Abstract
Infeksjon med humant papillomavirus (HPV) kan forårsake livmorhals intraepitelial neoplasi (CIN) og kreft. Nedregulering av E6 og E7 uttrykk kan være ansvarlig for de positive kliniske resultater observert med IFN behandling, men det molekylære grunnlaget har ikke vært godt bestemt. Som mirnas spiller en viktig rolle i HPV-indusert karsinogenese cervical, hypoteser om vi at IFN-β kan regulere uttrykket av spesifikke mirnas i cervikale kreftceller, og at disse mirnas kan mediere E6 og E7 uttrykk, og dermed modulere deres onkogene potensial. I denne studien fant vi at MIR-129-5p å være en kandidat IFN-β induserbar miRNA. MiR-129-5p nivåer gradvis avta med utviklingen av cervikal intraepitelial lesjoner. Manipulering av MIR-129-5p uttrykk i Hela celler modulerer HPV-18 E6 og E7 viral genekspresjon. Eksogent MIR-129-5p inhiberer celleproliferasjon i HeLa-celler, fremmer apoptose og blokkerer cellesyklusprogresjon i HeLa-celler. SP1 er en direkte mål av MIR-129-5p i Hela celler. Denne studien er den første rapporten av en mobil miRNA med anti-HPV aktivitet og gir ny innsikt i reguleringsmekanismer mellom HPV og IFN-systemet i vertsceller på miRNA nivå
Citation. Zhang J, Li S Yan Q, Chen X, Yang Y, Liu X, et al. (2013) interferon-β Induced
mikroRNA-129-5p
nedregulerer HPV-18 E6 og E7 Viral Gene Expression ved målretting SP1 i livmorhalskreftceller. PLoS ONE 8 (12): e81366. doi: 10,1371 /journal.pone.0081366
Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, USA
mottatt: 11 juli 2013; Godkjent: 11 oktober 2013; Publisert: 16.12.2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Den nåværende studien ble støttet av National Natural Science fond i Kina (nr. 81072139 og 30872760) og 2011 Shanghai kommunale spesiell grunnlaget for helsetjenester (No.201002013). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cervikal karsinom og livmorhalsen (CIN) forårsaket av vedvarende infeksjon med høyrisiko humant papillomavirus (HPV) serotyper, vanligst HPV16 og HPV18 [1]. Derfor behandling av HPV-infeksjon er nøkkelen til å forebygge livmorhalskreft og CIN. To oncoproteiner, E6 og E7, som kodet for av HPV16 og HPV18, kan binde seg til og stimulere nedbrytning av tumor-suppressorer p53 og pRb [2] – [5]. IFN har vært mye brukt i behandling av CIN og livmorhalskreft. Nedregulering av E6 og E7 uttrykk kan være ansvarlig for de positive kliniske resultater observert med IFN behandling, men det molekylære grunnlaget har ikke vært godt bestemt.
microRNAs (mirnas) er 19-25 nt regulatoriske RNA som deltar i reguleringen av ulike biologiske funksjoner samt i forsvaret mot patogener i mange eukaryote linjene. De er generelt antatt å virke ved binding til ufullkomment komplementære sekvenser i 3’untranslated (UTR) region av mål-gener, noe som resulterer i redusert oversettelse eller degradering av målet transkriptet. Spesielt sekvensen komplementært i 6-8 basepar «seed region» ved 5 «ende av mRNA-miRNA heterodupleks ser ut til å bestemme spesifisiteten av miRNA-targetRNA interaksjoner. Mirnas kan ha pleiotrope effekter på celleproliferasjon, apoptose og celledifferensiering [6]. Endringer i cellulære miRNA mønstre i livmorhalskreft vev eller livmorhalskreftceller har blitt rapportert. Nedregulering av human MIR-218 [7], [8] og MIR-34a [9] i livmorhalskreft celler ble adressert til HPV 16 E6 onkogen, mens hemming av MIR-21 i HPV-18-inneholdende HeLa cervikale kreftceller fører til en sterk undertrykkelse av celleproliferasjon [10]. Det virker dermed som mirnas spiller en viktig rolle i livmorhalskreftutvikling av HPV.
mirnas kan spille en rolle i IFN-β indusert E6 og E7 undertrykkelse. Det har blitt 1shown mirnas kan induseres ved IFN-β. I RSA-celler, kan IFN-β indusere MIR-431 uttrykk, som kan ned-regulere IGF1R og IRS2 ekspresjon og følgelig hemme celleproliferasjon ved å undertrykke den MAPK-reaksjonsveien [11]. I hepatocytter, medierer IFN-β modulering av ekspresjon av tallrike cellulære mirnas med nesten perfekt komplementaritet i deres frø sekvenser med HCV RNA-genom som er i stand til å inhibere HCV-replikasjon og smitte [12]. Som mirnas spiller en viktig rolle i HPV-indusert karsinogenese cervical, hypoteser om vi at IFN-β kan regulere uttrykket av spesifikke mirnas i cervikale kreftceller, og at disse mirnas kan mediere E6 og E7 uttrykk, og dermed modulere deres onkogene potensial. For å bekrefte dette, vi skjermet for mirnas uttrykt og forskjellig regulert i HPV-18 positive Hela celler etter eksponering for IFN-β, og vi fant ut at MIR-129-5p å være en kandidat IFN-P induserbar miRNA som kan nedregulere E6 og E7 uttrykket.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og menneskelig vev
HPV 18-positive Hela cellelinje [13], HPV 16-negative Siha cellelinje [13] , HPV-negative C33A livmorhalskreft cellelinje [13] og godt differensiert cervikale karsinomer HCC94-cellelinjen [14] ble anvendt i denne studien. Alle disse celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% FBS ved 37 ° C og 5% CO
2. Cellelinjene ble høstet etter IFN-β (3 × 10
5IU L
-1) behandling i 2 timer.
Normal livmorhalsen og livmorhalskreft vev ble oppnådd fra kvinner i alderen 28 til 77 år gammel. Fire normal cervical prøver ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk hysterektomi for å behandle andre typer sykdommer som myom eller adenomyosis. Ingen av pasientene hadde gjennomgått hormonbehandling, strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. Etappene og histologiske graderinger av disse svulstene ble etablert i henhold til kriteriene for International Federation of gynekologi og fødselshjelp (FIGO). Hver vevsprøve ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til RNA-ekstraksjon. Skriftlig og informert samtykke ble innhentet fra hver pasient, og studien ble godkjent av etisk komité for medisinsk fakultet Shanghai Jiao Tong University. Kliniske og patologiske data relatert til de kliniske prøvene er presentert i tabell 1.
Microarray ekspresjonsanalyse og dataanalyse
Total RNA i celler eller vev ble isolert ved anvendelse av Tri-Reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter å ha passert RNA kvalitetsmålinger i en Nanodrop instrument ble prøvene merket med miRCURY ™ Hy3 ™ /Hy5 ™ Strøm merking kit og hybridisert på miRCURY ™ LNA Array (v.11.0). Prøvene ble hybridisert med en hybridisering stasjon følge protokollen beskrevet av produsenten. Skanning ble utført med Axon GenePix 4000B microarray scanner. GenePix pro V6.0 ble brukt til å lese den rå bildeintensiteten. Grenseverdiene som brukes til å screene forskjellig uttrykt mirnas var fold endrer ≥1.5 eller ≤0.7, og
P
verdier ≤0.05 i t-tester ble ansett som signifikant.
Crucial frø sekvens komplementaritet analyse
Array databehandling og avgjørende frø sekvens komplementaritet analyser ble utført ved hjelp av nettsidene (https://www.mirbase.org/, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db = PubMed og https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/).
Analyse av miRNA og mRNA ved qPCR
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler og vev ved hjelp av Tri-reagens. For miRNA analysen ble modne mirnas revers transkribert fra total RNA ved hjelp av spesifikke miRNA RT-primere i TAQMAN mikroRNA Analyser og reagenser i TaqMan mikroRNA Reverse Transcription kit. qPCR ble utført ved bruk av TaqMan mikroRNA Analyse primere med TaqMan Universal PCR Master Mix og analysert med en ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner.
U6B
ble oppdaget som en intern kontroll for å normalisere alle data. Analyse navn for
MIR-129-5p Hotell og
U6B
var henholdsvis HSA-mir-129-5p og RNU6B, (Applied Biosystems). CDNA ble generert ved hjelp av stats Script RT Reagent Kit (Takara, Dalian, PRC). For kvantifisering av HPV18
E6
, HPV18
E7 Hotell og
ISG54
, real-time PCR ble utført på ABI Prism 7000 Sequence Detection System med SYBR Premiks Ex Taq ( Takara). Primersekvensene er vist i tabell 2. For alle qPCR-analyser, ble uttrykk beregnet ved formelen 2
(- ΔΔCt), hvor ΔCt er forskjellen mellom genet Ct og normaliser gen Ct. Ct representerer den terskelsyklusen ved hvilken fluorescens stiger statistisk signifikant over grunnlinjen. Forsøk ble utført in triplo i tre uavhengige eksperimenter.
celletransfeksjoner
Cellene ble vasket med PBS og byttet til antibiotika-fritt vekstmedium for 24-48 timer før transfeksjon. Cellene ble transient transfektert med
pre-MIR-129-5p
, uspesifikk miRNA kontroll (pre-MIR-negativ) eller blank kontroll (Applied Biosystems) i Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, California) bruker SIPORT NeoFX Transfeksjon middel (Applied Biosystems) etter produsentens protokoll. Mediet ble erstattet 8 timer senere. Like kopiantall av plasmider ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) etter produsentens protokoll. Luciferase reporter vektor bærer målse for
MIR-129-5p
av
SP1
3′-UTR regionen ble kjøpt av Shanghai choseasy co., Ltd. detaljert informasjon om de konstruerer brukt i dette forsøket er vist i tabell 3.
proliferasjonsanalyser
Cells (3000 per brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater og dyrket i 72 timer etter transfeksjon (sluttkonsentrasjon miRNA på 100 nM) i DMEM /F12 inneholdende 10% FBS. Celleproliferasjon ble dokumentert hver 24. time i 3 dager ved å bruke kolorimetrisk MTT-analysen (Sigma, St. Louis, MO), og absorbansen ved 490 nm ble evaluert ved en Spectra Max 190 mikroplateavleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
celler, inkludert transfekterte celler, ble sultet i 24 timer ved å erstatte mediet med fenol rød-fri, og serum-fritt DMEM /F12-medium (HyClone Laboratories, Logan, UT), og passende bærer-kontroll med fenol rød-fri medium inneholdende 5% trekull-strippet FBS (HyClone Laboratories) i 48 timer. Celleproliferasjon ble dokumentert hver 24. time i 2 dager. Innenfor en enkelt eksperiment, ble proliferasjon under hver betingelse testet tre ganger, og den samlede eksperiment ble gjentatt minst to ganger.
cellesyklusanalyse
Celler ble fiksert med 70% etanol ved 72 timer etter transfeksjon og farget med 25 ug /ml PI (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, iN) i FACS-buffer (PBS inneholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA), 0,05% Triton X-100, og 50 pg /ml RNase A) . Etter 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys, ble cellene analysert via flowcytometri ved anvendelse av en Becton Dickinson FACScan, og de fraksjoner av cellene i G0 /G1, S og G2 /M-fasene ble analysert ved hjelp av Cell quest Pro-programvare (BD biovitenskap, San Jose, California). Forsøk ble utført in triplo i tre uavhengige eksperimenter.
Annexin V-analyse
Prøvene ble vasket med PBS og ved hjelp av Annexin V-FITC og PI farging for bestemmelse av fosfatidylserin eksponering på den ytre plasmamembran . Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys, ble prøvene kvantifisert ved strømningscytometri ved å bruke en Becton Dickinson FACScan. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer i tre uavhengige eksperimenter.
luciferaserapportørplasmid analyser
For luciferasepreparater analyser, celler (15.000 per brønn) ble belagt 24 timer før transfeksjon på hvit, klarbunnet 96-brønn plater. Cellene ble ko-transfektert med 100 ng av
SP1
3′-UTR reporter plasmid med 50 nM pre-Mir konstruere ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Luciferase aktivitet ble analysert 24 timer etter transfeksjon med Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) og ble målt med en Envision Plate-kortleser (Perkin Elmer Inc., Wellesley, MA). Prøvene ble testet i triplikat i tre uavhengige eksperimenter.
Western blot-analyse
Etter de angitte behandlinger, ble cellene høstet og protein fremstilt ved hjelp av NE-PER Nuclear og Cytoplasmatisk Ekstraksjonsreagens (Pierce, Rockford , IL) med proteasehemmer cocktail (Roche Diagnostics). Alle ekstraktene ble lysert i henhold til produsentens protokoll. Totalt proteininnhold ble bestemt ved hjelp av Bradford protein-metoden ved å bruke BCA-proteinanalysesettet (Pierce). Proteiner (60 ug) ble applisert på prefabrikerte 4% stabling, 10% Tris-glysingeler og separert ved gelelektroforese, etterfulgt av elektroblotting på en PVDF-membran. Etter vasking med Tris-bufret saltvann, ble membranene blokkert med 5% BSA /PBS i 1 time. Membraner ble inkubert med kanin polyklonale antistoffer rettet mot SP1 og p21 (1:1000 fortynning) (Abcam, UK). Membranene ble deretter inkubert med et geit anti-kanin sekundært antistoff (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og blottet proteinene ble visualisert ved hjelp av den forbedrede kjemi-luminescens deteksjonssystem (Pierce), med pre-farget markører (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) som molekylære størrelse standarder. Styrken på proteinbånd ble kvantifisert ved hjelp av Image J programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
Statistisk analyse
Alle testene ble utført med Statistisk Package for Social Sciences programvare versjon 17.0 (Chicago, IL, USA). Data er representert som menes med standardavvik (SD). Statistisk signifikans ble bestemt med Student t-test, og
P
verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske tester var tosidig.
Resultater
miRNA uttrykket profilering i Hela celler indusert av IFN-β
De forskjellig uttrykt mirnas mellom ubehandlet og IFN-β indusert Hela cellene ble analysert ved anvendelse av mikromatriser. Uttrykk for
MIR-129-5p
,
MIR-637
,
MIR-744 Hotell og
MIR-943
ble funnet å være mest induseres i HeLa-celler ved IFN-β og utvalgt for videre analyse (tabell 4, og S1 fig.). Frøet sekvens av
MIR-129-5p
vises perfekt komplementaritet med HPV-18 genomet (Fig. 1). Kvantitativ real-time PCR (qPCR) var gjennomført så ut til å validere microarray analyse, og resultatene viste at uttrykk for
miRNA-744
,
MIR-943 Hotell og
speil 129-5p
var i utgangspunktet konsistent med at av microarray; Tidsforløpet analyse av uttrykket viste at induksjon av
MIR-129-5p
skjedde raskt, med en topp i løpet av 48 timer. I likhet med induksjon av
ISG54
, en godt karakterisert IFN-β-regulert gen, oppregulering av
MIR-129-5p
fulgte en klassisk dose-responskurve mellom 3 og 3000 IE
-1 ml IFN-β (fig. 2).
(A) Validering av microarray data ved qPCR. Triplikate bestemmelser ble utført for hver prøve. Induksjoner av kjente IFN-regulerte gener
ISG54 Hotell og
ISG56
vises for comparsion. (B) Tidsforløp av miRNA induksjon ved IFN-β. Hela celler ble stimulert med 300 IE ml
-1 IFN-β i de angitte tidsrom, og
MIR-129-5p Kjøpe og
ISG54 Twitter /
ISG56
uttrykk ble kvantifisert ved qPCR. (C) Dose-responsanalyse av miRNA induksjon ved IFN-β. Hela celler ble stimulert med de angitte doser av IFN-β i 2 timer, og
MIR-129-5p Hotell og
ISG54 Twitter /
ISG56
uttrykk ble kvantifisert ved qPCR.
MiR-129-5p
nivåer gradvis avta med utviklingen av cervikal intraepitelial lesjoner og korrelerer med HPV-18 E6 og E7 uttrykk
av qPCR analyse i menneskelige cervikal intraepitelial lesjon prøver og normale cervical vev,
MIR-129-5p
uttrykk nivåer var mye lavere i kreft enn i CIN i-II og normal livmorhalsprøver (fig. 3 A). gjennomsnittlig uttrykk for
MIR-129-5p
var 10,90 ± 4,01, 4,54 ± 3,12, henholdsvis 1,07 ± 0,65 og 0,57 ± 0,67, i normal cervical vev (kontroll), CIN I-II-gruppen, CIN III gruppe, og plateepitelkarsinom grupper. Statistisk signifikante forskjeller i
MIR-129-5p
uttrykk ble funnet når man sammenligner de fire gruppene (
P
0,05). De kliniske stadier og patologiske grader av CIN I-II gruppen sammenlignet med de andre gruppene ble bekreftet å være signifikant forskjellig (
P
0,05). HPV-18 E6 og E7 uttrykk ble betydelig økt fra normal cervix gruppen, CIN I-II-gruppen, CIN III gruppe, og plateepitelkarsinom gruppen (P 0,05, figur 3 B, C.). De gjennomsnittlige uttrykk for HPV-18 E6 var 1,67 ± 0,41, 3,55 ± 0,73, 4,70 ± 0,53 og 0,94 ± 0,33, henholdsvis i de normale cervikale vev (kontroll), CIN I-II-gruppe, CIN III gruppe, og karsinomer grupper, mens de gjennomsnittlige uttrykk for HPV-16-E7 var 1,90 ± 0,35, 3,67 ± 0,55, 6,87 ± 1,33 og 1,23 ± 0,24 i disse prøvene. Negativ korrelasjon ble funnet mellom uttrykket av MIR-129-5p og HPV-18 E6 /E7 i livmorhals vevsprøver (P . 0.05, figur 3 D, E).
(A) Uttrykket av miRNA-129-5p i menneskelige cervikal intraepitelial lesjon prøver og normale cervical vev. (B) Ekspresjon av HPV-18 E6 i de samme prøvene. (C) Et ekspresjon av HPV-18 E7 i disse prøvene. (D, E) Sammenheng mellom uttrykk for HPV-18 E6 /E7 og MIR-129 i disse prøvene.
Manipulering av
MIR-129-5p
uttrykk i Hela celler modulerer HPV-18
E6 Hotell og
E7
viral genekspresjon
For å vurdere om
MIR-129-5p
har en funksjonell rolle i ned- regulering av HPV18
E6 Hotell og
E7
, vi manipulert uttrykket nivået av
MIR-129-5p
i Hela celler. De tre gruppene inkludert kontrollceller (ubehandlede), celler transfektert med uspesifikk miRNA kontroll
(pre-MIR-negative)
, celler transfektert med
pre-MIR-129
. På 72 timer etter transient transfeksjon av pre-miRNAs, mRNA uttrykk for HPV-18
E6 Hotell og
E7
i HeLa celler ble oppdaget av qPCR. Transfeksjon av
pre-MIR-129-5p
betydelig redusert HPV-18
E6 Hotell og
E7
mRNA (fig. 4B, fig. 4C og S2 fig.), og denne effekten var meget spesifikk, som
pre-MIR-negative
transfeksjon viste ingen effekt på HPV-18 E6 og E7 uttrykk.
fig. (A) viste at effektiviteten av mir-129 transfeksjon. Brett endringer av uttrykk for (B) HPV-18
E6 Hotell og (C) HPV-18
E7
i Hela celler bestemmes av qPCR. Forsøket ble gjentatt to ganger, hver med tre replikater. Midler (barer) og SDC (feilfelt) er vist. *
P
. 0,001
Eksogene
MIR-129-5p
hemmer celledeling i Hela celler
Vi neste testet om økt nivåer av
MIR-129-5p
kunne redusere proliferativ potensialet i Hela celler som rapportert i blæren kreftceller. En MTT-baserte analysen ble utført for å vurdere spredning av Hela celler i opptil 72 timer etter transfeksjon med
MIR-129-5p
. Analysen spredning avdekket at
MIR-129-5p
over-uttrykk hemmet cellevekst (Fig. 5), mens celler transfektert med kontroll miRNA fortsatte å vokse i løpet av denne perioden.
Cell veksten var målt ved en MTT analyse. Forsøket ble gjentatt minst to ganger, hver med tre replikater, og dataene er uttrykt som gjennomsnitt absorbanser med SD. *
P
0,001; #
P
. 0,05
Eksogene
MIR-129-5p
fremmer apoptose og blokkerer cellesyklusprogresjon i Hela celler
Som bestemmes av Annexin V merking, ubehandlede celler og de som ble behandlet med
pre-MIR-negative
kontroller forble levedyktig og var hovedsakelig Annexin V og propidiumjodid (PI) negativ. En høyrerettet endring i fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) profil, en indikasjon på apoptose, ble observert for HeLa-celler transfektert med
pre-MIR-129-5p plakater (fig. 6).
Annexin V analyse viste at HeLa celler transfektert med
pre-MIR-129-5p
vist en betydelig større apoptose nivå enn kontrollgruppene. *
P
0,01, #
P
. 0,05
Cell syklus analyse av flowcytometri vist at andelen celler i G0 /G1 og S faser i de negative kontrollene var uendret sammenlignet med ubehandlede celler. Transfeksjon av HeLa-celler med
pre-MIR-129-5p
resulterte i en akkumulering av celler i G0 /G1 fase og en reduksjon av celler i S-fasen, sammenlignet med kontrollceller. Flowcytometrisk analyse antydet at
MIR-129-5p
kunne arrestere Hela celler i G1 /S sjekkpunkt og forsinke cellesyklus fra å komme inn i S-fasen. Derfor
MIR-129-5p
over-uttrykk bremset ned cellecyklusprogresjonen og forårsaket en cellesyklus G1 fase blokk, men forskjellen var ikke statistisk signifikant.
SP1
er et direkte mål for
MIR-129-5p
i Hela celler
en dual-luciferase reporter analysen ble benyttet for å bestemme hvorvidt
MIR-129-5p
kunne bindes til
MIR-129-5p
målse i
SP1
3′-UTR. Vi brukte konstruksjoner som inneholder spådd frø sekvens for å teste den hemmende effekten av
MIR-129-5p
. Transfeksjon av
pre-MIR-129-5p
i HeLa-celler i 48 timer ble redusert luciferase-aktivitet sammenlignet med negativ kontroll. Mens ble observert noen endring i aktivitet når transfektert med kontrollen (Fig. 7B), Western blot analyse bekreftet at eksogene
MIR-129-5p
kunne redusere protein nivåer av SP1 (Fig. 7C).
(A) Vector restriksjonskart. (B) SP1 ble rettet av MIR-129-5p via sin 3’UTR i Hela celler som vurderes å bruke en luciferase assay. (C) Western blot analyser av p21, SP1 og GAPDH i Hela celler etter MIR-129-5p over-uttrykk. Midler (barer) og SD (feilfelt) vises * P .. 0.05
Diskusjoner
I denne rapporten har vi identifisert IFN-p indusert mirnas i HPV-18 positive Hela celler. miRNA microarray analyse viste uttrykk for
MIR-129-5p
,
MIR-637
,
MIR-744 Hotell og
MIR-943
ble økt , mens
MIR-526 product: * ble nedregulert etter IFN-β stimulering.
MIR-129-5p
ble plukket ut for videre studier, som bioinformatiske analyse viste at
MIR-129-5p
og HPV-18 virale gensekvenser er fullt komplementære. Det er blitt vist at MIR-129-5p ble deregulert i flere tumortyper inkludert livmorkreft, spiserørskreft, tykktarmskreft og kreft i blære, og dens verifiserte målgener inkludert SOX4 [15] – [17], VCP /p97 [18] og CDK6 [19]. Over-ekspresjon av MIR-129-5p kan hemme cellevekst og induserer celledød i blærekreft, [17] og hepatocellulær kreft [18], er imidlertid ikke klart dens rolle i livmorhalskreft.
Vi fant at MIR-129-5p over-ekspresjon kunne hemme veksten av HeLa-celler til omtrent 70,23% av kontrollceller. I mellomtiden, den transfekterte pre-MIR-129-5p økte arrest av HeLa-celler ved G0-G1 fase (68,34%), mens S-faseceller ble redusert, noe som indikerer at celleproliferasjon ble inhibert som DNA-syntese avtatt. Disse resultatene av effekten av MIR-129-5p på celleproliferasjon og cellesyklusen sammen med sin evne til å øke apoptose var i tråd med observasjoner i blæren kreftceller [17]. Vår studie viste også at MIR-129-5p-ekspresjon ble indusert av IFN-β i en dose- og tidsavhengig måte. Disse resultatene antyder at anti-spredning og pro-apoptose effekten av IFN i livmorhalskreft kan delvis skyldes induksjon av MIR-129-5p uttrykk.
Livmorhalskreft skyldes HPV-infeksjon er i hovedsak knyttet til E6 og E7 virale onkogener. Ved qPCR analyse ble transfeksjon av pre-MIR-129-5p i Hela celler funnet nedgang uttrykk for E6 og E7 med 69,01% og 77,15%, henholdsvis. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som en IFN-β indusert mikroRNA kan nedregulerer HPV-18 E6 og E7 viral genekspresjon. Vår videre undersøkelser fant at transkripsjonsfaktor SP1 er en direkte nedstrøms mål av MIR-129-5p. SP1 er et sekvensspesifikt DNA-bindende protein som inneholder en MIR-129-5p bindingssete i dets 3′-UTR. Oppstrøms regulatoriske regioner av HPV-18-gener som inneholder det SP1 bindingssetet, og de har vist seg å bestemme E6 og E7 gen-ekspresjon [20] – [22]. I denne studien fant vi at SP1 uttrykk kan bli nedregulert betraktelig ved over-uttrykt MIR-129-5p. Videre har vi bekreftet eksistensen av et bindingssete for MIR-129-5p ved SP1 3′-UTR av luciferase aktivitetsanalyse. Til sammen våre resultater tyder på at den induserte uttrykk for MIR-129-5p av IFN-β undertrykke utviklingen av livmorhalskreft ved å nedregulere HPV-18 E6 og E7 uttrykk, og SP1 er en direkte nedstrøms mål av MIR-129- 5p. Et interessant resultat avslørt av vår undersøkelse er at MIR-129-5p uttrykk var høy i CIN I svulster, men det gradvis redusert i løpet av kreftutvikling og fremveksten av patologisk karakter. HPV-infeksjon kan forårsake endring av mobilnettet miRNA uttrykk under utviklingen av livmorhalskreft. Nedregulering av menneskelig MIR-218 og MIR-34a i livmorhalskreftceller ble adressert til HPV 16 E6 onkogen. En fersk studie viste at 25 mirnas ble ulikt regulert i to eller tre HPV-typer (HPV 11/16/45) [23]. Det er rimelig at MIR-129-5p uttrykk kan undertrykkes av HPV-infeksjon, som infeksjonen frekvensen av høyrisiko HPV økt gjennom CIN jeg til livmorhalskreft. Likevel er videre studier er nødvendig for å fastslå den eksakte mekanismen for redusert MIR-129-5p uttrykk under utviklingen av livmorhalskreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
varmekart for de forskjellig uttrykt mirnas mellom ubehandlede og IFN-p induserte Hela celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0081366.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
A ekspresjon av HPV-18 E6 i HeLa-celler; S2B Uttrykket av HPV-18 E7 i HeLa celler
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0081366.s002 plakater (TIF)
bekreftelser
En spesiell takk til Youji Feng og Feng Wang fra Shanghai First Folkets sykehus Affiliated til Shanghai Jiao Tong University for å gi teknologisk veiledning underveis i løpet av denne studien.
