Abstract
uttrykk for den inflammatoriske G-proteinkoblet reseptor CysLT
1R har vist seg å være oppregulert i kolon kreftpasienter og assosiert med dårlig prognose. Denne studien undersøkte sammenhengen mellom CysLT
1R og tykktarmskreft utvikling
in vivo
hjelp CysLT
1R antagonister (ZM198,615 eller Montelukast) og naken mus xenograft modell. To Drug Administration regimer ble etablert. Den første behandlingen ble etablert for å undersøke betydningen av CysLT
1R i startfasen. Nakne mus ble inokulert med 50 uM CysLT
1 R-antagonist-forbehandlet HCT-116 colon cancerceller og mottok videre behandling (5 mg /kg /dag, intraperitonealt). Den andre diett forsøkte å ta rollen som CysLT
1R i tumorprogresjon. Nude mus ble inokulert med ikke-forbehandlet HCT-116 celler og fikk ikke CysLT
1R antagonist behandling før skriv svulst utseende. Begge regimer førte til betydelig redusert tumorstørrelsen tilskrives endringer i proliferasjon og apoptose som bestemt ved reduserte Ki-67 nivåer og økte nivåer av p21
WAF /Cip1 (
P
0,01), spaltet caspase 3, og caspase-kløyvde produkt av cytokeratin 18. reduserte nivåer av VEGF (
P
0,01) og redusert fartøystørrelse (
P
0,05) ble også observert, sistnevnte bare i ZM198,615-forbehandling gruppe. Videre utførte vi en serie med
in vitro
studier med tykktarmskreft cellelinje HCT-116 og CysLT
1R antagonister. I tillegg til betydelige reduksjoner i celleproliferasjon, adhesjon og kolonidannelsen, observerte vi induksjon av cellesyklus og apoptose i en doseavhengig måte. Evnen til Montelukast til å hemme veksten av menneskelig tykktarmskreft xenograft ble ytterligere validert ved hjelp av to ekstra tykktarmskreft cellelinjer, SW-480 og HT-29. Våre resultater viser at CysLT
1R antagonister hemme veksten av tykktarmskreft xenografter primært ved å redusere spredning og indusere apoptose av kreftceller
Citation. Savari S, Liu M, Zhang Y, Sime W, Sjölander A (2013) CysLT
1R antagonister hemme tumorvekst i en Xenotransplantat modell for tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (9): e73466. doi: 10,1371 /journal.pone.0073466
Redaktør: Lishan Su, University of North Carolina i Chapel Hill, USA
mottatt: 01.11.2012; Godkjent: 22 juli 2013; Publisert: 05.09.2013
Copyright: © 2013 Savari et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet med tilskudd for AS fra den svenske Cancer Foundation (CAN 2009/1185, 10 0478), den svenske Medical Research Council (X-10356), Gunnar Nilsson Cancer Foundation (www.cancerstiftelsen.com), den Österlund Foundation, stiftelsen ved Skåne universitetssykehus, og for WS Royal physiographic Society i Lund (www.fysiografen.se). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eikosanoider omfatter et bredt spekter av biologisk aktive metabolitter lipid er avledet fra flerumettede 20-karbon essensielle fettsyrer. Arakidonsyre tilhører omega-6 familien, og er forløperen for eikosanoider slik som prostanoider, leukotriener, hydroksylgrupper eicosatetraenoic syrer (hetes), og epoksider. Disse eikosanoider er ansett pro-inflammatorisk; epidemiologiske, har kliniske og laboratoriestudier fastslått at den avvikende metabolisme av arachidonsyre via den cyklooksygenase (COX) og lipoksygenase (LOX) reaksjonsveier, som genererer prostanoider og leukotriener, henholdsvis, kan fremme kronisk inflammasjon og karsinogenese [1], [2- ]. Den ustabile leukotrien A
4 (LTA
4) er dannet av 5-LOX, i nærvær av 5-lipoksygenase-aktiverende protein (FLAP). LTA
4 er videre metaboliseres til enten LTB
4 eller cysteinyl leukotriener, LTC
4, LTD
4, og LTE
4 [3].
cysteinyl leukotriener er involvert i luftveis-prosesser, slik som slimsekresjon, øket vaskulær permeabilitet, eosinofil kjemotaxis, og bronkokonstriksjon [4], [5], [6], [7]. Cysteinyl leukotriener er også implisert i kronisk inflammatoriske tilstander, så som reumatoid artritt, astma og inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) [8], [9], [10]. Den inflammatoriske miljøet har blitt mye verdsatt som en av aktiverings egenskapene av kreft [11]. Følgelig er det en sterk korrelasjon mellom langvarige IBD, slik som ulcerøs kolitt og Crohns sykdom, i hvilken pro-inflammatoriske eikosanoider (dvs. arakidonsyre-derivater) er tallrike og tykktarmskreft [12], [13]. Tykktarmskreft er den tredje vanligste diagnosen kreft i verden og har den fjerde høyeste dødeligheten [14]. Det er anslått at pasienter som lider av IBD har en ca 30 ganger økt risiko for å utvikle tykktarmskreft [15]. Andre eikosanoider avledet fra arakidonsyre veien som er innblandet i tykktarmskreft inkluderer prostanoider. Prostaglandin E
2 (PGE
2) er avledet fra arachidonsyre via COX reaksjonsveien, og er den mest tallrike og mest omfattende studert prostanoid i kreft, spesielt kreft i tykktarmen. PGE
2 har vist seg å øke tumorbyrde i tarmen hos både APC
Min /+ og azoxymethane indusert mus [2]. LOX-5 og COX-2, er de enzymer som er ansvarlige for produksjon av leukotriener og cysteinyl PGE
2, henholdsvis, har også vært implisert i kreft i tykktarmen. Deres økte uttrykket har blitt dokumentert hos pasienter med kolorektal adenokarsinomer [16].
cysteinyl leukotriener formidle sine effekter gjennom G-protein koblede reseptorer (GPCR) og omtales som CysLT
1R og CysLT
2R, basert på deres farmakologiske karakterisering og funksjonell profilering som respons på en serie av agonister eller antagonister i forskjellige celle- og vevs-systemer [17]. CysLT
1R har en høyere affinitet for LTD
4, den mest potente cysteinyl leukotrien, mens CysLT
2R har en lavere, men lik affinitet for både LTD
4 og LTC
4 [18] , [19]. ZM198,615 og Montelukast er selektive CysLT
1 R-antagonister benyttet i studier av inflammatoriske sykdommer slik som reumatoid artritt og astma [20], [21]. Sistnevnte CysLT
1R antagonist er også brukt i klinikken for å behandle astmapasienter [22].
Balansen mellom CysLT
1 og CysLT
2 reseptoren synes å være viktig i sykdom etiologi for tykktarmskreft. Faktisk har vi vist at disse to reseptorene er co-lokalisert og danner både hetero og homodimerer i det humane tarm epitelcellelinje Int 407 og som LTC
4 stimulering av CysLT
2R regulerer negativt celleoverflate-ekspresjon av CysLT
1R [23]. Våre tidligere undersøkelser har også vist at LTD
4, via CysLT
1R induserer oppregulering av proteiner forbundet med kreft i tykktarmen, så som COX-2, β-catenin, og Bcl-2 i intestinale epitelceller [24] . I tillegg har vi vist at CysLT
1R blir oppregulert i tykktarmskreftpasienter og er assosiert med dårlig prognose [16], mens den samtidig lav ekspresjon av CysLT
1R og høy ekspresjon av CysLT
2R mediere god prognose [25]. Dessuten har tidligere arbeidet vårt vist at LTD
4-indusert CysLT
1R signale resultater i celle spredning, overlevelse og migrasjon [26], [27]. I motsetning til dette, LTC
4 stimulering av CysLT
2R har vist seg å indusere differensieringen av tykktarmskreftceller, og redusert ekspresjon av CysLT
2R er assosiert med dårlig prognose pasient [28].
i denne studien undersøkte vi funksjonen til CysLT
1R i tykktarm kreft vekst ved hjelp CysLT
1R antagonister. Effektene av CysLT
1R antagonister på HCT-116 human tykktarm kreft celler ble undersøkt både
in vitro Hotell og
in vivo
med naken mus xenograft modell.
materialer og metoder
Reagenser
CysLT
1R antagonist ZM198,615 (ICI-198615) var en gave fra Astrazeneca og CysLT
1R antagonist Montelukast ble kjøpt fra Cayman Chemicals Co (Ann Arbor, MI). Celleproliferasjon reagens WST-1 og muse-monoklonalt antistoff M30 CytoDEATH (01:10) var fra Roche (Basel, Sveits). Den Annexin V-PE apoptose Detection Kit var fra BD Pharmingen (San Diego, California). Quick Start ™ Bradford Dye Reagent, Mini-protean TGX ™ Gel, videregående pepperrot-konjugert antistoff og kjemiluminescens deteksjonsreagensen var fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Kanin monoklonale anti-human spaltet caspase 3-antistoff (1:200) ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kanin-monoklonalt anti-humant Ki67-antistoff (1:500) ble oppnådd fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Geit polyklonalt anti-mus PECAM-1 (CD31) antistoffer (1:700) og kanin-polyklonalt anti-human-VEGF-antistoff (1:200) ble anskaffet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Mus monoklonalt anti-human p21
WAF1 /Cip1 antistoff (1:1200) var fra DakoCytomation (Glostrup, Danmark). Kanin polyklonalt anti-human CysLT
1R antistoff (1:250) ble oppnådd fra Innovagen (Lund, Sverige). Mus monoklonalt anti-β-aktin-antistoff var fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Cysteinyl Leukotriene EIA kit ble kjøpt fra Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Alle andre kjemikalier var av analytisk kvalitet og ble hentet fra Chemicon International (Temecula, California) eller Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
Cell Culture
HCT-116 celler ( ATCC
® nummer CCL-247), avledet fra human colon carcinoma, SW-480 (ATCC
® nummer CCL-228) og HT-29 (ATCC
® No. HTB-38), avledet fra human kolon adenokarsinom, ble erholdt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA).
HCT-116 og HT-29 celler ble dyrket i McCoys 5A medium, mens SW-480-celler ble dyrket i RPMI 1640. Alle media ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) 55 ug /ml streptomycin, 55 IU /ml penicillin og 1,5 ug /ml Fungizone. Cellene ble dyrket i 5 dager for å 70
–
80
%
konfluens ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Alle forsøk ble utført med celler ved passasjer 5 til 30, og cellene ble regelmessig testet for å sikre fravær av mycoplasma forurensning.
Tumor Xenotransplantat Studier
Alle dyreforsøk ble godkjent av Regional Etisk komiteen for forsøksdyr~~POS=TRUNC ved Universitetet i Lund, Sverige (M205-10). Kvinnelige 6 til 8 uker gamle atymiske nakne mus (BalbC nu /nu) ble kjøpt fra Taconic Europe A /S (Ry, Danmark). For å indusere subkutane menneskelige tykktarmskreft xenografter, 2,5 × 10
6 lav-passasje HCT-116 celler i 100 mL PBS ble injisert inn i to flanker per mus (n = 7 mus /gruppe). To Drug Administration regimer ble etablert for å undersøke den funksjonelle betydningen av CysLT
1R antagonister i startfasen og progresjon. Dyrene ble behandlet i henhold til den første regimet ble inokulert med HCT-116-celler forbehandlet med enten DMSO (DMSO I), 50 uM ZM198,615 (Pre-ZM), eller 50 uM Montelukast (Pre-Montelukast), i 30 minutter. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon fargestoff-analyse og bare levedyktige celler ble vurdert for subkutan injeksjon. Deretter, fra dagen for inokulering, mottok musene daglig i.p. injeksjoner med DMSO eller CysLT
1 R-antagonister (5 mg /kg) oppløst i DMSO, fortynnet i PBS til et totalvolum på 100 ul (Figur 1a). I henhold til den andre regimet, ble dyrene inokulert med ikke-forbehandlet HCT-116-celler. Når håndgripelig svulster ble etablert 6 dager etter injeksjon, ble musene tilfeldig delt inn i tre grupper, og deretter bestemte seg for hvilken gruppe bør behandles med DMSO (DMSO II), ZM198,615, eller Montelukast. Musene mottok daglig i.p. injeksjoner av DMSO eller CysLT
1 R-antagonister (5 mg /kg) (figur 1E)
(A) Eksperimentell protokoll for forbehandling grupper.; BalbC (nu /nu) mus ble injisert subkutant i to flanker med HCT-116-celler forbehandlet med ZM198,615 eller Montelukast (50 uM), og fikk behandling intraperitonealt fra dagen for inokulering med DMSO, ZM 198,615, eller Montelukast (5 mg /kg /dag). (B) Tumor Forekomsten av mus som ble behandlet med DMSO (DMSO I gruppe), ZM198,615 (Pre-ZM gruppe), eller Montelukast (Pre-Montelukast gruppe) og (C) tumorvekt sammenlignet med DMSO jeg gruppe ved enden av eksperimentet (dag 21). (D) Representative tumorbilder fra forbehandling gruppen. (E) Eksperimentell protokoll for behandlingsstudie; ikke-forbehandlet HCT-116 celler ble injisert subkutant i to flankene av nakne mus. DMSO (DMSO II-gruppen), ZM198,615 (ZM-gruppen), eller Montelukast (Montelukast gruppe) behandling begynte på dag 6 etter tumorcelle vaksinasjon. (F) Tumorvolum over en 21-dagers periode, og (G) tumorvekt ved slutten av eksperimentet (dag 21). (H) Representative kreft bilder fra behandlingsgruppen. De kvantitative data som vises er gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05, **
P
0,01, ***
P
0,001. Tumor volum analyse ble utført av to-veis ANOVA og tumor vekt analyse ble utført av Student
t
test.
I tillegg, SW-480 eller HT-29 celler, 2,5 × 10
6 lav-passasje cellene i 100 mL PBS ble injisert inn i to flanker per mus (n = 12 og n = 18 mus for SW-480 og HT-29, henholdsvis) for å indusere subkutane menneskelige tykktarmskreft xenografter i kvinnelige 6 -to åtte uker gamle atymiske nakne mus (BalbC nu /nu). Alle mus hadde etablert palpable tumorer i begge flanker på dag 7 og ble randomisert i to grupper for hver cellelinje. Før initiering behandlinger, en søkeren målte tumor størrelser av alle tumorer for å sikre at det ikke var noen forskjell i størrelse mellom de forskjellige grupper. Musene fikk deretter daglig ip-injeksjoner i 14 dager med enten DMSO eller Montelukast (5 mg /kg) (= 6 og n = 9 mus per behandlingsgruppe for SW-480 og HT-29, henholdsvis).
mus kroppsvekt og tumorstørrelse ble målt hver tredje dag. Formelen for beregning av tumorvolumet var
V
= π /6 × 1,58 (
lengde x bredde
)
3/2 [29]. Etter 21 dager ble alle musene avlivet og tumorene fjernet, måles, veies, og fotografert. Tumorvev ble fiksert i 10% bufret formalin, innstøpt i parafin for immunhistokjemi analyse og /eller hurtigfrosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C for Western blot-analyse.
Dosen av Montelukast (5 mg /kg) ble valgt på grunnlag av publiserte data, hvor doser fra 5-10 mg /kg er blitt rapportert i en rekke mus eksperimentelle modeller [30], [31], [32]. Dosene av 2 mg /kg og 10 mg /kg ble også undersøkt, og resultatene viser lignende tendenser i xenograft tumorvekstinhibitering (data ikke vist).
Immunohistochemistry
Parafin-embedded seksjoner innhentet fra xenopodet svulster ble seksjonert (5 mm) for immunhistokjemisk farging. Alle prosedyrer ble utført ved hjelp av en Dako automatisk lysbilde Stainer i henhold til produsentens instruksjoner. Glassene ble fotografert med et Nikon Eclipse 800 mikroskop og evaluert i en blindet måte av to observatører uavhengig. Hele Ki-67 fargete snitt ble skannet med Aperio ScanScope CS (Aperio Technologies, Inc, Vista, CA) og et område der flekker var spesielt utbredt (dvs. hot spot) ble identifisert i hvert tumor ved hjelp av en laveffekts-feltet (× 40). 3 høyeffekts feltet (× 400) bilder ble valgt ut for analyse i hver hot spot. Ved hjelp av NIS-Elements en terskel var satt til å definere og måle forholdet mellom Ki-67 positivt farget område til den totale høyeffekts feltområdet. Estimering av apoptotiske celler ble utført ved påvisning av caspase-spaltet produkt av cytokeratin 18 med CytoDEATH (M30). Avhengig av tumorstørrelse, ble 5-10 tilfeldige områder velges, og det gjennomsnittlige apoptotisk celletallet i hvert felt ble målt (x 200). Antistoff rettet mot CD31 ble anvendt for å kvantifisere microvessel tetthet (MVD). Bilder (x 100) ble tatt fra tre områder med høyest tetthet microvessel utseende (dvs. hot spots) og den midlere verdi av CD31-positive tellinger beregnet. For å beregne arealet av CD31-positive strukturer (fartøy område), ble bildene lagres som TIFF-filer. Positiv farging ble kvantifisert ved hjelp av Adobe Photoshop terskel funksjon og kombinert med histogram analyser. Gjennomsnittlig antall positive piksler per svulst delen fra tre hot spots ble registrert.
Western Blot
For kløyvde caspase 3 og CysLT
1R analyser, cellene ble dyrket i 5 dager til 70% samløpet. Bare tilhenger HCT-116, SW-480 og HT-29 celler ble samlet inn for CysLT
1R analyser. For analyse av spaltede caspase 3 vi brukte begge heftende og flytende HCT-116 celler. Cellelysater ble fremstilt og oppløseliggjort i prøvebuffer som tidligere beskrevet [26]. Protein utvinning fra xenopodet svulstvev ble utført ved ultralydbehandling. I korthet tumorvev i 700 mL iskald reduserende ladningsbuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 6 M urea, 10% glycerol, og 2% SDS) som inneholdt proteaseinhibitorer (2 mM Na
3VO
4, 4 ug /ml leupeptin og 60 pg /ml fenylmetylsulfonylfluorid) ble underkastet ultralydbehandling på is i 30 sek. Hel-cellelysater ble sentrifugert ved 3400 ×
g
i 15 minutter ved 4 ° C. Bromfenolblått (0,003%) og merkaptoetanol (5%) ble tilsatt til prøven supernatantene. Proteiner ble separert ved elektroforese på prefabrikerte eventuelle kD ™ SDS-polyakrylamidgeler og elektrooverført på PVDF-membraner. Membranene ble blokkert med enten 5% fettfri tørrmelk eller 5% BSA i 0,05% Tween /PBS i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C. Til slutt ble membranene inkubert med et passende sekundært antistoff konjugert med pepperrot-peroksydase i 1 time ved romtemperatur og detektert med en kjemiluminescens reagens. Immunoblotting resultater ble visualisert med Molecular Imager ChemiDoc XRS System og bilde Lab programvare (Bio-Rad Laboratories).
Proliferation Assay
Celleproliferering ble målt ved hjelp av analyse WST-1 celleproliferasjon i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut i triplikat i flatbunnede 96-brønners plater ved 1500 celler /brønn og dyrket i 24 timer i medium inneholdende 2% FBS. Deretter ble cellene behandlet med CysLT
1R antagonister til forskjellige tidspunkter. Etter inkubasjon med 10 ul WST-1-reagens i 90 minutter, ble absorpsjonen av prøvene målt ved 440 nm ved hjelp av Tecan Infinite M200-plateleser.
Flow Cytometry
cellesyklus og celle døds målingene ble vurdert med flowcytometri. I korthet, HCT-116 celler ble serum-sultet natten over og behandlet med CysLT
1 R-antagonister i friskt medium inneholdende 2% FBS. Etter 24 timer ble adherente og flytende cellene høstet og vasket med PBS. For cellesyklus profiler ble cellene umiddelbart løst i 70% (v /v) etanol, behandlet med 0,1% natrium-citrat og 100 ug /ml RNase A, og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C med 50 ug /ml propidiumjodid. Induksjon av apoptose ble bestemt i levedyktige celler ved hjelp av Annexin V-PE Apoptose Detection Kit ifølge produsentens protokoll. Alle strømningscytometriske målinger ble utført ved hjelp av FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA), og analysene ble utført ved hjelp av FCS Express, versjon 4.0 (De Novo Software).
Heft analysen
HCT-116 celler ble suspendert i medium inneholdende 2% FBS ved en tetthet på 2,0 x 10
5-celler /ml og ble behandlet med eller uten CysLT
1 R-antagonister i 30 min ved 37 ° C før utplating i flat -bottomed 12-brønners plater (Corning, 1 ml /brønn). Celler ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 i 1 time, etterfulgt av tre vaskinger med PBS for å fjerne ufestede celler. Etter fiksering i 4% formaldehyd i 15 minutter, ble cellene vasket to ganger med PBS og farget med krystallfiolett (5 mg /ml i 2% etanol) i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene vasket grundig, og farging ble frigjort ved anvendelse av 2% SDS i PBS. Den fargeintensitet ble kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri ved 550 nm ved hjelp av Tecan Infinite M200-plateleser.
soft agar-analysen
HCT-116-celler ble dyrket i medium inneholdende 2% FBS med eller uten CysLT
1R antagonister. I korthet, ble 1 ml 0,5% agar /brønn (nedre lag) tilsatt til 6-brønns plater og tillatt å størkne i minst 1 time ved romtemperatur. Deretter ble 1,0 x 10
4 celler ble suspendert i 1 ml medium med 0,35% agarose (øverste lag). Forskjellige doser av CysLT
1 R-antagonister ble tilsatt til agarose (toppsjiktet) og agar (bunnlaget) før de ble plassert på brønnene. Ytterligere 2 ml kulturmedium inneholdende CysLT
1 R-antagonister ble plassert over det øverste laget. Mediet ble byttet ut etter 3 dager med eller uten tilsetning av CysLT
1 R-antagonister. Etter 14 dagers inkubering ved 37 ° C, ble koloniene visualisert ved farging med 0,005% krystallfiolett. Bilder ble ervervet ved bruk av ChemiDoc ™ XRS + System og koloniene ble telt ved hjelp ImageJ programvare.
CYSTEINYL- Leukotriene enzymimmunoassay
Cellene ble dyrket i 5 dager til 70-80% samløpet. På dag fire medie ble endret, og samlet inn på dag 5 for cysteinyl leukotrien separasjon av fast-fase ekstraksjon Sep-Pak Vac RC (C18-500 mg) patronene fra Water Corporation (Milford, MA). Cysteinyl leukotrien produksjon ble målt med et enzym immunoassay i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført i Prism programvare (GraphPad, Inc.), og den statistiske betydningen av data var bestemmes som
P
0,05. For sammenligning mellom to grupper, enten en paret eller uparet
t
test (Student
t
test) ble brukt. Enveis eller toveis ANOVA ble brukt til å sammenligne flere grupper. Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM).
Resultater
CysLT
1R antagonister Reduser Xenotransplantat tumorvekst
En tykktarmskreft xenograft modellen ble ansatt for å undersøke effektene av CysLT
1R antagonister om kreft vekst
in vivo
. For å undersøke effekten av CysLT
1R antagonister på startfasen, vaksinert vi hårløse mus med HCT-116 celler forbehandlet med CysLT
1R antagonister. Behandlingen ble påbegynt umiddelbart med enten ZM198,615 eller Montelukast (5 mg /kg /dag) på dagen for inokulering. Musene ble avlivet på dag 21, før tumorvolumene nådde 1 cm
3, i henhold til etisk tillatelse (figur 1A). Som vist i figur 1B, ble svulst forekomst betydelig forsinket i Pre-ZM gruppe (4 svulster) i forhold til DMSO jeg gruppen (12 svulster) på dag 6. Videre Montelukast forbehandling fullstendig hemmet HCT-116 tumor generasjon. Gjennomsnittlig tumorvekt ble betydelig redusert i Pre-ZM gruppe i forhold til DMSO jeg gruppen (0,165 ± 0,048 g
vs
0,372 ± 0,082 g. Figur 1C).
I tillegg vi undersøkte effekten av CysLT
1R antagonister på tumorprogresjon ved inokulering hårløse mus med ikke-forbehandlet HCT-116 celler. Etter skrivbar startfasen (på dag 6), CysLT
1R antagonist behandlinger ble utført i 2 uker (figur 1E). På dag 21 var den gjennomsnittlige tumor størrelsen på ZM198,615 og Montelukast gruppene var betydelig mindre enn svulster i DMSO II gruppen (490,1 ± 66,21 mm
3 og 336,9 ± 55,38 mm
3
vs.
711.6 ± 82,6 mm
3
P
0,05 eller
P
0,001, henholdsvis) (figur 1F). Tilsvarende gjennomsnittlig tumor vekt i ZM198,615 og Montelukast grupper versus DMSO II gruppen var signifikant redusert (figur 1G,. 0,31 ± 0,037 g og 0,22 ± 0,036 g
vs
0,424 ± 0,038 g, henholdsvis
P
0,05). Figur 1D og H er representative svulst bilder tatt fra hver gruppe. I konklusjonen, disse resultatene støtter hypotesen om at CysLT
1R er viktig for tykktarmskreft vekst.
CysLT
1R antagonister redusere spredning og indusere apoptose
Vi neste undersøkte de underliggende mekanismene ved hvilken CysLT
1 R-antagonister som utøves deres hemmende effekt på tumorvekst. HCT-116 tumorsnitt ble farget med spredning markør Ki-67 eller apoptose markør M30 CytoDEATH. Den mest utbredte Ki-67 farget området ble valgt for hver xenograft tumor og tre høye strøm feltet bilder innenfor dette området ble videre analysert. Ki-67 nivå i disse utvalgte områder ble redusert moderat i Pre-ZM gruppe (Pre-ZM
vs
DMSO jeg gruppe;. Figur 2A og B) og statistisk signifikant (
P
0,05) redusert i behandlingsgruppene (ZM198,615
vs
DMSO II gruppe;. Figur 2C og D). Apoptotisk celle nummer litt økt i svulster fra Pre-ZM gruppe (Pre-ZM
vs
DMSO jeg gruppe;. Figur 2E og F) og behandlingsgruppene (ZM198,615 eller Montelukast
vs.
DMSO II gruppe;. Figur 2G og H)
(A og C) representant Ki-67-farget bilder fra parafinsnitt av xenografttumorer (× 400). (B og D) En Ki-67-farget hot spot ble valgt fra hver svulst og 3 separate områder innenfor disse hot spots ble analysert ved høy effekt felt (× 400). Ki-67 positive område fraksjon ble bestemt som forholdet mellom farget område til total høy effekt feltområdet. (E og G) Representative M30 CytoDEATH-farget bilder fra parafinsnitt av xenografttumorer (× 200). Svarte og hvite piler indikerer positivt fargede celler. Eske regionene innenfor hovedfeltene viser positivt fargede celler indikert med de hvite pilene på høyere forstørrelse (× 400). (F og H) Gjennomsnittlig apoptotisk celle nummer per felt ble bestemt av M30- positive tellinger (svarte piler) i median-sized xenograft tumor seksjoner tatt fra den midtre delen. De kvantitative data som vises er gjennomsnitt ± SEM. *
P
. 0,05 av Student
t
test
Effektene av CysLT
1R antagonister på tumor vaskularisering ble studert ved farging for CD31 , en endotelcelle-spesifikt antigen. Vi observerte en litt redusert fartøy nummer i avsnittene tatt fra Pre-ZM gruppe i forhold til DMSO jeg gruppen (46,1 ± 6,7
vs
56,0 ± 7,9;. Figur 3A og B). Vaskulær tall er ikke den eneste parameter for å indikere tilstrekkelig tumorblodtilførsel; Fartøyet område er også en kritisk determinant av tumorblodstrøm [33]. I kreft seksjoner fra Pre-ZM-gruppen, la vi merke til at fartøyene dukket opp mindre og tynnere, og hadde mindre forgrening. Tumorkarene i DMSO jeg gruppen dukket opp mer moden med lumen, tykke vegger, og sterk CD31 flekker langs sine lengder. Vi målte derfor CD31-positive flekker områder. Som vist i figur 3C, svulster fra Pre-ZM198,615 gruppen hadde en statistisk signifikant (
P
0,05) reduserte bety av den CD31-positive område i forhold til tumorer i DMSO I gruppen (2596 ± 121,4 piksler
vs.
3900 ± 522,3 bildepunkter, henholdsvis), som tilsvarer en 33% reduksjon. Det var ingen statistisk signifikante forskjeller i gjennomsnittlig antall fartøy og vaskulær størrelse blant mus i behandlingsgruppene (DMSO II
vs
ZM198,615 eller Montelukast;. Figur 3D, E og F). Den reduserte vaskulære størrelse i tumorsnitt tatt fra Pre-ZM gruppe indikerte at CysLT
1R antagonist behandling i 21 dager kan hemme svulst vascularization og har en mer uttalt effekt på tumorprogresjon.
(A og D) representant CD31 farget bilder (x 100). (B og E) Fartøy tetthet ble bestemt med CD31-positive teller i tre forskjellige felt (hot spots). (C og F) Kvantitativ analyse av CD31-positive områder ved hjelp av Adobe Photoshop. De kvantitative data som vises er gjennomsnitt ± SEM. *
P
0,05 av Student
t
test
Deretter uttrykket nivåer av utvalgte proteiner involvert i cellesyklus, apoptose, og angiogenese var. undersøkt. p21
WAF /Cip1, en potensiell cellesyklus-hemmer, viste seg å være betydelig oppregulert i tumorprøver fra Pre-ZM gruppe i forhold til DMSO jeg gruppen (
P
0,01; Figur 4A) . Vi har også observert moderat økte nivåer av kløyvde caspase 3 fragmenter (figur 4B) og betydelig redusert uttrykk nivåer av VEGF (
P
0,05, figur 4C) i svulster fra Pre-ZM gruppe i forhold til DMSO jeg gruppe. ble gjort tilsvarende analyse for behandlingsgruppene (ZM198,615 eller Montelukast
vs.
DMSO II). Betydelig økt uttrykk nivåer av p21
WAF /Cip1 (
P
0,01; Figur 3D) og redusert uttrykk nivåer av VEGF (
P
0,05, figur 4D) kan være observert for Montelukast-behandlede gruppen, men ikke for den ZM198,615-behandlede gruppe sammenlignet med DMSO II gruppen. Økte nivåer av kløyvde caspase 3 fragmenter ble også observert i behandlingsgruppene (ZM198,615 eller Montelukast
vs.
DMSO II) (figur 4E).
tumorprøver (tre eller fire svulster fra hver gruppe) ble underkastet Western blot-analyse. Membraner ble analysert for (A og D) p21
WAF /Cip1; (B og E) spaltet caspase 3; og (C og D) VEGF. Data ble normalisert på basis av p-aktin nivåer. Densitometrisk analyse av protein uttrykk representerer middelverdien ± SEM. *
P
0,05, **
P
. 0,01 av Student
t
test
CysLT
1R antagonister Reduser spredning og indusere G
1 arrest av HCT-116 celler
Fordi vi observert at CysLT
1R antagonist behandling kan hemme tumorvekst
in vivo
dels ved å indusere cellesyklus arrest , var vi neste interessert i å bekrefte dette funnet
in vitro
. For å undersøke om CysLT
1R antagonister hatt noen direkte effekt på tykktarmskreft celleproliferasjon ble WST-1 celleproliferasjonsanalyse utført. Behandling med økende konsentrasjoner av ZM198,615 forårsaket inhibering av HCT-116 celle-proliferasjon på en doseavhengig måte. På dag 4, veksten av celler behandlet med 12,5, 25 og 50 uM ZM198,615 ble redusert med 11%, 31% og 88% henholdsvis, i forhold til DMSO-behandlede kontrollceller (figur 5A). Når de samme konsentrasjoner av montelukast som ZM198,615 ble anvendt, ble det observert en enda sterkere virkning på hemming av cellevekst; 35%, 88% og 100% for 12.5, 25, og 50 uM Montelukast, henholdsvis, i forhold til DMSO-behandlede kontrollceller (figur 5B). Vi neste undersøkt om CysLT
1R antagonist-mediert veksthemming av HCT-116 celler skyldes cellesyklus intervensjon. Vi fant ut at Montelukast indusert cellesyklus arrest av HCT-116 celler i 24 timer på G
1 fase. Som vist i figur 5C, høyre panel, 81% og 87% av celler behandlet med 12,5 og 25 uM Montelukast, henholdsvis, var i G
1 fase sammenlignet med 64% for celler behandlet med DMSO.
