Abstract
Berberine (BBR), en isokinolin derivat alkaloid isolert fra kinesiske urter, har en lang historie av bruksområder for behandling av flere sykdommer, inkludert kreft. Men de nøyaktige mekanismer for virkningene av BBR i humane lungekreftceller uklare. I denne studien undersøkte vi de molekylære mekanismer som BBR hemmer celleveksten i human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler. Behandling med BBR fremmet cellemorfologi forandring, hemmet cellemigrering, proliferasjon og kolonidannelsen, og indusert celle-apoptose. Videre molekylære mekanismen studie viste at BBR samtidig målrettet flere celle signalveier å hemme NSCLC cellevekst. Behandling med BBR hemmet AP-2α og AP-2β uttrykk og opphevet sitt bindende hTERT arrangører, og dermed begrenser hTERT uttrykk. Knockdown av AP-2α og AP-2β av siRNA betraktelig utvidet BBR-mediert inhibisjon av cellevekst. BBR også undertrykkes den nukleære translokasjonen av p50 /p65 NF-kB-proteiner og deres binding til COX-2-promotoren, forårsaker hemning av COX-2. BBR også downregulated HIF-1α og VEGF uttrykk og hemmet Akt og ERK-fosforylering. Knockdown av HIF-1α ved siRNA betraktelig utvidet BBR-mediert inhibisjon av cellevekst. Videre BBR behandling utløst cytokrom-c utgivelse fra mitokondrie inter-membran plass i cytosol, fremmet kløyving av caspase og PARP, og berørte uttrykk for BAX og BCL-2, og dermed aktivere apoptotisk veien. Samlet utgjør disse resultatene viste at BBR hemmet NSCLC cellevekst ved samtidig å målrette AP-2 /hTERT, NF-kB /COX-2, HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT, Raf /MEK /ERK og cytokrom-c /caspase signalveier. Våre funn gir ny innsikt i å forstå kreft mekanismer for BBR i human lungekreft terapi
Citation. Fu L, Chen W, Guo W, Wang J, Tian Y, Shi D, et al. (2013) Berberine Targets AP-2 /hTERT, NF-kB /COX-2, HIF-1α /VEGF og Cytokrom-c /Caspase Signa å undertrykke menneskelige kreft celle vekst. PLoS ONE 8 (7): e69240. doi: 10,1371 /journal.pone.0069240
Redaktør: Furuta Xiao, University of Pittsburgh Cancer Institute, USA
mottatt: 26 april 2013; Godkjent: 06.06.2013; Publisert: 15.07.2013
Copyright: © 2013 Fu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Natural Science Foundation National of China (81071687, 81272195), Statens «863 Program» of China (SS2012AA020403), Stiftelsen doktorgradsprogrammene for Ministry of Education of China (20110171110077), og staten Key Laboratory of Oncology i Sør-Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklært tilhørighet (e) til «Guangzhou Double Bioproduct Inc» i konkurrerende interesser delen av online manuskript. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft rangerer først blant kreftrelaterte dødsfall i verden [1]. Forekomsten av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), en hovedform for lungekreft, har vært økende med betydelig dødelighet og sykelighet. Behandling som kjemoterapi og strålebehandling er de viktigste terapistrategier for lungekreft [2]. I de senere årene, terapier selektivt målet cellesignalveier, for eksempel EGFR, VEGF, KRAS, BRAF, ALK, HER2, MET, TITF-1, p53, LKB1 og mange andre, ikke bare gitt en bedre forståelse av NSCLC kreftutvikling, men også brukt som prognostiske faktorer eller mål for individualisering terapi [3]. Imidlertid gjenstår det å overleve dårlig. Fremskritt i cancer biologi og genetikk lunge ført til utvikling av små-molekyl fytokjemikalier, spesielt fytokjemikalier ekstrahert fra kinesiske urter som har effekter på kreftcelleformering, angiogenese og apoptose [4]. Således kan optimalisering av bruken av konvensjonelle og nye terapeutiske fytokjemikalier forbedre resultatet av behandling av lungekreft.
kinesiske urter har vært brukt i stor grad og med hell i århundrer i behandling av ulike typer sykdommer [5]. Fytokjemikalier fra kinesiske urter har vist lovende for forebygging av kreft med sikkerhet og effekt [6]. Berberine (BBR) er en isokinolin derivat alkaloid isolert fra rhizome, røtter og stammer bark av en rekke kinesiske urter,
Berberis
arter, for eksempel
Hydrastis
canadensis
(goldenseal),
Cortex phellodendri plakater (Huangbai) og
rhizoma coptidis plakater (Huanglian) [7]. Berberin har en lang historie som brukes som et terapeutisk middel for å behandle en rekke sykdommer, inkludert kreft. Det har blitt rapportert at BBR ved oppviser flere farmakologiske virkninger, inklusive anti-inflammatorisk [8], anti-hypertensive [9], kolesterol-senkende [10], anti-diaré [11,12], anti-mikrobielle [13,14 ] aktiviteter, og anti-tumor effekt av BBR var mer og mer vektlagt i de siste tiårene [15,16]. BBR har vist seg å oppvise anti-spredning virkning mot kreftceller av forskjellig opprinnelse, inkludert glioblastom [17], melanom [18], tykktarmskreft [19], brystkreft [20,21], prostatakreft [22] og så videre . I human lungekreft, har det vist seg at BBR forbedret CYTO-toksisiteten av stråling i begge
in vivo
og
in vitro-modeller
via induksjon av autophagy [23], og BBR oppviste en beskyttende effekt på strålings-indusert lungeskade gjennom intercellulær adhesjon molekylær-1 og transformerende vekstfaktor-beta-1 [24]. BBR også effektivt hemmet motilitet og invasjon evne til lungekreft cellelinjen A549 i en dose- og tidsavhengig måte under ikke-cytotoksiske konsentrasjoner via redusert produksjoner av urokinase-plasminogen-aktivator og matriksmetalloproteinase-2 [25]. Videre BBR ble rapportert å hemme vekst og induserer apoptose i humane lungekreftceller, og administrering av BBR ved oral gavage hemmet veksten av tumor-xenografter i atymiske nakne mus [26]. Selv om bevis for antitumor effekt av BBR er i vekst, er fortsatt usikkerhet om mekanismene for BBR i NSCLC fortsatt.
Menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT) har vist seg å være en viktig del av menneskelig telomerase, som syntetiserer telomeric DNA, forlenger kromosom ender, og opprettholder kromosomalt stabilitet, og til slutt fører til cellulær immortalisering [27]. hTERT er ikke uttrykt i de fleste humane somatiske celler, men det er ofte overuttrykt i et bredt spekter av humane kreftformer, inkludert lungekreft [28]. Den forhøyede ekspresjon av hTERT er nødvendig for å transformere normale humane celler til kreftceller. Transkripsjonell regulering av hTERT-gen er den viktigste mekanisme for cancer-spesifikk aktivering av telomerase, og en rekke faktorer har blitt identifisert til å direkte eller indirekte regulere hTERT-promotoren [29]. Den aktiverende enhancer-bindingsprotein-2 (AP-2) har vist seg å transkripsjonelt kontrollere ekspresjonen av hTERT. AP-2 transkripsjonsfaktor familien inneholder et sett med utviklingshemmede regulerte, retinsyre induserbare gener består av fire relaterte faktorer-AP2α, AP2β, AP2γ, og AP2δ [30]. Ved binding til hTERT-promoteren, AP-2 faktorer utøver sine biologiske virkninger via aktivering av en rekke tumor-relaterte gener og signalveier, inkludert hTERT, PI3K /akt, og Raf /MEK /ERK-[31].
Vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) har blitt anerkjent som en av de viktigste initiativtakerne i utvikling og progresjon av vaskularisering systemet [32]. Pigment-epitel-avledet faktor (PEDF), en potent hemmer av angiogenese, så vel som et neuro-beskyttende faktor, motvekt effekten av VEGF [33]. VEGF og PEDF begge har flere biologiske aktiviteter og funksjoner, og de har en invers relasjon til hverandre, spesielt i kreft [34]. Uttrykket av VEGF og PEDF er regulert av en kropp av eksterne faktorer, som hypoksi er best karakteriseres megler. Hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) er en transkripsjonsfaktor som spiller en avgjørende rolle i kreftutvikling. Aktiviteten av HIF-1α oppreguleres ved en rekke ikke-hypoksiske signaler, deriblant aktivering av flere onkogene trasé som Src, HER-2, Ha-Ras, og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) signalering [35]. Ved binding til hypoksi-responsive elementer på VEGF-promoteren, HIF-1 fører til den transkripsjonelle aktivering av VEGF-genet [36].
COX-2 er et induserbart enzym som omdanner arakidonsyre til prostaglandiner, og den er ofte overuttrykt i et bredt spekter av humane cancere [37]. Den økte ekspresjon av COX-2-protein og den sequencial PGE2 produksjon har vist seg å betydelig forbedre karsinogenese og inflammatoriske reaksjoner ved oppregulering EGFR, PI3K, og ERK1 /2-signalering [38]. COX-2 ekspresjon er transkripsjonelt reguleres ved binding av flere transactivators og coactivators til de tilsvarende områder som ligger i dets promoter. Blant de kjente flere regulatoriske elementer som distribuerer i kjernen promoter regionen COX-2 transkripsjon start stedet, er NF-kB bindingssete avgjørende for COX-2 promoter aktivitet [39,40].
PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK er to klassiske cellesignalveier og spiller en sentral rolle i regulering av celle genekspresjon, vekst overlevelse. Unormal PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK signal kan føre til økt eller ukontrollert celledeling, motstand mot apoptose og til cellegift, strålebehandling, og målretting terapier i svulster. Aktiveringen av HIF-1-proteinet kan lettes ved PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK-signalering. Som oppstrøms signalmolekyler av HIF-1-protein, kan ERK også spille sin rolle som formidler effekten av BBR på hemming av vekst celler [41].
induksjon av apoptose er ansett som en av de mulige mekanismer for inhibering av kreftutvikling. Caspaseaktivering spiller en sentral rolle i gjennomføringen av apoptose. De aktiverte caspaser spalte en rekke target-proteiner, for derved å deaktivere viktige cellulære prosesser og bryte ned strukturelle komponenter i cellen. Utgivelsen av cytokrom-c fra mitokondrie inter-membran plass i cytosol er forutsetningen for caspase-avhengig apoptose veien. Cytokrom c bindes til Apaf-1 i fravær av dATP, og komplekset binder pro-kaspase-9 for å danne apoptosome, som spalter den pro-kaspase til caspase 9, og i sin tur aktiverer effektor caspase-3 [42].
i denne studien undersøkte vi de detaljerte underliggende mekanismene for BBR i hemme NSCLC cellevekst i NSCLC
in vitro
. Våre funn gir ny innsikt i å utforske de potensielle terapeutiske strategier og nye mål for human lungekreft.
Resultater
BBR endret cellemorfologi og hemmet celle migrasjon
Vi først analysert effekten av BBR på cellemorfologi i A549 og H1299 celler. Behandling med BBR ved 100 uM BBR effektivt redusert celle-til-celle-kontakt og førte til en lavere sprednings med mindre dannelse av fi lopodia ved sammenligning med DMSO kontrollgrupper (Figur 1a). Vi testet også effekten av BBR på cellemigrasjon ved å anvende en sårhelende analysen. Som vist i figur 1B, ble den delen av såret plass mellom cellelag etter at en ripe okkupert fullstendig av den migrerende celler etter 48 timer i kontrollgruppen. Men den tomme plassen av cellene ble ikke okkupert av migrerende celler behandlet med 20 mikrometer BBR. Disse resultatene viser potensialene til BBR i å endre cellemorfologi og inhibere cellemigrering i lungecancerceller
(A) forandringer i cellemorfologi og spredning i A549 og H1299-celler behandlet med 100 uM BBR for ble observert 48 timer og cellene ble fotografert ved hjelp av et mikroskop utstyrt med digitalt kamera. (B) Cellemigrering ble analysert ved en sårhelende analysen. Celler ble dyrket til fullstendig konfluens. Av cellemonolagene ble såret med en steril pipette, og ble vasket med medium for å fjerne frigjorte celler fra platene. Celler ble igjen enten ubehandlet eller behandlet med 20 uM BBR. Etter 48 timer ble såret gapet observert og cellene ble fotografert.
BBR trykkes celleproliferasjon og kolonidannelse
Berberine har vist seg å indusere veksthemming og apoptose av non-small celle~~POS=TRUNC humane lungekreftceller via p53 signalveien [43]. Vi analyserte neste kvantitativt virkningen av BBR på celleformering i lungecancer A549 og H1299 celler ved MTT-analyse. Behandling med BBR i en dose på 10 uM til 200 uM inhiberte cellelevedyktighet på en doseavhengig måte. IC
50 verdier av BBR for A549 og H1299 celler er 67,1 uM og 59,2 uM, henholdsvis (figur 2A). Vi testet også effekten av BBR på tumorcelle clonogenicity i A549-celler (figur 2B). Behandling med BBR markert hemmet kolonidannelse, noe som resulterer i en signifikant reduksjon i både kolonidannelse forholdet (figur 2C) og kolonistørrelse (figur 2D).
(A-C) Menneske A549 og H1299-celler ble behandlet med BBR ved de angitte doser. Ved 48 timer etter behandling, ble cellelevedyktigheten bestemmes ved en MTT-analyse. IC50-verdiene av BBR for A549 og H1299 cellene ble beregnet (A). Tumorcelle A549-indusert kolonidannelse ble også analysert (B), og den kolonidannelseshastigheten (C) og kolonistørrelse (d) ble beregnet. Celler behandlet med DMSO ble anvendt som referent gruppe med cellelevedyktighet satt til 100%. Den prosentvise cellelevedyktighet i hver behandlingsgruppe ble beregnet i forhold til celler behandlet med DMSO bærerkontroll. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD av tre tester. *, P 0,05, signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene og DMSO kontrollgrupper.
BBR hemmet AP-2 /hTERT signaliserer
hTERT har vært ansett som kjennetegner kreftutvikling og uttrykk for hTERT er kontrollert av Transkripsjonsfaktor faktor~~POS=HEADCOMP AP-2. For å avgjøre om BBR er rettet mot AP-2 /hTERT signalering, behandlet vi A549 celler med BBR (20 mikrometer eller 100 mm) og undersøkt uttrykk for AP-2α, AP-2β og hTERT proteiner og mRNA ved hjelp av Western blot og RT-PCR hhv. Behandling med BBR førte til en markert hemming av ekspresjon av AP-2α, AP-2β og hTERT ved protein (figur 3A) og mRNA-nivåer (figur 3B).
(A-C) human NSCLC-celler A549 ble behandlet med BBR på de angitte doser. Ved 48 timer etter behandling, ble AP-2 og hTERT-proteiner (A) og mRNA (B) analysert ved Western blotting og RT-PCR, respektivt. GAPDH ble brukt som kontroller for utvalg lasting. Bindingen av AP-2 til hTERT promoter probe (C) ble analysert ved hjelp av et streptavidin-agarose nedtrekk analysen. (D) A549-celler ble transfektert med et AP-2 siRNA eller en AP-2-uttrykkende vektor i 24 timer, og deretter behandlet med BBR (100 uM). Ved 48 timer etter behandling, ble protein ekspresjon og cellelevedyktigheten bestemmes ved hjelp av Western blot og MTT-analysen, respektivt. Den prosentvise cellelevedyktighet i hver behandlingsgruppe ble beregnet i forhold til celler behandlet med bærerkontrollen. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. *, P 0,05, signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene og DMSO kontrollgrupper.
Siden hTERT uttrykk er strengt kontrollert av bindingsaktivitet av AP-2 familien på hTERT promoter, neste utførte vi streptavidinagarose rullegardinanalyse å undersøke effekten av BBR på AP-2a og AP-2p bindende aktiviteter på hTERT promoter. Som vist i figur 3C, BBR behandling effektivt opphevet AP-2α og AP-2β binding til biotinmerket hTERT promoter DNA-probe (figur 3C).
å bekrefte rollen til AP-2-signalisering i BBR- mediert celle proliferasjon hemming, transfekterte vi A549 celler med AP-2α eller AP-2β siRNA (100 nM) og deretter behandlet dem med BBR (100 uM) i 48 timer. Resultatene viste at transfeksjon med AP-2α eller AP-2β siRNA effektivt ned-regulert ekspresjon av AP-2α eller AP-protein og 2β betydelig hemmet cellelevedyktighet (figur 3D). Knockdown av AP-2α eller AP-2β av siRNA også markert øket BBR-mediert inhibering av cellelevedyktighet i forhold til transfeksjon med styre siRNA (Si-NC) (figur 3D). Disse resultatene bekrefter at effekten av BBR på hemming celleproliferasjon formidles i det minste delvis gjennom AP-2 /hTERT signalveien i lungekreftceller.
BBR hemmet NF-kB /COX-2 signal
Høy ekspresjon av COX-2 er innblandet i kreftcellevekst, migrasjon og angiogenese. For å bestemme effektene av BBR på COX-2-signalisering i lungekreftceller, vi neste analyserte ekspresjon av COX-2-protein i A549-celler behandlet med BBR ved Western blot. Behandling med BBR i en dose på 20 uM ikke signifikant hemmet COX-2-protein ekspresjon, mens en dose på 100 uM markert redusert COX-2 protein-ekspresjon i A549-celler (figur 4A).
(A) menneske~~POS=TRUNC A549 celler ble behandlet med BBR på de angitte doser. Ved 48 timer etter behandling, ble de COX-2-proteinet analysert ved Western blotting. GAPDH ble brukt som kontroller for utvalg lasting. (B) A549-celler ble forbehandlet med en COX-2 selektiv hemmer celecoxib (CB, 20 pM) i 24 timer, og deretter behandlet med BBR (20 uM). Ved 48 timer etter behandling, ble cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analyse. Den prosentvise cellelevedyktighet i hver behandlingsgruppe ble beregnet i forhold til celler behandlet med bærerkontrollen. (C) A549-celler ble behandlet med BBR ved de angitte doser. Ved 48 timer etter behandling, bindingen av p50 og p65 til COX-2 promoter probe ble analysert ved hjelp av et streptavidin-agarose nedtrekk analysen. (D) A549-celler ble behandlet med BBR (100 nM). Ved 48 timer etter behandling, ble effekten av BBR på NF-kB p65 og p50 trans analysert ved hjelp av immunofluorescens-analyse. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. *, P 0,05, signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene og kontrollgruppene. DMSO
ekspresjon av COX-2 er strengt regulert av bindingsaktiviteten av p50 /p65 NF-kB på COX-2-promoteren struktur. Vi neste bestemmes om BBR-indusert hemming av tumorcelle-proliferasjon og COX-2 ekspresjon blir mediert ved inhibering av binding av NF-kB til COX-2-promoteren i A549-celler. Streptavidin-agarose pull-down-analysen viste at BBR i en dose på 100 uM markert hemmet NF-kB P50 og P65 som binder til COX-2 promoter probe sammenlignet med kontrollgruppen (figur 4B). I motsetning til dette, fikk BBR i en dose på 20 og 100 uM ikke påvirke P50 p65 og proteinnivåer i helcellelysater (figur 4A).
translokasjon av NF-kB p65 og p50 i cellekjernene og cytoplasma spiller en sentral rolle i å regulere COX-2 genuttrykk. Vi utførte neste immunfluorescens assay for å evaluere effekten av BBR på NF-kB p65 og p50 translokasjon i A549-celler. Konstitutiv translokasjon av NF-kB p65 og p50 til cellekjernene ble påvist (figur 4C). Behandling med BBR (100 mm) effektivt fremmet translokasjon av NF-kB p65 og p50 fra cellekjerner til cytoplasma. Resultatene tyder på at inhibering av tumorcellevekst ved BBR kan også mediert ved modulering av NF-kB /COX-2-signalveien i lungekreftceller.
BBR hemmet HIF-1α /VEGF, PI3K /AKT , Raf /MEK /ERK signal
HIF-1α /VEGF /PEDF signalering er nært forbundet med kreft cellevekst, migrasjon og angiogenese. Vi har fastslått ved virkningen av BBR på ekspresjon av HIF-1α, VEGF og PEDF på protein og mRNA-nivåer i lungekreftceller med henholdsvis RT-PCR og Western blot,. Behandling av A549 celler med BBR vesentlig hemmet ekspresjon av HIF-1α og VEGF, men ikke PEDF, ved protein (figur 5A) og mRNA-nivåer (figur 5B).
A549-celler ble behandlet med BBR ved den indikerte doser. Ved 48 timer etter behandling, uttrykket av HIF-1α, VEGF og PEDF på protein (A) eller mRNA nivåer (B), samt total og fosforylert Akt og ERK1 /2 proteiner (D), ble bestemt. A549-celler ble behandlet med den HIF-1α-spesifikke siRNA (Si-HIF) (C) eller den Akt-selektiv inhibitor LY294002 (LY, 30 uM) eller ERK-selektiv hemmer U0126 (U, 50 pM) (E) for 24 timer, henholdsvis, og deretter behandlet med BBR. Ved 48 timer etter behandling, ble cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analyse. Den prosentvise cellelevedyktighet i hver behandlingsgruppe ble beregnet i forhold til celler behandlet med bærerkontrollen. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre separate eksperimenter. *, P 0,05, signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene og DMSO kontrollgrupper.
For å validere effekten av BBR på HIF-1α /VEGF /PEDF signalering, transfektert vi A549 celler med HIF-1α siRNA (100 nM) og deretter behandlet dem med BBR (100 uM) i 48 timer. Som vist i figur 5C, knockdown av HIF-1α ved siRNA vesentlig økt BBR-mediert inhibering av celleproliferasjon sammenlignet med transfeksjon med kontroll siRNA. Disse resultatene bekrefter at effekten av BBR på hemming celleproliferasjon formidles også delvis gjennom HIF-1α /VEGF /PEDF signalveien i lunge kreftceller.
PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK signal spiller en viktig rolle i regulering av tumorcelle-proliferasjon og overlevelse. For å bestemme hvorvidt den BBR-mediert cellevekst-inhibering er også gjennom inaktivering av PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK-signalveien, analyserte vi effekten av BBR på fosforylering av Akt og ERK i A549-celler ved Western blot. Som vist i figur 5D, behandling med BBR signifikant reduserte nivåer av fosforylert Akt og ERK1 /2 proteiner, mens nivåene av total Akt og ERK1 /2-proteinet ble ikke endret.
BBR aktivert kaspase-avhengige apoptotiske pathway
Vi har også fastslått hvorvidt den forbedring av cellevekst inhibering indusert ved BBR er assosiert med økning av apoptose i lungekreftceller. Behandling med BBR i doser på 20 og 100 um induserte 26% og 50% apoptotiske celler i A549 og 28% og 60% apoptotiske celler i H1299 celler (figur 6A). For å bekrefte virkningen av BBR på apoptose, vi neste detekterte ekspresjonen av noen pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner, caspase-3/7/9, PARP, BAX og Bcl-2 i A549-celler ved hjelp av Western blot-analyse. BBR markert øket uttrykket nivåer av spaltet caspase-3/7/9, spaltet PARP og BAX-proteiner, men reduserte Bcl-2-protein nivåer, sammenlignet med kontrollgruppen (figur 6B).
A549 og H1299-celler ble behandlet med BBR (20 pM eller 100 pM). Ved 48 timer etter behandling, ble apoptose bestemt ved en FACS-analyse (A). Nivåene av den spaltede caspase-3, 7, 9, spaltes PARP, ble BAX og Bcl-2 proteiner i A549-celler analysert ved hjelp av Western blot (B). Frigivelsen av Cyt-c i A549-celler ble analysert ved hjelp av immunofluorescens bildeanalyse for å overvåke Cyt c-frigjøring fra den inter-mitokondrie plass i cytosol (C). Den apoptose er representert ved relative prosentandeler av apoptotiske celler versus at i DMSO-behandlede celler. *, P . 0.05, signifikante forskjeller mellom de BBR-behandlede grupper og DMSO-behandlede grupper
Cytokrom-c (Cyto-c) utgivelse er en viktig begivenhet i caspase-avhengige apoptose veien . Vi utførte neste immunfluorescens imaging (IF) analyse for å overvåke endringer i den subcellulære lokalisering av Cyto-c i A549-celler for å bestemme om BBR kunne indusere Cyto-c frigivelse. Behandling med BBR (20 mikrometer eller 100 mm) markert utløste utgivelsen av Cyto-c fra inter-mitokondrie plass i cytosol (figur 6C). Disse resultatene viser at BBR kan lette nedstrøms Cyto-c-avhengige apoptosome montering og caspaseaktivering i cytosol i lungekreftceller.
Diskusjoner
I denne studien har vi evaluert responsen av menneskelig lungekreft celler A549 og H1299 til BBR, en isokinolin derivat alkaloid isolert fra kinesiske urter. Vi fant at BBR forbedret cellevekst-inhibering og induksjon av apoptose i en doseavhengig måte, mens slik effekt ikke ble observert i normale humane bronkiale epitelceller (data ikke vist). Våre resultater viste at antitumoreffekt av BBR er mediert ved modulering av AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF /PEDF, NF-kB /COX-2, PI3K /Akt, Raf /MEK /ERK, caspase /cytokrom C og BAX /BCL-2-avhengige signalering.
hTERT har vært ansett som landemerke i kreftutvikling. AP2 /hTERT signale ble vist å være viktig i ikke-småcellet lungekreft [44]. Inhiberingen av hTERT ekspresjon ble funnet å bidra til å forebygge proliferasjon og angiogenese, og for å indusere apoptose av kreftceller [45]. I vår studie demonstrerte vi at virkningen av BBR på inhibering tumorcelle-proliferasjon er formidlet delvis gjennom AP-2 /hTERT signalering. Behandling med BBR undertrykket ekspresjon av AP-2a og 2b-AP og reduserte protein overflod i cellekjerner, og dermed redusere bindingen av AP-2a og 2b-AP til hTERT-promoteren og nedregulering av ekspresjon av hTERT i BBR- behandlede celler.
øket forhold av VEGF /PEDF er nødvendig for angiogenese og tumorvekst [46]. Den HIF-1α /VEGF /PEDF sti eksisterer som et avgjørende skritt i lungekreft angiogenese og metastase [47]. Vår studie viste at BBR hemmet HIF-1α uttrykk, og dermed hemmet VEGF /PEDF forholdet i lungekreftceller. Det er mulig at BBR hemmet HIF-1α protein akkumulering i lungekreftceller, og deretter undertrykket ekspresjon av de relaterte gener som er involvert i tumorcelle-proliferasjon. Således viser våre resultater at HIF-1α signale bidrar, i det minste delvis, til BBR-indusert hemming av cellevekst.
COX2 spiller en nøkkelrolle i tidlige stadier av lunge karsinogenese [48]. Her viste vi at BBR spilt sin anti-proliferativ rolle delvis gjennom å hemme COX-2 uttrykk. Vi fant at BBR hemmet COX-2 ekspresjon ikke bare på proteinnivået, men også på mRNA-nivå, noe som tyder på at BBR kan utøve antitumor effekt delvis ved undertrykkelse av COX-2-signalering. Vi fant også at inhiberingen av COX-2 ekspresjon ved behandling av BBR er delvis mediert ved å stimulere NF-kB translokasjon fra atom til cytosol og ved å inhibere bindingen av NF-kB til COX-2-promoteren.
PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK signal spille en sentral rolle i regulering av celle genekspresjon, vekst overlevelse. Forholdet mellom Raf /MEK /ERK og PI3K /AKT til lungekreft er fortsatt en intens forskningsområde i dag [49,50]. Vår forskning har vist den viktige rollen PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK signalveien i BBR-mediert hemming celleproliferasjon. BBR kan fungere gjennom inaktivering av PI3K /AKT og Raf /MEK /ERK-signalveien, inhibering av fosforylering av Akt og ERK-proteiner, og downregulating HIF-1α signalering for å hemme tumorcellevekst.
Apoptose spille en avgjørende rolle i responsen av kreft på kjemoterapi og strålebehandling. I denne studien demonstrerte vi at induksjon av apoptose i humane lungekreftceller ved BBR ble mediert av cytokrom-c og kaspase-avhengig apoptose veier. Vi fant ut at BBR indusert aktivering av caspase og PARP proteiner, og fremmet utgivelsen av cytokrom-c fra mitokondriene til cytosol. Våre resultater tyder derfor antitumoreffekten av BBR i lungecancerceller er forbundet med den økte aktivering av cytokrom-c og caspase-avhengige apoptotisk reaksjonsvei.
I sammendrag, vi demonstrert at BBR utviste anti-proliferative og pro -apoptotic aktiviteter i NSCLC celler gjennom samtidig modulering av AP-2 /hTERT, HIF-1α /VEGF, NF-kB /COX-2, Raf /MEK /ERK, PI3K /AKT og caspase /cytokrom-c signalveier. Disse funnene gir ny innsikt i å utforske nye potensielle terapeutiske strategier og nye mål for lungekreft behandling.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige lungekreft cellelinjer A549 og H1299 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler ble dyrket som monolag i RPMI 1640 kulturmedium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 100 ig /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og holdt i en inkubator med en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
Reagenser og antistoffer
Berberine (BBR), ble U0126, LY294002 og celekoksib kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO) og oppløst i en liten mengden av DMSO før tilsetning til den komplette cellekulturmedium. Streptavidinagarose ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Antistoffer mot GAPDH, VEGF, PEDF, HIF-1α, p50, p65, COX-2 ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer mot AP-2α, AP-2β, hTERT, cytokrom-c, PARP, caspase-3/7/9, BAX, BCL-2, Akt, ERK1 /2, phosphrylated Akt eller ERK1 /2 ble kjøpt fra Cell Signaling ( Beverly, MA).
sårhelende analysen
sårhelende analysen ble utført for å oppdage cellemigrasjon. Cellene ble dyrket til fullstendig konfluens i seks-brønns plater og inkubert over natten i sultemedium. Cellemonolag ble såret med en steril 100 mL pipettetip, vasket med sultemedium for å fjerne frigjorte celler fra platene. Celler ble behandlet med angitte doser av BBR i fullstendig medium og holdt i en CO
2 inkubator. Etter 48 timer ble mediet erstattet med PBS, ble såret gapet observert og cellene ble fotografert med et Olympus mikroskop utstyrt med digitalt kamera.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble bestemt ved hjelp av MTT-analyse (Roche Diagnose, Indianapolis, IN). I korthet, ble lungecancercellelinjer sådd ut ved 4 x 103 celler /brønn i 96-brønners plater. Celler ble dyrket over natten, og deretter ble cellene flyttet til friskt medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av BBR oppløst i DMSO (sluttkonsentrasjon, 0,1%). Etter at cellene ble inkubert i 48 timer ble cellevekst målt. Den effekt på cellelevedyktighet ble vurdert som prosent cellenes levedyktighet sammenlignet med vehikkelbehandlede kontrollceller som ble vilkårlig tildelt 100% levedyktighet. De BBR konsentrasjonen som kreves for å forårsake 50% hemming av cellevekst (IC50) ble bestemt ved interpolering fra dose-responskurver.
Anchorage uavhengig kolonidannelsesbestemmelsen
A549-celler sådd ut i 6-brønns plater ble behandlet med BBR. Etter 24 timer ble cellene vasket med PBS og trypsinisert. Deretter celler (8 x 10
3 /ml) ble blandet i 1,0 ml 0,3% McCoys 5a-agar inneholdende 10% FBS. Kulturene ble holdt i en 37 ° C, 5% CO
2 inkubator i 14 dager. Mediet ble fjernet og cellene ble forsiktig vasket med PBS to ganger.
