR-145 overexpressed CRC celler. Varmesjokkprotein 27 (HSP-27), et viktig medlem av den lille Hsp familien, er allestedsnærværende uttrykt i forskjellige celletyper og er involvert i cellulære responser for en rekke forskjellige spenninger som varmesjokk, hypertonisk spenning, oksidativt stress [26] – [27]. Høye nivåer HSP-27 har blitt funnet å være assosiert med metastase av flere tumortyper inkludert CRC, prostata kreft, magekreft, leverkreft, hode- og halsplatecelle kreft [28] – [30]. Spesielt har det blitt bevist at økt ekspresjonsnivå HSP-27 i CRC var relatert til den lymfeknutemetastase [31] – [32]. Våre resultater viste at det var en sterk, positiv korrelasjon mellom Hsp-27 protein og MIR-145-ekspresjon i primære, humane vevsprøver, noe som indikerte at MIR-145 var involvert, i det minste delvis, i opp-regulering HSP-27 proteinet uttrykket .
knockdown av Hsp-27 genekspresjon av siRNA ble funnet å reversere MIR-145-mediert induksjon av CRC celle migrasjon i vår studie. Rollen MIR-145 i vedlikehold av høyt nivå av Hsp-27 var ikke gjennom direkte genet targeting men stabilisering av Hsp-27. Selv om rollen og kliniske resultatet av Hsp-27 i primære svulster har blitt godt undersøkt og dokumentert [33], er dens funksjon i metastase invasjonen fortsatt uklart. Ytterligere undersøkelser for å identifisere mekanismen av Hsp-27 er involvert i CRC metastaser vil berike vår forståelse av oppregulering av MIR-145 i CRC.
I sammendraget, denne studien viste at oppregulering av MIR -145 bidratt til lymfeknutemetastase av CRC. Mekanismen for dette bidraget forbundet med stabilisering HSP-27, et protein som spiller en viktig rolle i å fremme metastasering. Fremtidige retningen for evaluering av MIR-145 bør fokusere på mekanismen studie som kan føre til sin søknad i metastase diagnostisering og behandling av CRC.
Materialer og metoder
Kliniske prøver
De vevsprøver analysert i denne studien ble innhentet fra 202 pasienter (117 menn og 85 kvinner) som gjennomgår kirurgisk reseksjon for CRC ved Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina. Prøvene ble brukt med skriftlig informert samtykke fra pasienter og med godkjenning av den kinesiske Academy of Medical Sciences Cancer Hospital. Ingen av pasientene fikk kjemoterapi eller radioterapi før kirurgisk reseksjon. Hele prøvene gjenspeiler den naturlige fordelingen av clinicopathological kjennetegn ved CRC pasienter. Resected prøvene ble histologisk undersøkt av hematoxylin og eosin farging. Primære tumorvev og tilsvarende tilstøtende ikke-tumorvev ble umiddelbart samlet etter kirurgisk fjerning og snap-frosset i flytende nitrogen for videre bruk. Vi delte denne pasienten kohort inn i to grupper. De med bekreftet LNM ble betegnet som lymfeknute positive (LNP) gruppe og de uten påviselig LNM ble kalt lymfeknute negative (LNN) gruppe. Alle saker ble gjennomgått og bekreftet av to erfarne patologer. De kliniske kjennetegn ved disse prøvene er vist i tabell 1.
Cell kultur
Den menneskelige CRC cellelinje HCT-8 ble kjøpt fra Institutt for medisinske basalfag Chinese Academy of Medical Sciences «cellekultur center (Beijing, Kina). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, CA), 100 E /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble inkubert ved 37 ° C og tilsatt 5% CO
2 i et fuktet kammer.
Microarray analyse
åtte primær med kolorektal kreft vev avledet fra trinn II-III kolorektal kreftpasienter med (n = 4) eller uten (n = 4) lymfeknutemetastase ble oppsamlet og uttrykket profiler av miRNA ble bestemt ved bruk av Agilent miRNA microarray. Kort fortalt ble total RNA ekstrahert fra tumorprøver ved hjelp av Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion Inc., TX, USA). Kvaliteten og kvantiteten av RNA prøver ble vurdert av en 2100 Bioanalyzer hjelp av RNA 6000 Pico LabChip kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Den microarray inneholder prober for 851 menneske mirnas fra Sanger databasen v.12.0. De microarray eksperimenter ble utført ved ShanghaiBio Corporation bruker Agilent miRNA merking reagens og Hybridisering Kits, Agilent menneskelige miRNA array (V2) og Agilent microarray scanner. All originalt microarray data avsettes i NCBI GEO database [GSE48074].
RNA ekstraksjon og sanntids kvantitativ revers transkripsjon-polymerase chain reaction
miRNA ble renset fra dyrkede celler eller vev som bruker Qiagen miRNeasy Mini Kit. Omvendt-transkripsjonsreaksjoner ble utført ved hjelp av MiScript Reverse Transcription Kit (Qiagen, Tyskland.). MiScript SYBR Grønn PCR Kit i kombinasjon med miRNA-spesifikke primere (mir-29b-1 * Art.nr. MS00009289, mir-95 Art.nr. MS00010906, mir-100 Art.nr. MS00003388, mir-125b Art.nr. MS00006629, mir-152 Art.nr. MS00003591, mir-376c Art.nr. MS00004046, mir-199B Art.nr. MS00003731, mir-145 Art.nr. MS00003528, mir-99a Art.nr. MS00003374, mir-1274a Art.nr. MS00014420, mir-99b Art.nr. MS00032165, Qiagen, Tyskland.) ble brukt til å oppdage modne mirnas på LightCycler 480 (Roche, Basel, Sveits). Den relative ekspresjon av miRNA i forhold til U6 (kat. Nr. MS00033740, Qiagen, Tyskland.) Ble beregnet ved anvendelse av -ΔCt metode. Alle QRT-PCR reaksjoner ble utført i tre eksemplarer.
Generering av lentivirus å oppnå gevinst på MIR-145 funksjon
Lentiviral pGCsil-GFP Vector ble brukt til å frakte menneske pre-MIR-145 (MIR -145) eller ikke-fungerende kontroll (NC). Lentiviral vektor konstruksjon og produksjon av høy titer lentiviral partiklene ble gjort av Genechem biologi selskap. De genererte lentiviruses ble anvendt for å infisere HCT-8 i 24-48 timer ved 1-5 MOI, og uttrykket nivåer av MIR-145 ble bestemt ved QRT-PCR-analyser. Infiserte populasjoner som oppviser mellom 70 til 90% grønne fluorescente celler ble anvendt for senere eksperimentering.
proliferasjonsanalyse
Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 10% fosterserum. 1 x 10
3-celler ble sådd ut i flatbunnede 96 brønners plater og inkubert ved 37 ° C i 5% CO2. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av celletelling Kit-8 (Dojindo Laboratories) på day1, day3 og day5. For cellesyklusanalyse, ble cellene vasket og fiksert med iskald 75% (v /v) etanol ved -20 ° C i 2 timer, deretter farget med PI ved en konsentrasjon på 50 ug /ml i nærvær av RNase A ( 100 ug /ml). DNA-innholdet ble analysert ved flowcytometri analyse (Beckman Coulter, USA)
Cell migrasjon /invasjon analyser
Cell motilitet og invasivitet ble bestemt av en 24 godt transwell plate (8 mikrometer porestørrelse.; Costar), som beskrevet tidligere.
10 korthet, for Transwell migrasjon analyser, 1 × 10
4 celler ble plassert på toppen kammer foret med noncoated membran. For invasjon analyser, 3 × 10
4-celler ble plassert på øvre kammeret til hver innsats belagt med 200 mg /ml Matrigel (BD Biosciences, CA, USA).
In vivo
metastase assays
in vivo
metastase assays, 5 x 10
4 HCT-8-MIR-145 celler eller HCT-8-NC-celler ble injisert inn i leveren hos nakne mus etterfulgt av kirurgisk sutur (tre i hver gruppe, og hunn nu /nu). Etter 2 uker ble musene drept, deres lever ble dissekert, og de mesenteriske lymfeknutemetastaser ble tellet. De nakne mus ble kjøpt fra Vital River (Beijing, Kina) og oppvokst i en bestemt patogen gratis (SPF) dyr laboratorium.
