Abstract
Bakgrunn
Cell gratis DNA (cfDNA) sirkulerer gjennom blodet av både friske personer og pasienter med ulike sykdommer og virker på cellene. Respons på cfDNA avhengig av konsentrasjon og nivåer av skadene innen cfDNA. Oksidert ekstracellulært DNA fungerer som en stress-signal og utløser en adaptiv respons.
hovedfunnene
Her viser vi at oksidert ekstracellulære DNA stimulerer overlevelsen av MCF-7 tumorceller. Viktigere, i celler eksponert for oksydert DNA, blir suppresjon av celledød ledsaget av en økning i markører for genom ustabilitet. Kortsiktig eksponering for oksiderte DNA resultater i både enkelt- og dobbeltrom strand DNA pauser. Lengre behandlinger fremkalle en kompenserende reaksjon som fører til en nedgang i nivåene av kromatin fragmentations over cellepopulasjoner. Eksponering for oksydert DNA fører til en reduksjon i aktiviteten av NRF2 og en økning i aktiviteten av NF-kB og STAT3. En modell som beskriver rollen til oksidert DNA frigjøres fra apoptotiske celler i tumorbiologi er foreslått.
Konklusjon /Betydning
Survival of celler med en ustabil genom kan vesentlig øke progresjon av kreft. Videre studier av effekter av ekstracellulært DNA på ondartede og normale celler er garantert
Citation. Kostyuk SV, Konkova MS, Ershova ES, Alekseeva AJ, Smirnova TD, Stukalov SV, et al. (2013) en eksponering til Oksidert DNA Forbedrer Begge Ustabilitet av Genome og overlevelse i kreftceller. PLoS ONE 8 (10): e77469. doi: 10,1371 /journal.pone.0077469
Redaktør: Roberto Amendola, ENEA, Italia
mottatt: May 25, 2013; Akseptert: 3. september 2013, Publisert: 17 oktober 2013
Copyright: © 2013 Kostyuk et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av RFBR (12-04-32081; 12-04-32074), av kontraktene No. 14.512.11.0090 og nr 8273 (under samtalen No. 2012-1.1-12-000-2008-067) av departementet for utdanning og vitenskap i Russland og Jeffress Foundation Grant No. J-1023. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cell gratis sirkulerende DNA (cfDNA) fragmenter kan hentes fra plasma, serum eller andre kroppsvæsker av både friske personer og pasienter med ulike sykdommer. Oftest er effekten av cfDNA studert ved hjelp av
in vitro
modeller av ekstracellulært DNA (ecDNA), isolert fra cellefrie supernatanter av dyrkede celler [1], enten intakt eller utsatt for ulike typer oksidativt stress.
Oksidativt stress er kjent for å indusere celledød. Døende celler frigjøre fragmenter av oksydert DNA i cfDNA bassenget. cfDNA sirkulerer gjennom hele kroppen og forårsaker sekundære, systemiske effekter i fjerntliggende organer og vev. cfDNA ekstrahert fra blodplasma fra pasienter med høye oksidativt stress nivåer er kjent for å påvirke den fysiologiske aktiviteten av intakte celler [1-6]. I mesenchymale stamceller (MSC), både ecDNA hentet fra media av primærtumorceller kulturer og cfDNA hentet fra plasma av kreftpasienter har påvirket ROS produksjon [5]. I fibroblaster, oksydert ecDNA fremkaller en adaptiv respons som manifesterer seg som en økning i motstanden av behandlede celler til bestråling og kronisk stress midler [7]. Faktisk, ecDNA fragmenter tjene som spenningssignaler for både det adaptive og for bystander effekt som utvikler seg som reaksjon på en lav dose bestråling i mange typer av dyrkede celler [1,8-15].
Forrige
in vitro
studier profilert de ulike effektene av cfDNA /ecDNA i dyrkede primære celler, inkludert menneskelige endotheliocytes [2,3], mesenchymale stamceller (MSC) [5,6], lymfocytter [8-10,12] og fibroblaster [7], så vel som rotte kardiomyocytter [4] og nerveceller [16]. Men ingen studier så langt har beskrevet effekter av ecDNA på kreftceller, til tross for den åpenbare relevansen av denne modellen til behandlingen av menneskelige kreftformer, spesielt på grunn av overflod av publiserte observasjoner som indikerer en økning i cfDNA konsentrasjoner i sirkulasjon av kreftpasienter [17-25]. Kreftceller skiller seg fra vanlige de av sine økte nivåer av ROS; nivåene av oksidasjon i tumor-DNA er også høyere enn i normalt vev. Faktisk, både bestråling og kjemoterapi fører til den oksidative død av et stort antall tumorceller, teoretisk sett, noe som resulterer i en massiv frigjøring av oksydert cfDNA.
I denne studien beskriver vi effekten av økning i ecDNA oksidasjon og ecDNA konsentrasjoner på ulike karakteristikker av østrogen (ER) og progesteron reseptor (PR) positiv brystkreft celle MCF-7. Her viser vi at oksyderes ecDNA indusere i disse celler en oksidativt stress som, på den ene side, er ledsaget av en manglende evne til å opprettholde stabiliteten av genomet og, på den annen side, fører til utvikling av adaptiv respons som forbedrer celleoverlevelse .
Resultater
Konsentrasjoner av ecDNA i media betinget av intakte MCF-7 celler var i gjennomsnitt på 140 ± 20 ng /ml. Effekter av gDNA og gDNA
OX ble evaluert etter å legge ulike konsentrasjoner av respektive DNA til dyrking media. Intakt gDNA ble ekstrahert fra primære humane embryonale fibroblaster (HEFs), mens gDNA
OX prøver ble oppnådd som et resultat av behandlingen av gDNA med H
2o
2 som vi tidligere beskrevet [15]. Nivåene av 8- oxodG i gDNA var på
~ 0,1 8-oxodG per million av 2 «deoksynukleosider, mens i gDNA
OX disse nivåene var på ~ 750 8-oxodG per million av 2′ deoksynukleosider [5,7]. For å sikre at gDNA varer gDNA
OX av midlere lengde av dets fragmenter og deres størrelsesfordeling (0,2 til 15 kb), ble gDNA behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DNAse I og den tilsvarende gDNA prøven ble valgt etter elektroforetisk evaluering i agarosegeler. Sammenlignende effekt av gDNA og gDNA
OX behandlinger ble studert ved et sluttmedium konsentrasjoner på 50 ng /ml eller 5 ng /ml, mens eksponering varierte fra 30 minutter til 48 timer.
1. Lokalisering av gDNA og gDNA
OX i MCF-7 celler
For å finne ut intracellulære steder av gDNA og gDNA
OX, ble en rekke DNA-prober syntetisert og ulikt merkes. gDNA
røde og pBR322
grønne prober ble merket ved hjelp av nick-oversettelse med henholdsvis SpectrumRed og SpectrumGreen,. I MCF-7-celler, gDNA
rød og pBR322
grønn demonstrere lignende granulert, klumpet seg fargemønstre i periferien av cytoplasma, synlig i ca 70% av cellene (figur 1А). Mer detaljert analyse viste at intracellulær fordeling av merkede DNA-fragmenter som er spesifikke prøve (figur 1В). I celler behandlet med både gDNA
rød og pBR322
grønn, er noen deler av cytoplasmaet farget med en, men ikke den andre typen av merket DNA. Områder farget med mer sekvens-mangfoldig gDNA
rødt er til stede i større antall og oppta et større volum av cellen. I gDNA
røde fargede celler var det også en diffus flekker nær atom konvolutt som var synlig på et høyere forstørrelse (x 200). Våre observasjoner tyder på at i hvert fall noen eksogene gDNA fragmenter er importert inn i cellen
A – gDNA
rød, kjerner er farget med DAPI (x40).; B – fusjonerte fargemønstre av gDNA
rød og pBR322
grønn (x200); С – fusjonerte fargemønstre av gDNA
rød-okse og FITC-konjugerte antistoffer mot 8-oxodG (x200); D – FACS analyse av tidlig endosomal markør EEA1; fordelingen av cellene med varierende EEA1 innhold.
Slutt konsentrasjoner av tilsatt DNA i media var på 50 ng /ml; Cellene ble inkubert med DNA i 30 minutter før fiksering i 3% formaldehyd. Ved farging med FITC-konjugerte antistoffer mot 8-oxodG ble faste celler forbehandlet med 0,1% Triton Х100 for gjennomtrengning.
For å bestemme intracellulære steder for gDNA
OX, en sammensatt sonde ble produsert ved langsom renaturering av nick-oversettelse merket gDNA
rød og gDNA
OX (gDNA
rød-OX). I likhet med gDNA
rød, dette sammensatte merket probe ble også plassert ved periferien av cytoplasma (fig 1С), imidlertid, i tilfelle av den sammensatte sonden gDNA
rød-OX, en vesentlig del av de merkede fragmenter funnet inne i cytoplasma nær kjernen. For å bekrefte at denne diffuse flekker samsvarer oksidert DNA, farget vi cellene med FITC-konjugerte antistoffer mot 8-oxodG (figur 1C). Våre data indikerer at gDNA
OX importeres inn i cellen ved en vesentlig større grad enn gDNA. Etter inn i cellen, lokaliserer gDNA
OX i cytoplasma, danner foci rundt kjernen.
Endocytose er en av de vanligste måtene for levering av eksogene forbindelser inn i cellen. Dannelsen av nye endosomer er ledsaget av en økning i ekspresjon av tidlige endosomet antigen 1 protein (EEA1), kjent som en tidlig endosomale biomarkør [26]. Ved hjelp av FACS, demonstrerte vi at eksponering for DNA
OX fører til en økning av andelen av celler som uttrykker høye nivåer av EEA1 (figur 1D). Disse observasjonene er på konsert med visuelle mønstre av intracellulær farging for gDNA
OX.
Det er kjent at intracellulære sensorer er i stand til å binde seg til DNA-fragmenter enten inne i cytoplasma (AIM2, RIG1, STING) [27 ] eller innenfor endosomer (TLR9) [28]. Interessant, 2-timers eksponering for gDNA
OX stimulerer ekspresjonen av mRNA som koder for AIM2, TLR9 og RIG1 (tabell 1). To DNA-sensorer, AIM2 og TLR9, ble undersøkt i større detaljer (figur 2).
Symbol genet
gDNA, 50 ng /ml
gDNA
OX, 50 ng /ml
2t
48h
2t
48h
Cell Cycle Checkpoint og cellesyklus arrest:
CDKN2A (p16INK4)
1,8 ± 0.53.3 ± 0,3 * 1,6 ± 0,1 * 2,5 ± 0,3 *
CDKN1A (p21CIP1 /WAF1)
1,3 ± 0.32.9 ± 0,2 * 1,1 ± 0.22.2 ± 0,2 *
TP53
0,8 ± 0.41.6 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 * 2,1 ± 0,2 * antiapoptotisk
BCL2
1,2 ± 0.22.5 ± 0,3 * 3,3 ± 0,3 * 3,2 ± 0,2 *
BCL2A1 (Bfl-1 /A1)
1,3 ± 0.32.0 ± 0,3 * 5,0 ± 0,3 * 1,8 ± 0,3 *
BCL2L1 (BCL-X)
1,0 ± 0.21.9 ± 0,3 * 1,2 ± 0.31.6 ± 0,3 *
BIRC3 (c-IAP1)
0,7 ± 0,33. 5 ± 0,4 * 1,8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,4 * Dobbel Strand Break DNA Repair
BRCA1
1,0 ± 0.11.0 ± 0.16.4 ± 0,6 * 2,1 ± 0,5 * Cytoplasmatiske DNA reseptorer:
AIM2
1,2 ± 0.21.3 ± 0.12.2 ± 0,2 * 2,5 ± 0,4 *
RIG1
1,5 ± 0.21.3 ± 0.22.4 ± 0,2 * 1,4 ± 0,3
STING
1,3 ± 0,21. 4 ± 0.21.0 ± 0.21.3 ± 0,3
TLR9
1,6 ± 0,2 * 1,3 ± 0.23.0 ± 0,3 * 1,2 ± 0.2Nrf2-Keap1 Pathway:
NRF2 (NFE2L2)
1,4 ± 0,1 * 1,1 ± 0.12.3 ± 0,1 * 1,2 ± 0,2
KEAP1
0,9 ± 0.11.1 ± 0.13.6 ± 0,2 * 1,0 ± 0.1NFκB Pathway:
MAP4K4
1.1 ± 0.21.5 ± 0.22.0 ± 0,1 * 1,1 ± 0,3
MyD88
1,0 ± 0.22.0 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 1,4 ± 0,2
NFKB1
1,6 ± 0,2 * 0,9 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1,5 ± 0,4
TIRAP
1,0 ± 0.22.2 ± 0,2 * 2,7 ± 0,3 * 1,3 ± 0.3STAT Familie:
STAT3
1,2 ± 0.21.8 ± 0,1 * 3,0 ± 0,3 * 1,0 ± 0.2
STAT6
1,2 ± 0.21.8 ± 0,3 * 1,6 ± 0,3 * 1,1 ± 0.3MAPK og JNK /p38 Pathway:
FOS
1,3 ± 0.21.4 ± 0.31.4 ± 0.21.3 ± 0,3
juni
1,6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * 1,9 ± 0,4 *
MAPK8 (JNK1)
0,8 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.3 ± 0,2 cytokiner
IL10
0,8 ± 0.25.3 ± 0,5 * 1,8 ± 0,2 * 4,2 ± 0,4 *
IL6
0,8 ± 0.31.8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 * 1,9 ± 0,2 *
IL8
1,7 ± 0,2 * 1,1 ± 0.23.2 ± 0,2 * 1,4 ± 0,4
TNFa
1,8 ± 0,2 * 2,2 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * celle adhesjon og Cell Migration molekyler:
ICAM1
0,9 ± 0.21.3 ± 0.22.6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,4
PECAM1
1,3 ± 0.21.4 ± 0.21.7 ± 0,2 * 1,2 ± 0,2
SELE
1.0 ± 0.11.1 ± 0.22.1 ± 0,3 * 1,0 ± 0,2
selp
3,7 ± 0,3 * 1,5 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.6 ± 0,3 *
VCAM1
1,5 ± 0.31.9 ± 0,2 * 3,2 ± 0,3 * 1,3 ± 0,2
RHOA
1,3 ± 0.21.2 ± 0.21.6 ± 0,2 * 1,1 ± 0.1Growth faktorer:
BNIP2
1,6 ± 0,2 * 1,7 ± 0,2 * 3,0 ± 0,3 * 2,4 ± 0,2 *
BMP4
1,2 ± 0.21.9 ± 0,3 * 2,6 ± 0,4 * 1,4 ± 0,4
VEGFA
1,3 ± 0.21.8 ± 0,4 * 0,7 ± 0.31.4 ± 0.3Pluripotent stamcellerelaterte gener:
Nanog
1,2 ± 0.31.4 ± 0,1 * 1,2 ± 0.21.0 ± 0,2
OCT4
1,2 ± 0.21.5 ± 0,2 * 2,5 ± 0,2 * 1,7 ± 0,1 *
Gata-4
1,1 ± 0.21.5 ± 0,2 * 1,4 ± 0.31.3 ± 0.3Table 1. Forandringene i ekspresjonsnivåer av utvalgte mRNA etter eksponering av MCF-7-celler til enten gDNA eller gDNA
OX.
relative nivåer av uttrykk er gjennomsnitt for tre biologiske replikater og et standardavvik. (*) P 0,05 – mot kontrollceller, ikke-para
U
-test (Mann-Whitney U-tester) CSV ned CSV
A – intracellulær lokalisering av AIM2 (FITC-konjugerte antistoffer) og merket probe gDNA
red-ox (x40). B – forholdet mellom nivåene av AIM1 [1] og TLR9 [2] – kodende RNA til nivåer TBP-kodende referanse mRNA i celler eksponert for gDNA, eller gDNA
OX i 2 timer (grå kolonner) og 48 timer ( svarte kolonner)
C og D -. Strømningscytometri påvisning av AIM2 (C) og TLR9 (D) ekspresjon i MCF-7. Celler ble farget med AIM2 (C) eller TLR9 (D) antistoff (sekundær PE-konjugerte antistoffer). Paneler D [1] og E [1] – kontrollceller plott: FL2 versus SSC. R: inngjerdet område. Paneler C [2] og D [2]: median signalintensiteten av FL2 (R) i MCF-7-celler (middelverdi for tre uavhengige eksperimenter). Paneler C [3] og D [3]: relative andeler av AIM2- eller TLR9-positive celler i R-porter [1]. Bakgrunnsfluorescens ble kvantifisert ved bruk av PE-konjugert sekundære antistoffer.
* p 0,05 mot kontrollgruppe av celler, ikke-parametrisk U-test.
AIM2.
I ikke-konfluente MCF-7 celler, nivåene av
AIM2
mRNA (figur 2B [1]) og protein ekspresjon (figur 2C) er lave. I kontrollceller, proteinnivåer AIM2 korrelerer med graden av sammenflytning. I ikke-konfluente kulturer, AIM2 uttrykt i omtrent 25% av cellene (figur 2C [1,3]). I konfluerende kulturer, andelen av celler med AIM2 øker to ganger (figur 2C [1,3]). Parallelt blir disse øker med økning i AIM2 proteinnivåer per celle (figur 2C [2]), mens nivåene av AIM2 som koder for mRNA forblir omtrent den samme (figur 2B [1]). Disse observasjoner kan forklares ved rådende regulering av AIM2 aktivitet på nivå med den oversettelse eller dets stabilitet i stedet for på nivået av transkripsjon og avvente ytterligere undersøkelser.
sammenslåtte fargemønstre for FITC-konjugerte anti-antistoffer og AIM2 merket probe gDNA
red-ox er vist i figur 2A. Mange fargede områdene, ja, overlapping, muligens indikerer en interaksjon mellom gDNA
OX med AIM2 sensorer. I dyrkede MCF-7-celler eksponert for oksydert DNA, er nivåene av både AIM2 protein og dets mRNA forhøyet (figurene 2B [1] og 2C). I AIM2-positive populasjon av celler, en eksponering til enten oksidert DNA eller genom DNA i 48 timer fører til nedgang i nivåene av AIM2 protein per celle (figur 2С [2]).
TLR9.
I ikke-konfluente MCF-7 celler, nivåene av TLR9 er lave, med ca 20% av cellene farget (figur 2B [2], D), i samråd med tidligere studier [28]. I sammenflytende MCF-7-kulturer, andelen av celler som uttrykker TLR9 protein øker til omtrent 40% (figur 2D [3]) sammen med intensitetene av TLR9 farging av individuelle celler (figur 2D [2]). I likhet med nivåene av AIM2 kodinger mRNA nivåene av TLR9 kodinger mRNA forbli uendret (figur 2B [2]). Etter 2 timer med eksponering for oksidert DNA, nivåene av TLR9 koding mRNA økning, mens mengder TLR9 protein i enkeltceller endres ikke.
Forlenget eksponering av MCF-7 til oksydert DNA fører til en reduksjon i intensiteten av fargingen av individuelle celler med anti-TLR9-antistoffer (figur 2D [2]). Tidligere lignende type responsen gDNA og gDNA
OX ble observert i dyrkede humane fibroblaster [7]. Alle sammen, våre data indikerer at langvarig eksponering for enten gDNA eller gDNA
OX fører til reduksjon av de cellulære nivåer av DNA-sensorer AIM2 og TLR9 og, eventuelt, til delvis desensibilisering av disse cellene til virkningen av ekstracellulært DNA.
2. Eksponering for gDNA
OX induserer kortsiktig oksidativt stress
For å studere mulig påvirkning av gDNA og gDNA
OX på intracellulære nivåer av reaktive oksygenforbindelser (ROS), ble det ROS målt ved hjelp dichlorodihydrofluorescindiacetate ( H2DCFH-DA) fargestoff som raskt trenger inn i cellemembraner, og blir fanget i cytosol i sin deacetylert form. Ikke-fluorescerende DCFH transformeres til fluorescerende DCF av en rekke ROS-radikaler, og derfor tjener som en følsom intracellulær markør for oksidativt stress [29]. Figur 3A viser resultatene av ROS-nivåer analyse i levende celler. I ubehandlede kontrollceller, DCF fargestoff diffust assosierer med overflaten av cellen, og kan fjernes fra membranen ved PBS vasking. De fleste vanlige kilder til ROS i cellemembranen er enzymer av NOX familie [30]. I celler behandlet med gDNA (50 ng /ml), visualiserer H2DCFH-DA flekk både membranen og noen mengde av intracellulære granuler. PBS-vaske påvirker ikke cytoplasmatisk granule farging. Mønstre av DCF granuler og merket gDNA
røde probe flekker omtrent overlapping (figur 3C), kan tyde på at et samspill av gDNA med noen cellulære bestanddeler stimulerer ROS biosyntese på stedet for kontakt. Denne observasjon stemmer overens med godt tidligere uttalt hypotese om at en eller annen måte ecDNA kan direkte stimulere enzymatisk aktivitet av NOX-proteiner [5]
А -. Mikroskopi-evalueringen av MCF-7-celler i rekkefølge behandlet med DNA (50 ng /ml) og H2DCFH-DA (kontroll, gDNA, gDNA
ox [1]) og inkubert i 30 minutter (x100). Alternativt ble MCF-7 celler inkubert med DNA (50 ng /ml) i 1 time etterfulgt av tilsetning av H2DCFH-DA og fotografering 30 minutter senere (gDNA
ox [2]). B – MCF-7-celler eksponert for gDNA
ox (0,5 timer; 50 ng /ml), ble i rekkefølge behandlet med Mito-tracker TMRM (15 min) og H2DCFH-DA (15 min) (x200). C – Co-deteksjon av merket probe gDNA
rød (50 ng /ml) og DCF etter 30 minutters inkubasjon. D – Resultatene av kvantifisering av fluorescens plateleser ved bruk av [1]. Tidskinetikken for fluorescens utganger i cellene i rekkefølge behandlet med H2DCFH-DA og tre minutter senere, en DNA-prøve ved sluttkonsentrasjon på 5 eller 50 ng /mL [2]. Den samme for celler forbehandlet med DNA (endelig konsentrasjon 5 ng /ml) i en time, med påfølgende tilsetning av H2DCFH-DA. *) P 0,05 mot kontrollgruppe av celler, ikke-parametrisk U-test.
I celler behandlet med gDNA
OX (50 ng /ml), oppstår intracellulære ROS-produserende granulater rask, og deres tall er vesentlig større enn i celler behandlet med gDNA (figur 3A, innfelt gDNA
OX [1]). Disse hendelsene er ledsaget av endringer i morfologien av MCF-7-celler, inkludert en økning i størrelse av kjerner og cytoplasmatisk dønninger. Det er viktig å merke seg at de observerte cellulære responser som er hurtig og kort-levende. Beskrevet endringer i fargemønstre og celle morfologi sett bare i tilfelle av sekvensielle filer av H2DCFH-DA og gDNA
OX til MCF-7 medier. Når cellene ble forbehandlet med gDNA
OX i 1 time, deretter studerte ved hjelp а H2DCFH-DA fargestoff, tall ROS-syntetiserer granulater sett i cellene var lavere og deres intensitet var mindre lys enn i manglende forbehandling protokoll (Figur 3А innfelt gDNA
OX [2]). Enda mer interessant, i pre-behandling protokollen, noen celler stoppet ROS biosyntese i det hele tatt, og ble enda mindre lyst så ikke-behandlede kontrollceller (mørkere celler som er mindre fluorescerende enn bakgrunnen (Figur 3А innfelt gDNA
OX (b )).
De observerte fenomenene ble uavhengig bekreftet i en studie av DCF generasjon kinetikk ved hjelp av kvantifisering med et fluorescerende leser (Figur 3D). Når MCF-7 celler ble behandlet med DNA umiddelbart etter tilsetting av H2DCFH-DA til media, en dramatisk økning i intensiteten av DCF fluorescens ble observert. Økningene var på den høyeste forekomsten av økning i løpet av de første 20 minutter etter tilsetting av DNA til media (koeffisient k1), så med tiden, disse prisene slipp ( koeffisient k2) (figur 3D [1], tabell innfelt) k1 og k2 koeffisientene var avhengig av type og konsentrasjon av DNA behandling. gDNA
OX (5 ng /ml) gDNA (5 ng /ml) gDNA
OX (50 ng /ml) ≥ gDNA (50 ng /ml) . kontroll Disse effektene ble ikke ses når cellene ble forbehandlet med DNA i 1 time før tilsetning av H2DCFH-dA (figur 3D [2]).
til sammen resultatene fra disse forsøkene indikerer at behandling med gDNA
OX raskt induserer ROS biosyntesen i MCF-7 celler. Parallelt med den motsatte prosess av undertrykkelse av ROS generasjon, eller ROS bråkjøling, blir innledet. Som større mengder av gDNA
OX ble tilsatt til mediet, jo hurtigere var utviklingen av ROS bråkjøling.
A mengden av intracellulære ROS er generert av mitokondrier. En økning i oksidativ metabolisme i mitokondriene kan føre til diffusjonen av ROS inn i cytoplasma og etterfølgende økning i perimitochondrial deteksjon av ROS ved DCF. For å teste denne hypotesen, vi sekvensielt farget cellene eksponert for 50 ng /ml gDNA
OX i 30 minutter med Mito-tracker (TMRM røde) og DCF (figur 3B). Et flertall av Mito-tracker og DCF-signalet var plassert nær hverandre, med delvis overlapper (gul signal, figur 3B). I intakte celler, ikke H2DCFH-DA ikke flekker mitokondrier (figur 3А, kontroll). Våre observasjoner peker på at i celler eksponert for oksydert DNA, blir et flertall av endogen ROS generert av mitokondrier.
3. Eksponering togDNA
OX stimulerer en økning i nivåene av oksidativ modifisering av cellens eget DNA
Det er sannsynlig at intensiv produksjon av ROS observert umiddelbart etter eksponering av celler til gDNA
OX kan resultere i skade på cellulært DNA. For å visualisere denne skaden ble faste MCF-7 celler farget med PE-merket anti-8-oxodG antistoffer (figur 4). Sammenlignet med ikke-behandlede kontrollceller, i MCF-7 kulturer behandlet med enten gDNA eller gDNA
OX, ble mengder av fargede celler økt (figur 4A (x20). Ved større forstørrelser, tre typer fargemønstre kan være detektert (Figur 4B):. (1) – nukleær farging, (2) -, cytoplasmatisk farge, (3) – farging for mikrokjerner i ikke-behandlede kontroll-populasjoner av MCF-7-celler, PE-merket anti-8-oxodG antistoffer overveiende flekk mikronuklei. i populasjoner som ble behandlet med gDNA
OX, var det en økning i omfanget av celler med nukleær farging (figur 4E). som våre tidligere eksperimenter viste at gDNA
rød-OX er lokalisert i cytoplasma og ikke trenge inn i kjernen, skal det observert farving av kjerner tilskrives den skade av cellens eget DNA
-. celler farget med PE-merket anti-8-oxodG antistoffer og DAPI (x20) B -. Tre typer av anti-8-oxodG flekk fordelingen observert i celler behandlet med gDNA
OX (x100). Celle ble inkubert med DNA-prøver i 1 time, fiksert med 3% formaldehyd, gjennomtrengt med 0,1% triton X100 og farget med anti -8-oxodG (PE-konjugert sekundære antistoffer). C – colocalization av 8-oxodG med mitokondrier. Cellene ble inkubert med gDNA
OX i 0,5 time, обработаны Mito-tracker (30 nM, 15 min), fotografert, og deretter fast med 3% formaldehyd, gjennomsyret med 0,1% Triton X100, farget med anti-8-oxodG antistoffer (FITC-konjugert sekundære antistoffer) og fotografert igjen. D – 8-oxodG innholdet i DNA-eksponerte celler forbehandlet med NAC (FACS-analyse). Celler ble inkubert med NAC (0,15 mM) i 30 min, deretter eksponert for gDNA
OX i 1 time og analysert ved hjelp av anti-8-oxodG antistoffer (PE-konjugerte sekundære antistoffer). Bakgrunnsfluorescens ble kvantifisert ved bruk av PE-konjugert sekundære antistoffer. E – Relative andeler av kjerner farget for 8-oxodG i ikke-behandlede kontrollceller, celler eksponert for gDNA, celler eksponert for gDNA
OX (grå søyler). Lys grå kolonnen reflekterer celler forbehandlet med NAC og utsatt for gDNA
OX. * P 0,05 mot kontrollgruppe av celler, ikke-parametrisk U-test.
En økning av mitokondrie biosyntese av ROS i gDNA
OX utsatt celler demonstrert ovenfor (figur 3В) kan føre til en økning i nivået av oksydasjon i mitokondrie DNA som, i sin tur, kan forklare den observerte cytoplasmatisk farge for gDNA
rød-OX er vist på figur 1C. På figur 4C, kan man se at noen 8-oxodG signalene ikke fusjonere med gDNA
rød-OX. I celler forbehandlet med antioksydant N-acetyl-cystein (NAC) (0,15 mM) i 30 minutter før eksponering for gDNA
OX, nivåene av oksidasjon i cellulært DNA var betydelig lavere enn i celler som ikke er behandlet med NAC (figur 4D og 4E).
4. Eksponering for gDNA
OX stimulerer en økning i trådbrudd i cellens eget DNA
En av velkjent trekk ved DNA oksidasjon er en opphopning av enkelt- og dobbeltrom strand DNA pauser (SSBs og DSB sin). For å kvantifisere SSBs og DSB sin i MCF-7 celler eksponert for enten gDNA eller gDNA
OX, ansatt vi komet elektroforese i alkaliske forhold (Figur 5 °). Tre typer kjerner ble nummerert: atomkjerner med intakt DNA (figur 5А [1], Type I); atomkjerner med en viss grad av kromatin fragmentering (Type II); kjerner med betydelig fragmentering av DNA (type III). I flertallet av tilfeller kjerner av ikke-behandlet kontrollgruppe klassifisert som enten type I eller type II, mens Type III kjerner er sett hovedsakelig i celler behandlet med gDNA
OX. Avhengig av hvor lenge cellene ble utsatt for gDNA
OX var andelen av Type III kjerner kan variere. Figur 5A viser også komet hale øyeblikkene [2] og% hale DNA [3]. Etter 30 minutters inkubasjon av MCF-7 celler med gDNA
OX, bryter mengder DNA drastisk øke, mens tilsvarende behandling med gDNA fører til moderat heving av kromatin fragmentering nivåer. Etter 2 timers inkubering med enten gDNA eller gDNA
OX, mengdene av DNA-bryter reduksjon, og deres antall faller til under for det som finnes i de respektive sluse-spesifikke populasjoner i ikke-behandlede kontrollceller.
А – Comet assay i alkaliske forhold [1]. – Digital fotografering av kjernene med varierende grad av DNA-skade [2,3]; – Kumulative histogrammet for hale øyeblikk og prosentandel av DNA i haler. Påliteligheten av forskjeller med kontroll i de oppnådde distribusjoner ble analysert ved hjelp av Kolmogorov-Smirnov statistikk (tabellen viser verdiene for D og α)
B -. DsDNA pauser i celler eksponert for gDNA
OX (50 ng /ml, 1 time) .Cells ble behandlet for immunofluorescens farging med anti γH2AX antistoff (x40) [1] .- Tre oppdaget typer kjerner er merket med tall: 1- kjerne med flere dsDNA pauser, 2- kjerne med noen dsDNA pauser, 3- kjerne med intakt DNA [2]. – Eksempel på en mikrokjerne med dsDNA pauser
С – FACS-analyse av γ-foci A.: Der hovedfraksjoner av cellene som tydelig i gating områder R1, R2, R3 [1], fordeling av γH2AX fluorescens intensiteter [2], relative mengder av celler i løpet av portområdene R1-R3 [3]. * P 0,05 mot kontrollgruppe av celler, ikke-parametrisk U-test.
Observasjoner beskrevet ovenfor uavhengig ble bekreftet ved hjelp av en annen vanlig teknikk for visualisering av DSB sin, en farging med antistoffer mot histone γH2AX, fosforylert av serin -139. Denne formen for H2AX er kjent for å raskt samle seg DNA loci flankerer DSB stedet [31]. MCF-7-celler farget med FITC-konjugerte antistoffer til Ser-139 fosforylert histon γН2АХ er vist på figur 5B [1]. Stained lysbilder også inkludert tre forskjellige cellepopulasjoner av γН2АХ positive celler. I dette eksperimentet, ble cellene klassifisert som Type 1-celler når de hadde multiple fosfo-γН2АХ foci. De fleste av de γН2АХ positive celler ble klassifisert som type 2 celler (mellom 2 og 10 tydelig γН2АХ foci per celle), og Type 3 celler med ingen tegn til det sentrale fosfo γН2АХ farging.
I anti-γН2АХ farging , samlet fluorescens intensitet av cellen er proporsjonal med antallet av γН2АХ foki pr celle, og, derfor, til mengden av DSB sin. Ved hjelp av FACS, tre gated områder, R1 til R3, ble undersøkt (figur 5C [1,2]). Celler i gate R1 har største FL1 (γH2AX); Dette tolkes som flere DSB sin (type 1 celler, figur 5B). Gate R2 inneholder celler med ikke mange γH2AX (type 2 celler). Gate R3 inneholder det største antall celler; de fleste av disse cellene er intakte uten DSB sin (Type 3 celler). I MCF-7-kulturer, en eksponering for gDNA
OX (1t) fører til et 1,5-folds økning i antall celler i løpet gate R1 som er parallell i en reduksjon i antallet celler i R2. Etter 24 timers eksponering for gDNA
OX, mengdene av cellene med flere DSB sin synke til nivåer under det som i ikke-behandlede kontrollceller (figur 5C [3]). En behandling med gDNA fremkaller lignende, men mindre uttalt typen av cellulær respons som i sin størrelse ikke når frem betydning når sammenlignet med ikke-behandlede kontrollceller (p 0,05).
Disse observasjonene tyder på at det i MCF-7 celler, kortvarig eksponering for gDNA
OX resultater i både enkelt- og dobbeltrom strand DNA pauser. Lengre varighet av behandlingen (mellom 2 og 24 timer) fremkalle noen form for kompenserende reaksjon som fører til en nedgang i nivåene av kromatin fragmentations over cellepopulasjoner.
Nedgangen i andelen DSB-holdige celler etter kortvarig eksponering for oksidert eller kontroll DNA kan forklares enten ved reparasjon av pausene, eller ved apoptose /avløsning av skadede celler, eller begge deler. For å evaluere disse mulighetene, nummerert vi celler som forblir i mediet etter at den fjernes fra cellelaget, og celler fjernet fra laget etter PBS vask. I kulturer utsatt for oksydert DNA i 2 timer, forble andelen av frigjorte celler som ligner på den i kulturer utsatt for genomisk DNA og ikke-behandlede kontrollkulturer (ca. 2% av den totale mengde celler i gitt kultur). Lignende resultater ble oppnådd i eksperimenter som tar sikte på direkte vurdering av apoptose (se nedenfor). Derfor er det sannsynlig at den reduksjon i andelen av celler med DSB sin observert etter eksponering for gDNA, eller gDNA
OX er på grunn av en økning i DNA-reparasjon.
5. Eksponering for gDNA
OX fører til en økning i genom ustabilitet
enkel eller dobbelt tråd DNA pauser er kjent for å resultere i tap av kromosom stabilitet som er særlig fremtredende i aktivt prolifererende celler [32]. En grundig undersøkelse av kjerner av celler inkubert med gDNA
OX viste uttalt kromosom ustabilitet (figur 6).
