Abstract
Kreftceller reagerer på stress ved å aktivere en rekke overlevelsessignalveier. En disintegrinproteinet og metalloproteinase (ADAM) 9 er oppregulert i løpet av kreft progresjon og hormonbehandling, fungerer blant annet gjennom en økning i reaktive oksygenforbindelser. Her presenterer vi
in vitro Hotell og
in vivo
bevis på at terapeutisk målretting av ADAM9 genuttrykk av lentivirus levert liten hårnål RNA (shRNA) betydelig hemmet spredning av menneskelig prostata kreft cellelinjer og blokkert tumorvekst i en murin modell for prostatacancer benmetastase. Cellecyklus studier fastslo en økning i G1-fase og reduksjon i S-fasen populasjon av kreftceller i henhold til sult stressbetingelser, noe som korrelerte med forhøyede intracellulære superoksyd nivåer. Microarray data viste signifikant reduserte nivåer av regenererende holme-avledet familiemedlem 4 (REG4) uttrykk i prostata kreft celler med knockdown av ADAM9 genuttrykk. Dette REG4 downregulation også resulterte i induksjon av uttrykket av p21
Cip1 /WAF1, noe som negativt regulerer cyclin D1 og blokkerer G1 /S overgang. Våre data indikerer en roman molekylære mekanismen av ADAM9 i reguleringen av prostatakreft celleproliferasjon, og foreslår en samlet modalitet av ADAM9 shRNA genterapi og cytotoksiske midler for hormon ildfaste og beinmetastatisk prostatakreft
Citation. Liu CM , Hsieh CL, han YC, Lo SJ, Liang JA, Hsieh TF, et al. (2013) In Vivo målretting av ADAM9 Gene Expression Bruke Lentivirus-Leveres shRNA undertrykker prostatakreft vekst ved å regulere REG4 Dependent cellecyklusprogresjonen. PLoS ONE 8 (1): e53795. doi: 10,1371 /journal.pone.0053795
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 06.09.2012; Godkjent: 03.12.2012; Publisert: 16 januar 2013
Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av NSC99-2320-B-039-029-My3 av National Science Council, Taiwan (https://web1.nsc.gov.tw); NHRI-EX99-9902BI, NHRI-EX100-9902BI og NHRI-EX101-9902BI av National Health Research Institute, Taiwan (https://www.nhri.org.tw). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekommer i mer enn 80% av avansert stadium prostata kreft tilfeller, skjelettmetastaser korrelerer med en høy grad av sykelighet; en fem års overlevelse på 25% og median overlevelse på ca 40 måneder [1]. Skjelettmetastaser, på grunn av utviklingen av skjelettsmerter, kreft-assosiert benbrudd og spinal kompresjon, samt hjerne nevropati, anemi og infeksjon, kan betydelig redusere kvaliteten på livet til pasienter med prostatakreft [2], [3]. Foreløpig er androgen deprivasjon den første linjen av behandling for metastatisk prostatakreft; vil imidlertid prostatakreft ofte utvikle seg til en androgen-uavhengig ben-metastatisk stadium. Når dette progresjon skjer, kjemoterapi og strålebehandling er de viktigste terapeutiske alternativer, som begge fører til ubehagelige bivirkninger, og bare gir en begrenset nytte til mengden og kvaliteten på livet [4]. Derfor er det viktig å arbeide for nye terapeutiske faktorer som kan ha potensial til å forbedre overlevelsen av pasienter med hormon ildfast og beinmetastatisk prostatakreft.
Til tross for nylige fremskritt i terapeutiske strategier, mange ondartet kreft fortsatt utvikle resistens mot stråling og målrettet terapi [5], [6]. Motstand oppstår som et resultat av den stressrespons, slik at ondartede celler for å overvinne den cytotoksiske effekten av mange behandlinger [7]. En disintegrinproteinet og metalloproteinase (ADAM) 9 er et viktig medlem av en disintegrinproteinet og metalloproteinase-genfamilien. Proteinene kodet av denne familien megle cellulære responser på miljøstress ved å samhandle med en rekke celleoverflateproteiner og regulere ulike cellulære prosesser som proliferasjon, ekstracellulære matrise bindende, og ectodomain Shedding [8] – [12]. Tidligere arbeid utført av vår gruppe [13] og andre [14] har vist i kliniske studier at høyere ADAM9 nivåer korrelerer med en kortere periode med prostatakreft remisjon. Vi demonstrerte også en signifikant korrelasjon mellom tumor ADAM9 farging og risikoen for prostatakreft tilbakefall og død hos pasienter som gjennomgikk hormonbehandling, noe som tyder på at en progressiv økning i ADAM9 ekspresjon kan brukes som en biomarkør for dårlig prognose i prostata kreftpasienter etter hormonbehandling [15]. Videre knockdown av ADAM9 uttrykk fører til økt Radiosensitivity og kjemosensitivitet til terapeutiske midler [16], noe som indikerer at ADAM9 overekspresjon av kreftceller kan være potensial flukt mekanisme for å overvinne stress indusert kreft celledød; Men lite er kjent om nedstrøms regulerings mekanismer som ADAM9 fremmer kreft celle overlevelse som svar på stress. Siden forhøyede ADAM9 uttrykk er observert i mange avanserte svulster, øker dette muligheten for at ADAM9 kan være en potensiell biomarkør for kreft målrettet genterapi, men mer forskning er nødvendig.
I denne studien, vurderer vi muligheten for lentiviral vektor-leverte liten hårnål RNA (shRNA) mot ADAM9 for behandling av androgen-uavhengig og beinmetastatisk human prostatakreft i en eksperimentell dyremodell. Den molekylære mekanismen bak den terapeutiske virkningen av ADAM9 målrettet genterapi ble også belyst.
Materialer og metoder
Material
Retrovirale vektorer som inneholder shRNA som er rettet mot ADAM9 og kontroll shRNA ble oppnådd fra Open Biosystems (Lafayette, CO). Lentiviral vektor ADAM9 shRNA og kontroller ble hentet fra National RNAi Kjerne Facility ved Institutt for molekylær biologi /Genomisk Research Center, Academia Sinica, Taiwan. De anti-ADAM9 antistoffer ble erholdt fra R Hospital) i henhold til produsentens instruksjoner. BT474 cellelysat (celler ble behandlet med 500 nM doxorubicin over natten) ble oppnådd fra Dr. Wei-Chien Huang ved Kina Universitetssykehus Sykehus. For lasting kontroll, ble blottene probet med et anti-EF1-α monoklonalt antistoff (1:10,000; Millipore). Etter inkubasjon med et HRP-konjugert sekundært antistoff (1:5000, GE Healthcare Life Science), ble kjemiluminescerende signaler påvises ved hjelp av ECL Plus kit og blotter ble utsatt for Hyper ECL (GE Healthcare Life Science). Protein bandet kvantifisering ble utført ved hjelp av ImageJ programvare (https://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, USA).
Måling av reaktive oksygen arter
Celler ble sådd på retter på 70-80% samløpet og sultet over natten. For kvantifisering analysen ble cellene trypsinert, sentrifugert og resuspendert i HBSS med eller uten 5% FBS (avhengig av om de var utsatt for stråling eller sult). Hydrogenperoksyd ble påvist ved anvendelse av dichlorofluorescindiacetate (DCF, 2 uM) (Invitrogen). Superoxide ble oppdaget ved hjelp dihydroethidium (DHE, 10 mm) (Invitrogen). Superoxide avbildning ble oppdaget ved hjelp MitoSox Red mitokondrie superoxide indikator (Invitrogen). Prøvene ble inkubert i 40 minutter ved romtemperatur i mørke på en rotator. Analyse av DCF og DHE fluorescens ble utført ved hjelp av en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, California) i henhold til produsentens instruksjoner. For bildebehandling mitokondrie superoxide generasjon ble cellene sultet i 24 timer etterfulgt av lasting med MitoSOX Rød, Alexa-488 WGA og DAPI (Invitrogen) i 30 min og ser under et fluorescens mikroskop.
Cell Proliferation Assay
effekten av ADAM9 shRNA på celleformering ble målt ved direkte telling av antall celler. I korthet ble cellene sådd ut i en tetthet på 1 x 10
5 på 60 mm skål. Ved angitte tidspunkter ble cellene fjernet ved trypsinering, og antallet levedyktige celler ble tellet i et hemocytometer ved bruk av trypan blått (0,4%) farging.
klonogene Assay
For klonogene assay celleproliferasjon, cellesuspensjoner ble fremstilt ved behandling med 0,25% trypsin og 0,05% EDTA. Etter beregning av cellekonsentrasjon ved hjelp av et hemocytometer, ble 100 celler sådd ut i 6-brønns plater med T-medium og 5% FBS i 2 uker. Antallet kolonier i hver brønn ble bestemt ved telling av antallet celler i hver koloni. Bare kolonier med ≥50 celler ble definert som vellykket. For å identifisere kolonier, ble mediet trukket tilbake, og 3.7% formaldehyd ble tilsatt i 15 minutter, etterfulgt av inkubasjon i 1 ml av krystallfiolett i 15 minutter ved romtemperatur. Colony bildene ble tatt og celle tall beregnet ved hjelp ImgaeJ.
Transwell Invasion analysen
invasivitet av kreftceller ble vurdert ved hjelp av 24-brønners Transwell (Corning, Lowell, MA) plater. I korte trekk, 2 x 10
5-celler i media inneholdende 0,5% FBS ble tilsatt til det øvre kammer inneholdende 8 um porestørrelse polykarbonat belagt med 1 mg /mL matrigel; det nedre kammer ble fylt med media inneholdende 5% FBS. Etter 16 timers inkubering ble den øvre overflaten av membranen skrubbet med en bomullspinne. Invaderende celler på den nedre overflate av membranen ble fiksert og farget med 0,5% krystallfiolett. Tilfeldige felt (5 per membran) ble fotografert ved 40x forstørrelse for beregning celle nummer. I tillegg ble cellene kvantifisert ved å måle absorbansen av fargestoffekstrakter ved 570 nm i 100 ul Sorenson løsning (9 mg tirsodium citrat, 305 ml destillert vann, 195 ml 0,1 N HCl, 500 ml 90% etanol).
Wound Healing Assay
Celler resuspendert i kulturmedium ble sådd på 24-brønners plater. En enkelt sår ble laget i midten av cellemonolaget ved forsiktig fjerning av de festede celler med en steril plast pipettespiss etter cellekulturer nådd ≥90% konfluens. Rusk ble fjernet ved vasking med serumfritt medium. Celler som migrerte inn i den sårede område eller de stikker ut fra kanten av såret ble visualisert og fotografert under et Zeiss Axioplan mikroskop (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) med en 10 x objektiv ved fem forutbestemte tidspunkter (0, 2, 4 , 6 og 8 timer). Hvert eksperiment ble uavhengig utført minst tre ganger.
immunhistokjemisk farging
Fem-mikron tykke parafininnstøpte vevssnitt ble deparaffinized og vannes ut. Vevssnittene ble inkubert i 2 timer med muse-monoklonalt anti-humant ADAM9 antistoff (1:50 fortynning, R Seksjonene ble deretter motfarget med hematoksylin automatisering (DAKO) i 15 minutter. Spesifisiteten til merking av denne fremgangsmåten ble verifisert ved negative kontrollreaksjoner ved hjelp av buffer for å erstatte det primære antistoff og isotype-spesifikke IgG. Masson er Trichrome farging ble utført ved hjelp av en Masson er Trichrome flekken kit (Sigma-Aldrich) etter standard protokoll levert av produsenten.
tartrate bestandig Acid fosfatase (TRAcP) Farging av Bone
farging med TRAcP ble utført i henhold til produsentens protokoll (Takara Bio Inc, Shiga, Japan). Kort fortalt ble parafininnstøpte mus tibia bein seksjoner deparaffinized og rehydrert for Trac Posteolytic reaksjon. Bein seksjoner ble inkubert med det substrat-oppløsning (0,1 volum av natriumtartrat i Naphthol-AS-BI-fosfat /Fast Red Violet LB substratløsning, pH 5,2) ved 37 ° C i 45 minutter. Etter vask av lysbildet med destillert vann og tilsette glyserol for å unngå dehydrering, ble prøvene undersøkt i mikroskop.
Fastsettelse av Cellular DNA innhold av FACS Analyse
Kreftceller ble sådd på 1 x 10
6 celler per 100 mm skål og sultet for enten 24 eller 48 timer. Celler ble tryspinized og underkastet cellesyklusanalyse ved anvendelse av propidiumjodid som rapportert tidligere [18]. Den relative DNA innhold av kjernene ble målt ved FACSCalibur (BD Biovitenskap).
In vivo
xenograft modeller,
Fem uker gammel mannlig atymiske nakne (nu /nu ) mus hentet fra National Laboratory Animal Center på Taiwan ble brukt for subkutan (sc), intrakardiell, og intratibial svulst implantasjon. Celler ble dyrket til 100% konfluens, trypsinert og nummerert. Musene ble bedøvet med 1,7% isofluran blandet med luft for subkutan svulst implantasjon. Xenografttumorer ble etablert av subkutant injeksjon av 10
6 PC3-celler som uttrykker pSM2c eller shADAM9 celler i 100 ul PBS til hver side av hver mus. Dyrene ble avlivet etter 8 uker. Det var ingen signifikante forskjeller i kroppsvekt mellom dyrene med og uten s.c. svulster på tidspunktet for offer. For intratibial tumor-injeksjon, ble en 27-gauge nål brukes til å bore et hull i marghulen gjennom tibial platå til både venstre og høyre skinnebein. En 28-gauge Hamilton sprøyte ble benyttet for å injisere 5 x 10
5-celler i et 50 ul volum inn i margen hulrom. Tumorvekst ble overvåket av både Bioluminescens og røntgen en gang per uke. Dyrene ble avlivet etter 8 uker. Tibias ble fjernet, vasket i PBS og fiksert i 10% formaldehyd ved romtemperatur i 24 timer. Bone prøver ble vasket med PBS etterfulgt av avkalkes med 0,25 M EDTA i PBS (pH 7,4) ved romtemperatur i 6 uker. EDTA avkalking løsninger ble endret ukentlig. Tumorvekst ble overvåket ukentlig bruker en bioluminesens bildesystem (Xenogen IVIS 200-serien, Sylinder, Hopkinton, MA).
RNA Utvinning og DNA microarray analyse
Total RNA ble isolert fra dyrkede celler (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) etter produsentens protokoll. Purified RNA prøver ble sendt til Phalanx Biotech for microarray analyse ved hjelp av Human Whole Genome OneArray® Microarray v5 (Phalanx Biotech Group, Inc., Hsinchu, Taiwan). Hver microarray inneholder 29,187 menneskelige genom prober og 1088 eksperimentelle kontroll sonder. Detaljert beskrivelse av microarray prosedyrer og hele genomet gen probe lister er tilgjengelige fra https://www.phalanxbiotech.com/tech_support/general.php.
Overuttrykte REG4
Den fulle lengde REG4 kodende regionen ble forsterket av PCR hjelp av primere oppført i materialer og metoder S1, og subklonet inn p3XFLAG-CMV-7,1 (Stratagene, Santa Clara, California) eller pcDNA3.1 (Invitrogen) vektorer. De REG4 konstruksjonene ble transient transfektert inn PC3
shADAM9 hjelp lipofektamin 2000 (Invitrogen) etter standard protokoll. Uttrykt REG4 ble bekreftet ved immunblotting (R Nedre bilde: mus med en destruktiv skjelettlesjon i venstre ben og ingen lesjon i høyre ben. (D) Histologisk avbildning viser at både trabekulært og kortikalt ben ble erstattet av PC3
shGFP svulst. I motsetning til dette, trabekulært og kortikalt ben var fremdeles intakt i PC3
shADAM9 tumor (H E). Masson er Trichrome farging indikert bare spor av bein igjen i PC3
shGFP forhold til PC3
shADAM9 svulster (Trichrome). (E) TRAcP analyse av osteoclast-aktivitet. Pil viser osteoklaster observert i en PC3
shGFP svulst. Red høydepunkt indikerer loci på 40 × forstørre.
ADAM9 genet Slå Redusert in vivo osteolytiske lesjoner forårsaket av PC3 Svulster i Mus
Siden er PC3 celler kjent for å indusere osteolytiske lesjoner
in vivo
, bestemt vi enten knockdown av ADAM9 uttrykket kan dempe tumorindusert benresorpsjon. Datastyrt radiografisk skanning av de berørte bena avdekket alvorlige osteolytic beinskader i venstre tibia (injisert med PC3
shGFP), mens massen dukket normal i riktig tibia (injisert med PC3
shADAM9) (Fig. 2c). Masson s Trichrome farging av venstre ben bekreftet at både trabekulært og kortikale ben i den proksimale tibiale metafyse var blitt ødelagt, og margen hulrommet hadde blitt erstattet av tumorer. I motsetning til dette trabekulære og kortikale ben forble intakt i PC3
shADAM9-injiserte høyre tibia og, med unntak av en hendelse som svake signaler Bioluminescens hadde forholdsvis små svulster i marg plass med mild bendestruksjon (fig. 2d). I tillegg er antallet og graden av modne osteoklaster i ben-tumor grensesnitt av PC3
shGFP-injiserte tibias var mye høyere enn de av PC3
shADAM9-injiserte tibias, som bestemt ved tartrat-resistent sur fosfatase (TRAcP) flekker (
p
0,01). (fig. 2e), noe som indikerer at stanse uttrykk for ADAM9 redusert evne til prostata kreft celler til å indusere osteoclastogenesis i beinet
Målretting ADAM9 Expression etter intratumoral Levering av shRNA undertrykker prostatakreft Vekst i mus
for å undersøke om shRNA-mediert hemming av ADAM9 uttrykk representerer en lovende strategi for prostatakreft genterapi, PC3 cellene ble subkutant inokulert i begge flankene av nakne mus. Tumorene fikk vokse til en størrelse på omtrent 200 mm
3. Ti av femten mus som hadde PC3 svulster på begge flankene ble valgt ut til å motta den intra-tumor injeksjon av 1 x 10
5 cfu lentiviral vektorer (LV) bærer shGFP (venstre side flanke) eller shADAM9 (høyre side flanke) ukentlig for totalt 6 uker (fig. 3a), og de resterende 5 mus tjente som kontroller ved å motta PBS-injeksjoner. Redusert prostata tumorvekst ble observert i tumorer behandlet med LV-shADAM9 sammenlignet med de som ble behandlet med LV-shGFP eller PBS (fig. 3b). Den gjennomsnittlige tumorstørrelse etter 6 ukers behandling med PBS eller LV-shGFP var 782.7 ± 174,6 mm
3 og 1027 ± 272,2 mm
3, henholdsvis. I motsetning størrelsen på svulster behandlet med LV-shADAM9 terapi var 135,9 ± 72,4 mm
3. Nivået av ADAM9 ekspresjon ble redusert i tumorer behandlet med LV-shADAM9 terapi, noe som bekreftes av både vev-farging (fig S4D-f.) Og immunoblotting (Fig 3c;.
p
≤0.05).
(a) Skjematisk av ADAM9 knockdown terapi eksperiment. Mus ble injisert subkutant med PC3-celler i begge flanker, og tumorstørrelse ble målt to ganger i uken til størrelsen nådde ca. 200 mm
3. Mus fikk deretter injeksjoner av enten PBS i begge kreftsider (n = 5) eller shGFP lentivirus inn i venstre side svulsten og shADAM9 inn i høyre side (n = 10). Virus ble injisert og tumorer målt ukentlig i 6 sammenhengende uker. (B) Etter shADAM9 terapi, tumorvolumer ikke øke i forhold til shGFP terapi eller PBS kontroller (**
p
≤0.01, Student
t
test). (C) Immunoblotting analyse av ADAM9 uttrykk bekrefter redusert ADAM9 uttrykk etter shADAM9 terapi. EF-1α ble brukt som en lastekontroll (*
p
≤0.05; **
p
≤0.01, Student
t
test). (D) Statistisk analyse av Ki67 farging. shADAM9 terapi betydelig redusert celleproliferasjonsprosesser aktiviteter i PC3 svulster. PBS og shGFP terapi viste ingen forskjell i indeksen spredning (**
p
≤0.001, One Way ANOVA). (E) Statistisk analyse av TUNEL farging viste ingen signifikant (NS) forskjell mellom behandlingene (
p
≥0.05, One Way ANOVA).
For å bestemme cellulære responser assosiert med LV -shADAM9 terapi, tumor proliferasjon (Ki-67 indeks, fig. S4g-i) og apoptose markør farging (TUNEL indeks, fig. S4j-l) av tumorsnitt ble gjennomført. Vi fant ikke signifikant forskjell mellom antall apoptotiske celler i kontroller og LV-shADAM9 (Fig. 3e og Fig. S4j-l). I motsetning til dette, ved behandling med LV-shADAM9 resulterte i en dramatisk reduksjon i antallet Ki-67-positive celler i forhold til både PBS og LV-shGFP behandling (fig. 3d og fig. S4g-i). Disse dataene viste at
in vivo
levering av LV-shADAM9 regresses effektivt tumorvekst ved hemming av celleproliferasjon i stedet for induksjon av apoptotisk celledød.
Pusse ADAM9 induserer cellesyklus arrest i G1 /S Transition under stress betingelser
for ytterligere å avgrense mekanisme LV-shADAM9 terapi-indusert tumorvekstinhibitering, cellesyklus fordelingen mellom ADAM9-dyktig PC3
shGFP og ADAM9-mangel PC3
shADAM9 celler dyrket med serum-sult eller serum-supplert (5% FBS) forhold ble analysert. Mens PC3
shGFP og PC3
shADAM9, under normale forhold, viste ingen endring i cellesyklus profiler, ble S-fasen befolkningen betydelig redusert over tid (24-48 timer) i serum-sultet PC3
shADAM9 celler sammenlignet med det i PC3
shGFP. Denne reduksjonen var ledsaget av økte prosentandelen av celler i den fase G1 (fig. 4a). Et lignende resultat ble oppnådd ved hjelp av LNCaP-celler (Fig. 4B). Videre studier av immunblot G1 /S overgangsrelaterte proteiner avslørte et betydelig høyere nivå av p21
Cip1 /WAF1. Videre ble et lavere nivå av cyclin D1 indusert i PC3
shADAM9 enn i PC3
shGFP henhold serum sulte betingelser (Fig. 4c). Selv om serum sult ikke forårsake noen ytterligere endringer i uttrykket nivået av p27
Kip1 i enten PC3
shADAM9 eller PC3
shGFP, basalnivået p27
Kip1 var høyere i PC3
shADAM9 . Samlet utgjør disse resultatene tyder på at eksponering av PC3
shADAM9 til serum sult utløser en G1 cellesyklus arrest. Økt uttrykk av p21
Cip1 /WAF1and p27
Kip1 ble også påvist i LNCaP
shADAM9 under normale kultur forhold (Fig. 4d).
Sult reduserte S-fase cellepopulasjonen i ADAM9 knockdown kreftceller i forhold til den av kontrollene i PC3 (a), LNCaP (b). (C) Expression nivåer av p21
Cip1 /WAF1, p27
Kip1, og cyclin D1 økt i shADAM9 cellene etter sult stress forhold i PC3 cellene. (D) Expression nivåer av p21
Cip1 /WAF1 og p27
Kip1 økt i LNCaP
shADAM9 under begge normale og sult forhold.
På grunn av vår tidligere funn at ADAM9 er en stress-responsive protein som kan støtte prostata kreft celle overlevelse og progresjon i henhold intense oksidative stress forhold [13], [19], vi søkt å finne ut om serum sult, en
in vitro
tilstand som etterligner den fiendtlige svulst mikromiljøet [16], [19], kan indusere intracellulær oksidativt stress hvori ADAM9-manglende celler som mislyktes i å overvinne. Vi har oppdaget at en økning i endogene superoksyd nivåer i både PC3
shGFP og PC3
shADAM9 celler etter 24 timer med serum sult sammenlignet med celler dyrket under serum supplert forhold målt ved levende celle avbildning med en MitoSox rød fluorescerende probe ( fig. 5a), så vel som strømningscytometri med det fluorescerende fargestoff, dihydroethidium (DHE) (fig. 5b). Spesielt, PC3
shADAM9 viste signifikant høyere superoksid innhold enn PC3
shGFP, enten på basalnivå eller indusert av serum sult. Derimot ble ingen endringer i nivået av intracellulære hydrogen peroxide finnes i enten PC3
shGFP eller PC3
shADAM9 celler, som analysert ved flowcytometri med DCFH-DA prober (Fig. 5c). Disse data viser at serum sult-induserte oksidativt stress i prostatakreftceller er mediert, i det minste delvis, gjennom superoksyd men ikke hydrogenperoksyd, et resultat som ligner på vår tidligere observasjon med ioniserende strålingsinduserte reaktive oksygenarter (ROS) generasjon [16 ].
(a) PC3
shGFP og PC3
shADAM9-celler ble dyrket i enten 5% FBS eller under serum sult i 24 timer, etterfulgt av behandling med 0,5 uM MitoSOX fluorescens. Lik intensiteten av fluorescens ble brukt i hvert bildefangst for kvantifisering av superoksyddannende nivåer.
