Abstract
Bakgrunn
Otto Warburg observert at kreftceller er ofte preget av intens glykolyse i nærvær av oksygen og en samtidig reduksjon i mitokondriell respirasjon. Forskning har hovedsakelig fokusert på en mulig sammenheng mellom økt glykolyse og svulstutvikling, mens redusert respirasjon har i stor grad blitt forlatt uten tilsyn. Derfor er en kausal sammenheng mellom nedsatt respirasjon og tumorigenesis har ikke blitt vist.
metodikk /hovedfunnene
For dette formålet, kolonier av
Saccharomyces cerevisiae
, som er egnet for manipulering av mitokondriell respirasjon og viser mitokondrier-mediert celledød, ble anvendt som en modell. Undertrykkelse av åndedrett samt ROS-scavenging via glutation hemmet apoptose og overdro en overlevelsesfordel under seeding og tidlig utvikling av dette raskt voksende solid cellepopulasjon. I kontrast til forbedring av åndedrett utløst celledød
Konklusjon /Betydning
Dermed blir Warburg effekten direkte bidra til igangsetting av kreft formasjon -. Ikke bare ved økt glykolyse – men også via redusert åndedrett i nærvær av oksygen, som undertrykker apoptose
Citation. Ruckenstuhl C, Büttner S, Carmona-Gutierrez D, Eisenberg T, Kroemer G, Sigrist SJ, et al. (2009) Warburg Effect Undertrykker Oksidativt stress indusert apoptose i en gjær modell for kreft. PLoS ONE 4 (2): e4592. doi: 10,1371 /journal.pone.0004592
Redaktør: Julian Rutherford, Newcastle University, Storbritannia
mottatt: 26 august 2008; Godkjent: 09.01.2009; Publisert: 25 februar 2009
Copyright: © 2009 Ruckenstuhl et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet FWF-FSP S93 til FM og gi EU STREP 511983 (TransDeath) til KU. F .. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i 1920 Otto Warburg beskrev den vanligste biokjemiske fenotype av tumorceller: selv i nærvær av et normalt oksygennivå, er svært forhøyet og ledsaget av høy laktat produksjon samt drastisk redusert mitokondrie glykolyse respirasjon [1] – [3]. Selv om dette fenotype er grunnlaget for kreftdiagnostikk overvåking glukose forbruk [4], utfordrende spørsmål forblir unnvikende: For eksempel hvordan kreftceller vedta denne fenotype ved ulike mekanismer [5], [6], om begge fenomener (høy glykolyse og redusert respirasjon) er årsaksmessig koblet [7], [8], og endelig deres spesifikke bidrag til tumorgenese [7], [9] -. [11]
raskt prolifererende gjær viser lignende gjærings verdier som tumorceller [12], således tillater å studere sammenhengen mellom energistoffskiftet og maksimal spredning. Spesielt, programmert celledød, som beskytter mot tumorgenese, er nært knyttet til mitokondrielle prosesser i pattedyrceller. Gjærceller kan også gjennomgå programmert celledød [13], [14] i en mitokondriene avhengig måte [15], [16], inkludert cytokrom c og AIF frigivelse, kanalåpningen ved human Bax uttrykk [17] – [19], depolarisering av mitokondriell membranpotensiale [20], og mitokondrie fragmentering [21].
Den spesielle evne Crabtree-positive gjærsopper som
Saccharomyces cerevisiae
for å slå av og på åndedrett i takt med endringene i karbonkilden, og muligheten for å produsere levedyktige stammer som mangler mitokondrie DNA (rho
0), at den streng genetiske evaluering av rollen til mitokondrier i løpet av celledød [15], [22]. Her vurderer vi den mulige sammenhengen mellom undertrykt celledød og hemmet oksidativ fosforylering, i kolonier vokst fra en enkelt celle, ligner tumorvekst.
Resultater og Diskusjon
I en maksimal voksende solid cellepopulasjonen forbedrer åndedrett ROS produksjon og apoptose
S. cervevisiae
celler arve en unik glukose undertrykkelse system som på vekst på glukose drastisk undertrykker åndedrett uavhengig av oksygen tilgjengelighet [23]. Modellering tumorvekst, vi testet om trykt respirasjon påvirkninger celle-overlevelse under vekst av cellepopulasjoner som starter fra en enkelt celle på glukose medier. Tre forskjellige stammer ute av stand til åndedrett sammen med isogen villtype
S. cerevisiae
ble brukt i en koloni assay hvor isolerte kolonier ble dyrket fra enkeltceller. Celler ble fjernet fra kolonier i løpet av tidlig utvikling av en rho
0 påkjenning koloni oppviser betydelig økt overlevelse sammenlignet med villtypestammen (Fig. 1A). Konsekvent, generering av reaktive oksygenforbindelser (ROS), en prosess tett koblet til og ofte utløsende for programmert celledød, er redusert (Fig. 1B).
(A) isolert kolonier ble dyrket fra enkeltceller, manipulert på agar plater. Klonogene analyse av celler fjernet fra kolonier av vill-type belastning, rho
0 (ingen mitokondrie-DNA) og to enkle gen-sletting stammer (
mgm1 Hotell og
oxa1
), dyrket på SCGlu. Etter 3 dager 500 celler av hele kolonier, etter 5 dager 500 celler i det sentrale koloni-region ble analysert (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 2). Statistisk signifikans av p 0,006 sammenkolonidannende enheter (CFU) av mutantstammer til villtype-stammen ved respektive tidspunkter. (B) Celler fra hele kolonien (3 dager), så vel som fra det sentrale område (5 dager) ble farget for reaktive oksygenarter (ROS) med dihydroethidium og analysert ved FACSAria strømningscytometri (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 2; ** p 0,01, *** p 0,001 forhold til sletting stammer på respektive tidspunkter). (C) Omtrent 50 (2 dager) og 10 (3 dager) kolonier dyrket på SCGlu Platene ble vasket av og klonogene ble utført med de innsamlede cellene (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 5; ** p 0,001). (D) Ca. 50 kolonier dyrket på SCGlu plater i 2 dager ble farget for fosfatidylserin utredning (annv) og DNA brudd (TUNEL) og analysert ved FACSAria flowcytometri (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3; ** p 0,01, *** p 0,001). (E) Fluorescensmikroskopi fra sentrale og ytre område på 5 dager gamle villtype koloni celler, som bærer plasmid DsRed-MLS.
For å utelukke rho
0 strekk spesifikke effekter ikke regnskap for respirasjon mangler to andre respirasjon svekket stammer ble undersøkt. Enkelt genet sletting stammer av begge,
MGM1 plakater (homolog til menneskelig
OPA1
) – en GTPase ligger i mitokondrie intermembrane plass [24] – og
OXA1 plakater (en insertase av den indre mitokondrielle membranen – svært konservert fra prokaryoter til pattedyr [25], [26]) oppførte seg som den (villtype) rho
0 belastning. Etter 3 og 5 dager,
mgm1
samt
oxa1
slettede cellene hentes fra hele kolonien (3 dager) eller den sentrale regionen (5 dager), og dermed hovedsakelig eldre celler, viste betydelig økt overlevelse (fig. 1A), så vel som inhibering av ROS generasjon sammenlignet med prøver av villtypestamme (fig. 1B). Av notatet, i motsetning til andre åndedrett mangel mutante stammer (inkludert rho
0 og Δ
mgm1
) den Δ
oxa1
belastning viste samme vekstrater som vill-type belastning i flytende kulturer og i løpet av kolonivekst, henholdsvis (fig. 2A og B).
(A) vekst~~POS=TRUNC kurver~~POS=HEADCOMP av en
oxa1
belastning delesjon og det tilsvarende villtypestamme. Eksperimentet ble utført i tre eksemplarer. Y-aksen er skalert logaritmisk. (B) Størrelse på isolerte kolonier av de angitte stammer dyrket i 3 og 5 dager på SCGlu plater, henholdsvis. Diametere ble evaluert ved å behandle bildene med Metamorph Imaging (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 2).
I en komplementær tilnærming, seeded kolonier (10 og 50 per plate) av villtype og Δ
oxa1
stammer henholdsvis ble vasket fra SCGlu plater etter 2 og 3 dager og klonogene overlevelse ble evaluert. Igjen belastningen ute av stand til åndedrett viste bedre overlevelse enn det respirerende villtypestamme (Fig. 1C). I tillegg overlevelsen fordel av Δ
oxa1
belastning oppsto allerede etter 2 dager, noe som er i god overensstemmelse med tidligere data som vill-type kolonier dyrket på vanlig glukose media der vist til å forlate den logaritmiske vekstfase etter ca 36 timer [27].
for å evaluere den induserte type celledød vi screenet for apoptotiske markører bruker AnnexinV og tunel analyser. Apoptose ble signifikant redusert i en åndedrett mangelfull
oxa1
delesjonsmutant i forhold til villtype kontroll (Fig. 1D). Det bør bemerkes at celleveggen fordøyelse av villtypeceller var mindre effektiv. Derfor lavere mengder av positivt fargede celler ble erholdt sammenlignet med den observerte celleoverlevelse i klonogene analyser etter 2 dager. Dette betyr at den observerte undertrykkelse av apoptotiske markører i
oxa1
slettet belastning er trolig enda høyere enn vist i 1D. I denne linjen når de ble behandlet med 30% mer enzymblanding for å forbedre celleveggen fordøyelse, viste ca. 37% av villtype-celler en TUNEL positiv farging (data ikke vist). Mitochondrial fragmentering er en forutsetning for apoptose i gjær. Derfor, mitokondriell morfologi av celler fra vill-type kolonier (og ikke for rho
0-cellene, fordi de mangler åndedrett) ble overvåket ved bruk av DsRed bærer en mitokondriell lokalisering sekvens. Etter 5 dager ble celler fra den sentrale regionen (således eldre celler) viste en drastisk øket fragmentering av mitokondrier og mer punkterte strukturer, mens ferskt næres yngre celler fra vises den ytre kanten en normal rørformet struktur av mitochondria (figur 1E).
Vi konkluderer med at oppheving av respirasjon undertrykker apoptose og ROS produksjon i et sterkt voksende cellepopulasjon på faste medier.
Tvungen forbedring av åndedrett utløser celledød under seeding av en cellepopulasjon
Novel kreft behandling er basert på den antagelse at rekonstituering eller tvunget forbedring av respirasjon innenfor faste tumorer kan føre til vekst-inhibering og celledød [10], [28], [29]. For å teste om genetisk håndheving av respirasjon påvirkninger celledød under seeding av en cellepopulasjon (som er den kronologiske trinnet før en koloni etablerer), media-shift eksperimenter med glukose (SCGlu), galaktose (SCGal) og glyserol (SCGly) media som alternerende eneste karbonkilder ble utført. Derved blir åndedrett enten undertrykkes (SCGlu), samvirkende med aktiv gjæring (SCGal), eller det representerer den eksklusive energikilden (SCGly). Når stasjonære (ikke-prolifererende) flytende populasjoner av gjær vill-type-celler dyrket på SCGlu ble flyttet til fast SCGal eller SCGly, bare 65% eller 44%, henholdsvis, av de kimsatte celler var i stand til å danne en koloni (fig. 3A). Ved hjelp av svært proliferative kulturer av villtype BY4741 belastningsskader (fra den eksponentielle vekstfasen) denne effekten var enda mer uttalt med nesten ingen overlevelse på både luft media (Fig. 3A). Sammenlignbare resultater ble oppnådd med høyt proliferative kulturer av andre villtype-stammer slik som AH22, TB50, og DBY746 (data ikke vist) under våre betingelser. Selv en overføring i det samme høye luft media (fra flytende til fast SCGly SCGly) resulterte i en redusert kolonidannelse av ~70% (sammenlignet med en overgang fra flytende til fast SCGly SCGlu), og understreker at spesielt initiering av kolonivekst er negativt påvirkes av økt respirasjon (fig. 3B).
(A) klonogene analyse av kulturer pre-dyrket i flytende SCGlu. 500 celler ble sådd ut på SCGlu, SCGal, og SCGly agar plater, henholdsvis (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3; *** p 0,001). (B) klonogene analyse av kulturer forhånds dyrket i flytende SCGly. 500 celler ble sådd ut på SCGly og SCGlu medie plater, henholdsvis (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 2; ** p 0,01). (C) Celler fra hele kolonien (3 dager), så vel som fra det sentrale område (5 dager) ble farget for reaktive oksygenarter (ROS) med dihydroethidium (DHE). Verdier av relative fluorescerende enheter (RFU) ble normalisert til villtype-stamme verdier (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 2; ** p 0,01, *** p 0,001). (D) Størrelse på isolerte villtype kolonier dyrket på SCGlu og SCGal medie plater ble overvåket ved å ta bilder på angitte tidspunkter. Diametere ble evaluert ved å behandle bildene med Metamorph Imaging (hvite linjen representerer en cm) (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3; * p 0,05, ** p 0,01).
Tvungen forbedring av åndedrett undertrykker vekst og øker ROS produksjon av kolonier
de observerte effektene av undertrykt koloni seeding når respirasjon er høy ble også reflektert i den videre veksten av cellen befolkning: Etter to dager med vekst på fast SCGal, koloniene viste bare halvparten av størrelsen på de som var dyrket på fast SCGlu, skjønt ytterligere størrelsesøkning (etter den innledende forsinkelse) er sammenlignbare (fig. 3D). Den innledende forsinkelse kan være forbundet med en umiddelbar ROS briste, som ytterligere understreket ved drastisk forhøyet ROS-nivåer i kolonier dyrket på SCGal eller SCGly (fig. 3C, også se nedenfor og fig. 4C).
(A) omtrent 100 kolonier ble dyrket i 36 timer på SCGlu plater med eller uten 5 mM GSH, vaskes av og klonogene analyser ble utført med de oppsamlede celler (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3; ** p 0,01) . I tillegg like mengder celler ble farget for reaktive oksygenforbindelser (ROS) med dihydroethidium (DHE) og kvantifisert ved hjelp av en fluorescens mikroplateleser (GENIOS-Pro). Verdier av relative fluorescerende enheter (RFU) vises (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 3; ** p 0,01) (B). (C) klonogene analyse av kulturer forhånds dyrket i flytende SCGlu. 500 celler ble sådd ut på SCGlu, SCGal, eller SCGly agar-plater, henholdsvis, med eller uten 1 mM GSH (gjennomsnitt ± SEM,
n
= 2; *** p 0,001).
Dermed etablere et sterkt voksende solid cellepopulasjon krever åndedrett for å bli undertrykt.
respirasjon mediert celledød i kolonier og nylig seeded celler er effektivt undertrykt via ROS scavenging
for ytterligere å bevise at respirasjon og medfølgende ROS produksjon er en viktig årsak til apoptose i løpet av koloni utvikling vi brukte redusert glutation (GSH) som et skylle reagens: Kolonier av vill type og
oxa1
delesjonsstammer ble dyrket på agarplater med SCGlu eller uten GSH og celle overlevelse ble bestemt etter 36 timer i en klonogene analysen. Mens
oxa1
belastning sletting viste ingen endret overlevelse ved tilsetning av GSH, overlevelse av vill type celler ble drastisk forbedret (Fig 4A). Dette ble fulgt av en betydelig redusert ROS-nivåer (figur 4B). Interessant, strekker den fermentative vekstfase ved å doble glukosekonsentrasjon i medie platene førte til svakt forbedret celleoverlevelse (data ikke vist).
I tillegg er effekten av glutation som ROS scavenger ble testet i et skift assay, hvor svært proliferative villtype celler pregrown i likvide SCGlu media ble sådd på SCGal og SCGly plater med eller uten GSH. Påfallende, overlevelse ble forbedret til 50% og 55%, sammenlignet til 1% overlevelse på plater uten GSH (fig 4C.). En lignende forskyvning av stasjonære celler ga en økt overlevelse fra 50% til 60% til 75% og 77%, henholdsvis, på GSH inneholdende plater (data ikke vist). Vi konkluderer med at scavenging ROS via glutation forbedrer celle overlevelse under koloni utvikling så vel som under seeding på høyt luftveis medier. Intriguingly, har det nylig blitt rapportert at i kreftceller og i nevroner (som også viser Warburg-effekten), cytokrom
c
reduseres og holdes inaktivt av GSH [30].
Hittil , forskning på Warburg effekten har hovedsakelig fokusert på høy glycolytic flux mens den medfølgende undertrykkelse av mitokondriell respirasjon ble ofte stående uten tilsyn [8], [9]. Våre data viser at respirasjonen utløser apoptose under seeding og utvikling av en cellepopulasjon, som gir direkte eksperimentelle bevis til støtte for Warburg hypotesen ved oppstart av tumorigenesis. Den sterkt reduserte luftkapasitet kan være avgjørende for tumor malignitet [12] og for resistens mot uunngåelig varierende oksygenering i tumorer [31], [32]. Interessant nok er det blitt vist at gjær rho
0 stammer utviser økt motstandsevne mot visse ytre apoptotiske stimuli slik som eddiksyre, noe som utløser død via den mitokondrielle veien [15], [17]. En tilsvarende motstand mot celledød kan også spille en rolle for tumorceller i et surt omgivelsene. Vi spekulerer i at omprogrammering av kreftceller følger en gammel mekanisme til stede i
S. cerevisiae
villtype kolonier: høy glykolyse i nærvær av oksygen
Materialer og metoder
Stammer og medie
Forsøk ble utført i BY4741 (Mata
his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
) og respektive null mutanter av
mgm1 Hotell og
oxa1
henholdsvis hentet fra Euroscarf. Strain BY4741 rho
0 ble konstruert av flere runder med ETIDIUMBROMID behandling som tidligere beskrevet [33]. For å utføre fluorescens mikroskopi av mitokondrie strukturer plasmidet DsRed-MLS (DsRed bærer en mitokondriell lokalisering sekvens) [34] ble transformert i stamme BY4741. For overlevelse plette YEPD (1% gjærekstrakt, 2% pepton og 2% glukose) media ble supplert med 2% agar. For alle analyser, ble stammene dyrket i SC-medium inneholdende 0,17% gjær-nitrogenbase (Difco), 0,5% (NH
4)
2SO
4, og 30 mg /l av alle aminosyrer (bortsett fra 80 mg /l histidin, 200 mg /l leucin (uten leucin ved arbeid med plasmid DsRed-MLS)), 30 mg /l adenin, og 320 mg /l uracil med 2% glukose (SCGlu), 2% galaktose (SCGal), og 3% glycerol (SCGly), henholdsvis, supplert med 2% agar, der det er nødvendig. Redusert glutation (GSH, Sigma-Aldrich) ble tilsatt i konsentrasjoner på 1 eller 5 mm, der det trengs
Isolert monocolony analysen
Seks centimeter petriskåler, levert med 13 ml solid SC media (. med eller uten leucin) ble anvendt. Enkeltceller av 16 til 20 timer over natten kulturer ble plassert på faste SC medie plater ved hjelp av en micromanipulator (Series 200, Sanger Instruments). For å minimere dehydrering av de faste plater, ble inkubering utført ved 28 ° C i en lukket, fuktet avl kammer (KBF115, Binder). For diameter besluttsomhet, ble bildene tatt på de angitte tidspunktene (Mikrobiologi-Colony-Counter, Lemnatec) og behandlet ved hjelp av Metamorph bildebehandling.
Survival plating, media-shift eksperimenter, og vekstkurver
for å bestemme overlevelse av celler i kolonien, enten hele isolerte kolonier (i tilfelle av 3 dager) og prøver fra de sentrale delene av de isolerte kolonier (i tilfelle av 5 dager) ble fjernet ved angitte tidspunkter, eller SCGlu plater med omtrent 100 kolonier (etter 36 timer), 50 kolonier (etter 2 dager) eller 10 kolonier (etter 3 dager) ble vasket av. Celletall ble bestemt ved en casy celletelleinnretning (Scharfe Systems) og 500-celler ble sådd ut på YEPD-agarplater. Kolonidannende enheter (cfu) ble bestemt etter 2 eller 3 dager (i tilfelle av respirasjon mangelfulle stammer rho
0 og Δ
mgm1
) med en Mikrobiologi-Colony-Counter (Lemnatec) og behandlet ved hjelp SAWmicrobio 3.1.
for media-skiftforsøk kulturer ble dyrket i SCGlu og SCGly flytende medier til logaritmisk (6 timer) og stasjonær (24 h) fase, henholdsvis, og 500-celler ble sådd ut på respektive faste medier plater så vel som på SCGlu plater i alle fall.
for vurdering av vekstrater i flytende medier, natten kulturer ble dyrket i SCGlu. Kulturer ble inokulert til 5 × 10
5 celler i SCGlu og cellevekst ble målt over 12 timer ved hjelp av en casy celleteller enhet.
Farging for apoptotiske markører og fluorescens mikros
Farging av reaktive oksygenarter (ROS) med dihydroethidium (DHE), Annexin V-farging, og TUNEL-farging ble utført som beskrevet tidligere [34]. I hver prøve 30.000 celler ble evaluert ved hjelp av flowcytometri (FACS-Aria, BD) og behandlet ved hjelp av FACSDiva programvare. Alternativt like mengder DHE fargede celler ble målt i en mikro fluorescens leser (GENIOS-Pro, Tecan).
Mitokondrie morfologi ble inspisert av fluorescens mikroskopi ved hjelp av en DsRed filter på en Zeiss Axioskop mikroskop. Celler av den sentrale, så vel som det ytre område av isolerte monocolonies av villtype-celler som plasmid DsRed-MLS ble overvåket etter 5 dager.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved anvendelse av studenter T-test (ensidige, uparet), med * p 0,05, ** p 0,01 og *** p. 0,001, henholdsvis
takk
Vi takker Ulrike Potocnik for teknisk assistanse.
