Abstract
Bakgrunn
Magekreft er en av de vanligste kreftformene i verden. Den «økonomisk utviklede land» livsstil, inkludert kosthold, utgjør en risikofaktor favorisere denne kreftformen. Diet modulasjon kan senke fordøyelseskreftforekomst. Blant lovende mat komponenter, ble meieri propionsyrebakteriene vist å utløse apoptose av menneskelige tykktarmskreftceller, via utgivelsen av kortkjedede fettsyrer acetat og propionate.
metodikk /hovedfunnene
En gjæret melk utelukkende gjæret av
P. freudenreichii
, ble nylig designet. I dette arbeidet ble det pro-apoptotiske potensialet i denne nye gjæret melk demonstrert på HGT-en human mage kreftceller. Fermentert melk supernatant indusert typiske trekk ved apoptose inkludert kromatin kondens, dannelse av apoptotiske legemer, ladde DNA, cellesyklus arrest og fremveksten av en subG1 befolkning, fosfatidylserin eksponering på plasmamembranen ytre pakningsvedlegget reaktivt oksygen arter opphopning, mitokondrie transmembrane potensial avbrudd, caspase aktivering og cytokrom c utgivelse. Bemerkelsesverdig, denne nye gjæret melk som inneholder
P. freudenreichii
forbedret cytotoksisitet av camptothecin, et stoff som brukes i magekreft kjemoterapi.
Konklusjon /Betydning
En slik ny probiotisk gjæret melk kan derfor være nyttig som en del av et forebyggende diett utviklet for å forebygge magekreft og /eller som et supplement til mat for å forsterke kreft terapeutiske behandlinger
Citation. Cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, jan G (2012) Melk Fermentert av
Propionibacterium freudenreichii
induserer apoptose av HGT-1 Menneskelig Gastric kreftceller. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10,1371 /journal.pone.0031892
Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 15 november 2011; Akseptert: 19. januar 2012; Publisert: 19 mars 2012
Copyright: © 2012 Cousin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Conseil Regional de Bretagne gjennom CBB Développement oppfordring til prosjekter og ved Centre National Interprofessionnel de l’économie LAITIERE (CNIEL) gjennom av Vitenskapskomiteen Syndifrais oppfordring til prosjekter. Forskning i IRSET gruppen ble støttet med tilskudd fra Ligue Nationale Contre le Cancer (Côte d’Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vendée og Sarthe komiteer), INSERM, Universitetet i Rennes 1 og Region Bretagne. FJC mottatt tilskudd fra CNIEL (doc). SJL ble støttet av foreningen pour la Recherche sur le Cancer (doc). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kosthold modulerer risikoen for å utvikle magekreft
kreft er den viktigste dødsårsaken i økonomisk utviklede land som følge av kreft-assosiert livsstilsvalg inkludert røyking, fysisk inaktivitet, og «vestlige» diett [ ,,,0],1]. Faktisk er den rollen diett i kreftutvikling sterkt støttet av epidemiologiske studier, særlig om kreft i fordøyelseskanalen. Magekreft (GC) representerer den tredje typen dødelige kreft for menn i verden. I 2008 ble 640.600 tilfeller av GC anslått, forårsaker 464.400 dødsfall på verdensbasis [1]. Denne sykdommen er spesielt hyppig i Øst-Asia, og i Sentral- og Øst-Europa. De viktigste etiologiske faktorer involvert i magekreftutvikling er kosthold og
Helicobacter pylori
infeksjon. Betydelige bevis, hovedsakelig fra case-control studier tyder på at risikoen for å pådra GC økes ved høyt inntak av saltet, syltet eller røkt tradisjonelt matvarer, samt tørket fisk og kjøtt. Tvert imot, fibre, friske grønnsaker og frukt, kanskje på grunn av sitt innhold av vitamin C, ble funnet å være omvendt assosiert med GC risiko [2], [3]. Virkningen av naturlig /mat komponenter på kreftutvikling av magen har dermed blitt undersøkt i løpet av de siste tiårene [4] – [6]. Blant disse, probiotika og deres evne til å hemme utvikling av kreft tilt vitenskapelig interesse [7], [8]. En probiotisk er generelt definert som «en levende mikroorganisme som, når de administreres i tilstrekkelige mengder, ensidige helse fordel for verten» [9]. Mens noen mikroorganismer som
H. pylori
kan favorisere GC, mens andre kan ha en gunstig effekt ved å forebygge fordøyelses kreft. Spesielt kan utvalgte stammer av probiotiske bakterier begrense kreftutvikling i dyremodeller av kreftutvikling [10]. Dette ble spesielt dokumentert for tykktarmskreft, mens mindre er kjent om mulige effekter av probiotika på GC. En mulig mekanistisk forklaring på en slik beskyttende effekt er
in situ
utgivelsen av anti-kreftfremkallende metabolitter som kort kjetting fettsyrer (SCFAs).
Short fettsyrer indusere apoptose av kreftceller
SCFA, inkludert acetat, propionat og butyrat, er viktige anioner av tarminnholdet og deres konsentrasjon kan moduleres av dietten. De ble vist seg å spille en nøkkelrolle i viktige fysiologiske funksjoner, inkludert modulering av fordøyelses epitelceller spredning /apoptose balanse. Dette innebærer SCFA-mediert cellesyklus-stans, histon deacetylase inhibitor og apoptose stimulering i transformerte celler, men også stimuleringen av differensiering i friske celler [11], [12]. Det har også blitt rapportert at SCFAs butyrat og propionat både indusere apoptose i humane mage-carcinom-cellelinjer [13] – [15]. Apoptose er en naturlig fysiologisk prosess slik celle nummer regulering og utgjør et mål for anti-kreft kjemoterapi [16]. Apoptose tillater uttømming av kreftceller i en «ren» måte. Kreftceller fragmentere i en koordinert kjedereaksjon, og residuet tas opp i tilstøtende vev og immunsystemet [17], [18]. To hoved apoptotiske reaksjonsveier har blitt beskrevet: den ekstrinsiske reaksjonsveien, som blir mediert av aktivering av døds reseptorer og kaspase 8, og den indre vei, der mitokondrier og caspase 9 er involvert [16]. Vanligvis, i kreftceller, er det apoptotisk funksjon mangler, noe som kan forklare deres vedvarende spredning og dermed dannelsen av tumorer. Evnen til å indusere apoptose i cancerceller er således anerkjent for sin terapeutiske potensial [16]. Siden meieri propionsyrebakteriene er i stand til å produsere gunstige pro-apoptotiske SCFAs, kan de vise seg nyttig i kreft forebygging eller behandling.
Propionibacterium freudenreichii
kan favorisere apoptotisk utarming av fordøyelseskreftceller
Dette probiotiske melke propionibacterium ble vist å indusere celledød forskjellige menneskelige tykktarmskreft cellelinjer gjennom apoptose induksjon, i co-kulturer [19]. De aktive forbindelser, utskilt i mediet, utløser den indre mitokondrie-apoptotiske reaksjonsvei i dyrkede humane kolorektale cancerceller. Spesielt SCFAs acetat og propionate utgitt av
P. freudenreichii
indusere apoptose ved å virke på den mitokondrielle adenin-nukleotid Translocator, forårsaker depolarisering mitokondrier og permeabilisation, lekkasje av cytokrom c og caspaseaktivering [19], [20]. Imidlertid propionibacterial supernatanter er fremdeles mer pro-apoptotiske enn SCFAs acetat og propionat, anvendes i de konsentrasjoner målt i supernatanter, noe som tyder på at andre forbindelser kan være involvert i denne effekten. Valgte stammer av
P. freudenreichii
forblir levende og metabolsk aktiv i tarmen hos mennesker og av normalflora-forbundet rotter der de produserer SCFAs [21], [22]. Følgelig ble de vist seg å øke apoptose i transform kolon epitelceller slike rotter som ble matet med den kreftfremkallende 1,2-dimetylhydrazin (DMH), men ikke i kontroll sunt [23]. Propionsyrebakterier kunne utgjøre probiotika favoriserer profylakse tykktarmskreft, forutsatt at de når sine mål i live og metabolsk aktiv. I denne sammenheng vektoren, eller probiotiske leveringsmiddelet, ble vist å bestemme overlevelse propionsyrebakterier og aktivitet [21], [24], [25]. Komplekse meieriprodukter som yoghurt og ost, spesielt beskytte propionsyrebakterier fra stress, men inneholder en kompleks blanding av bakterier. Det er derfor ikke mulig å tilskrive den reelle effekten til en bestemt belastning.
En gjæret melk ble vurdert som propionsyrekulturen levering kjøretøy i denne sammenheng
I denne studien brukte vi en ny mat-grade gjæret melk inneholder bare
P. freudenreichii
som et eget mikroflora. Da dette produkt inneholder både levende propionsyrebakterier og deres aktive metabolitter, skal det bringe dem i kontakt med mageslimhinne ved inntak. Dette gjæret melk ble undersøkt med hensyn til HGT-en human magekreftceller apoptose induksjon. Faktisk er propionsyrebakterier kjent for å drepe humane tykktarmskreftceller, men deres effekt på mage kreftceller er ukjent. Den fermenterte melk drepte HGT-1-celler i en tids- og doseavhengig måte. Typiske trekk ved apoptose prosessen ble observert, inkludert levedyktighet drop, kromatin kondens, apoptotiske legemer «formasjon, DNA ladde, ROS produksjon, mitokondriemembranen potensial forstyrrelse, caspaseaktivering, cellesyklus arrest og fremveksten av en subG1 befolkning.
Resultater
P. freudenreichii
gjæret melk dreper menneskelige mage og tykktarm kreft celler
P. freudenreichii
ITG P9 vokste i 72 timer ved 30 ° C i supplert melk og supplert melk ultra å nå finalen befolkning på 9,43 log
10 kolonidannende enheter (cfu) /ml og 9,35 log
10 cfu /ml, respektivt. De SCFA konsentrasjonene var 26,21 mM acetat og 54,47 mM propionat (2,08 propionate /acetat forhold) i melken gjæret supernatanten mens de var 24,00 mM og 53,32 mm (2,22 ratio) i gjæret melk ultra supernatant. Disse forhold var forventet for propionsyrebakterier, som generelt produserer dobbelt så mye propionat som acetat [26]. Tolv andre mat-grade meieri propionsyrebakterier stammene ble også testet (se tabell S1 og figur S1). Ved hjelp av disse stammene, ble tolv fermentert melk oppnådd. Propionate konsentrasjoner varierte fra 36 til 67 mm og propionsyrebakterier populasjoner 9,0 til 9,7 log
10 cfu /ml, for den mindre og for den mest effektive belastning, henholdsvis.
Den cytotoksiske potensialet supernatanter fremstilt av melk eller melk ultra, både gjæret av
P. freudenreichii
ITG P9, ble undersøkt. HT-29 humane tykktarmkreftceller og HGT-1 humane magecancerceller ble behandlet med disse supernatanter. Forskjellige fortynninger alt fra ½ til ble testet. Dessuten ble cytotoksisiteten til en blanding av 15 mM acetat og 30 mM propionat testet ved konsentrasjoner nær disse ½ fortynnede supernatanter. Som positive kontroller av apoptose induksjon, den kjemoterapi narkotika camptothecin (4 mm) og etoposid (100 mm) ble brukt for HGT-1 og HT-29 celler, henholdsvis. Tre forskjellige fremgangsmåter for celledød overvåkning ble sammenlignet. Som vist i fig S2, metylenblått, MTT og trypan blå eksklusjons ga analyser liknende Kinetikken til døden. Følgelig ble metylenblått-analyse anvendt i denne studie for å vurdere cellelevedyktighet ytterligere. Den ikke-fermenterte meieriprodukter (melk eller melk ultrafiltrerte) hadde ingen effekt, hverken på HT-29, og heller ikke på HGT-1-celle-levedyktighet (fig. 1 A, B). Supernatanten av melk eller melkeultra gjæret av
P. freudenreichii
induserte en lignende cytotoksisitet i en tidsavhengig måte i HT-29 og HGT-1-celler, og i nærheten av cytotoksisiteten indusert av medikamenter eller av acetat /propionat blanding. Halv-maksimal dreping av HGT-1-celler skjedde etter 24 timer og 26 timer fra behandlingen med den fermenterte melk og fermentert melkeultrafiltrerte supernatanter henholdsvis, etter 17 timer med behandling med camptothecin og etter 24 timers behandling med SCFA blanding (Fig. S3) . I tillegg cytotoksisiteten av fermenterte meieriprodukt supernatanter i HGT-1-celler var doseavhengig (fig. 1C). For hver fortynning ble testet, fallet i HGT-1-celle-levedyktighet indusert av den fermenterte melken eller den fermenterte melken ultrafiltrat var svært like (fig 1C . Fig. S3). Det er derfor de neste trinnene i studien vi bare utføres med gjæret melk ultra supernatant. Tatt sammen indikerer disse data at propionsyrebakterier effektivt drepe human colon og magekreftceller, i det minste delvis via produksjons av propionat og acetat (fig. 1). Noen andre gjæret melk, fermentert med forskjellige meieri propionsyrebakterier stammer, viste lignende cytotoksiske effekter på kreftceller (tabell S2).
P. freudenreichii
ITG P9 er kjent for sin metabolsk aktivitet
in vivo product: [22], tilsvarende gjæret melk ble videre undersøkt.
(A) Effekt av
P. freudenreichii
gjæret melk på HT-29 menneskelige kolorektal kreftceller. HT-29 celler ble behandlet med en? Fortynning i DMEMc, av supernatanter oppnådd fra fermentert melk eller fermentert melk ultrafiltrat (firkanter). Som negative kontroller ble celler behandlet med ½ fortynninger av fermentert melk eller melk ultrafiltrat (ruter). Som positive kontroller (trekanter), ble cellene behandlet med DMEMc inneholdende en blanding av acetat og propionat (C2 /C3, 15/30 mM) eller etoposid (100 uM). (B) Effekt av
P. freudenreichii
gjæret melk på HGT-1 menneskelige mage kreftceller. HGT1 celler ble behandlet med en ½ fortynning i DMEMc, av supernatanter innhentet fra gjæret melk eller gjæret melk ultra (firkanter). Som negative kontroller ble celler behandlet med ½ fortynninger av fermentert melk eller melk ultrafiltrat (ruter). Som positive kontroller (trekanter), ble cellene behandlet med DMEMc inneholdende en blanding av acetat og propionat (C2 /C3, 15/30 mM) eller kamptotecin (4 uM). (C) Dose-avhengighet av fermentert melk cytotoksisk effekt. HGT-1 celler ble behandlet med ulike fortynninger av supernatanten hentet fra melk (tom symboler) eller melk ultra (vanlig symboler) både gjæret av
P. freudenreichii
. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved metylenblått-analysen etter forskjellige perioder med behandling. Prosentandelen av levedyktighet ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: 100 x (optisk tetthetsverdier for behandlede celler densitetsverdier /optiske av ikke-behandlede celler). Resultatene er middelverdier av tre forsøk.
P. freudenreichii
gjæret melk induserer typiske merkene av apoptose i humane mage kreftceller
Nucleus morfologi av HGT-1 celler inkubert i nærvær av
P. freudenreichii
gjæret melk ultra ble analysert ved fluorescens mikroskopi etter Hoechst 33342 farging (Fig. 2A). Den kjernefysiske fluorescens av ubehandlede celler (kontroll) forble uendret i løpet av tiden løpet av eksperimentet med blå normal kjerner (tid 0-h, Fig. 2AA). Under behandlingen HGT-1-celler viste de kondenserte kromatin og fragmenterte kjerner karakteristikker av apoptotiske kjerner (fig. 2AB, c), etterfulgt av forekomsten av apoptotiske legemer etter 72 h (fig. 2AD). Inter-nukleosomale DNA-fragmentering som resulterer i DNA ladde, et typisk tegn på apoptose [27], ble også overvåket under gjæret melk ultrafiltrat behandling. DNA-fragmentering ble observert fra 24 timer etter behandling med fermentert melk ultrafiltrat (Fig. 2B), og i mindre grad med camptothecin (fig. S3). DNA-innhold ble også kvantifisert ved flowcytometri etter propidiumjodid- merking for å studere effekten av gjæret melk ultra på HGT-en cellesyklus distribusjon (Fig. 2C). Ubehandlede HGT-1-celler presentert en cellesyklusfordeling (fig. 2ca) uten subG1 fase, som forble uendret i løpet av tiden løpet av eksperimentet (data ikke vist). Prosentandelen av celler i subG1 fase, en indikasjon på en apoptotiske prosess, en signifikant økning med tiden i løpet av fermentert melk ultrafiltrat behandling (figur 2C-B, Cc, Cd.) Ved 24 timer (39,24 ± 4,87%), etter 48 timer (91,63 ± 0,28 %) og etter 72 h (94,79 ± 0,45%). Etter 48 timer og 72 timers behandling var alle cellene var i subG1 cellesyklus fase, noe som indikerer fullstendig død av HGT-1-celler. Som en kontroll, camptothecin induserte lignende apoptotiske merkene i HGT-1-celler (Fig. S4).
(A), fermenterte melke ultrafiltrat-indusert atom kondensasjon. Cellene ble dyrket (0 h) eller behandlet for 24, 48 eller 72 timer med en ½ fortynning av
P. freudenreichii
gjæret melk ultra (UF) supernatant. Cellene ble deretter farget med Hoechst 33342 før fluorescens mikroskopi. Piler indikerer kromatin kondensasjon (b), kjerne fragmentering (c) og dannelsen av apoptotiske legemer (d). (B) Fermentert melk ultra-indusert DNA fragmentering i HGT-1 celler. Genomisk DNA ble ekstrahert og analysert på 1% agarosegel. HGT-1-cellene ble behandlet som i (A). (C) Probiotiske meieriultrafiltrerte-indusert forandringer i cellesyklus fase distribusjon. DNA-innholdet av HGT-1-celler ble analysert ved flow-cytometri etter propidiumjodidfarging. Representative histogrammer som tilsvarer DNA-innholdsanalyse av HGT-1-celler er vist. Prosentandelen av cellepopulasjonen med sub-G1 DNA-innhold, en indikasjon på apoptose, er indikert. Andelen av hver celleundergrupper (sub-G1, G0 /G1, S, G2 /M), innenfor den totale cellepopulasjonen, er vist for hver av behandlingstiden. Resultatene er middelverdier av tre uavhengige eksperimenter ± sd. *
P
0,05, **
P
0,01, behandlede cellene versus kontroll (0 h). Fordelingen av cellesyklus faser av ubehandlede celler (kontroll) forble uendret under hele forsøket.
For å bekrefte apoptoseinduksjon, phosphatdylserine trans fra indre til ytre vedlegget plasmamembranen ble vurdert ved farging HGT-1-celler med en kombinasjon av Annexin V-FITC (aV) og 7-AAD, etterfulgt av strømningscytometri fluorescens-analyse (fig. 3). Ubehandlede celler (0 h) presenterte en høy andel av levende celler (AV
– /7AAD
-; 92%) og bare 5% av cellene ble farget med Annexin V (figur 3B.). Disse prosentsatsene bestemt i ubehandlede celler forandret seg ikke i løpet av tiden løpet av eksperimentet (data ikke vist). Under behandlingen av HGT-1-celler med ½ fortynnet gjæret melk ultrafiltrat i DMEMc, bare prosentandelen av celler farget med 7-AAD (som indikerer nekrose) var meget lav (Fig. 3B). Imidlertid er prosentandeler av celler farget med Annexin V økte signifikant i en tidsavhengig måte og nådde 80% ved 72 timer (fig. 3B). Derfor HGT-1 celler gikk apoptose etter behandling med
P. freudenreichii
gjæret melk ultrafiltrat, karakterisert ved første AV positiv farging, noe som indikerer eksponering fosfatidylserin, og deretter både AV og 7-AAD positiv farging, noe som indikerer et senere tap av membranintegritet. Som en kontroll, camptothecin induserte lignende apoptotiske merkene (fig. S5).
Strømningscytometri kinetisk analyse av celledød i HGT-1-celler behandlet med
P. freudenreichii
gjæret melk ultra. (A) Et representativt forsøk av Annexin V /7-AAD farging av HGT-1-celler ved hver av behandlingstiden er vist, med andeler av Annexin V-positive celler (AV +; apoptotiske celler). (B) Kvantitativ FACS-analyse av Annexin V-FITC (AV) binding til HGT-1-celler ble utført etter kontra med 7-Aminoactinomycin-D (7AAD). Angitte verdier svarer til andelen av hver celleundergrupper, innen det totale cellepopulasjon, for hver behandlingstiden. Resultatene er middelverdier av tre uavhengige eksperimenter ± sd. *
P
0,05, **
P
. 0,01, behandlede cellene versus kontroll (0 h)
Som SCFA handle direkte på mitokondriene, tre viktige mitokondrie parametere ble også bestemt: den ΔΨm indre membran potensial, og generering av ROS, ved hjelp av to fluorescerende prober, DiOC (6) 3 (som er ΔΨm følsom) og DHE (som registrerer O
2
– nivå), og lokalisering av cytokrom c. Ubehandlede celler (0 h) oppviste en høy fluorescens (høy ΔΨm) og en lav DHE fluorescens (lav fremstilling av O
2
-) (Fig. 4A, B). Etter behandling med gjæret melk ultrafiltrat, en tidsavhengig reduksjon i inkorporering av DiOC6 (3) fluoriserende probe ble observert, og viser et tap av ΔΨm og følgelig mitokondriemembranen depolarisering (Fig. 4A). Prosentandelene av behandlede HGT-1-celler med redusert indre membranpotensialet økes på en tidsavhengig måte for å nå 96% av cellene i 72 timer. FCCP behandling ble anvendt som en positiv kontroll av mitokondriemembranen depolarisering. Dette tap av ΔΨm ble bekreftet ved den karakteristiske tap i rød fluorescens følgende JC-1-farging (fig. 4B). Når det gjelder ROS produksjon i HGT-1 celler, gjæret melk ultra behandling indusert opphopning av O
2
-, betydelig etter 48 timer og 72 timer etter behandling (fig 4C.). Dette ROS akkumulering delvis kan forhindres hvis celler er forbehandlet med ROS scavenger TEMPOL (fig. S6). Cytokrom c frigjøring fra mitokondrier til cytoplasma er en viktig cellulær hendelse av den apoptotiske programmet. Immunoblotting undersøkelse av cytoplasma-anrikede fraksjoner med hensyn til nærvær av cytokrom c bekreftet en endring i dens subcellulære lokalisering (Fig. 4D). Cytokrom c ble påvist i cytoplasma-anrikede fraksjon fra 24 timer av behandlingen, noe som indikerer flytting av dette proteinet (fig. 4D). Denne relocalization av cytokrom c i cytoplasma ble bekreftet ved immunfarging, og viser diffus farging gjennom hele cellen etter behandling, mens punctuated farging før behandling (fig. 4E).
Kinetisk analyse av mitokondrielle hendelser i HGT-1-celler behandlet med
P. freudenreichii
gjæret melk ultra (A) Flowcytometri kinetisk analyse av mitokondrie indre membran (ΔΨm) spredning med DiOC (6) 3 farging. Et overlegg riss av et representativt eksperiment er vist. Todelingen FCCP (50 uM, 20 min) ble benyttet som positiv kontroll. Kvantitative analyser av ΔΨm tap i 3 uavhengige eksperimenter er vist. Verdier er representert som en andel av celler med lav ΔΨm, innen det totale cellepopulasjon, for hver behandling. Resultatene er middelverdier av tre uavhengige eksperimenter ± sd. *
P
0,05, **
P
0,01, behandlet versus kontroll (0 h). (B) HGT-1 celler ble farget med JC-1. Tapet av mitokondriemembranpotensialet er angitt ved progressivt tap av rød-JC-1-aggregat fluorescens og cytoplasmisk diffusjon av grønn monomer fluorescens (C) Strømningscytometri kinetisk analyse av anion superoksyd (O
2
-) akkumulering med DHE farging. En overlapping av et representativt eksperiment av ROS deteksjon ved hvert tidspunkt av behandling er vist. Celler ble farget med dihydroethidium og analysert ved strømningscytometri. Den pro-oksidant menadion (menn., 100 uM, 15 min) ble benyttet som positiv kontroll. Verdier er representert som en andel av celler med øket ROS (økning av fluorescens-intensitet), innenfor den totale cellepopulasjonen, for hver behandling. Resultatene er middelverdier av tre uavhengige eksperimenter ± sd. *
P
0,05, **
P
0,01, behandlet versus kontroll (0 h). (D) cytokrom c flytting over hele behandlingsperioden med
P. freudenreichii
gjæret melk ultra supernatant ½ ble vurdert av western blot analyse. Etter celle-behandling, ble cytoplasma-rikere fraksjoner analysert ved western blotting og avdekket ved hjelp av et anti-cytokrom c antistoff. Antistoffer rettet mot Hsc-70 ble anvendt som en kontroll lasting. (E) subcellulære lokalisering av cytokrom c. Celler ble immunostained med anti-cytokrom c antistoff, etter MitoTracker farging og før DNA-farging bruker TO-PRO 3. Pilen viser spredning av cytokrom c i cytoplasma.
P. freudenreichii
gjæret melk aktiverer caspases
For å bekrefte apoptotiske mekanismene indusert av gjæret melk ultra i HGT-1 celler, ble behandlingen av caspases 3, 8 og 9 analysert ved Western blotting og tilsvarende enzymatiske aktiviteter overvåking i HGT -1 celleekstrakter (fig. 5). Den ikke-gjæret melk ultrainduserte ikke caspaseaktivering i HGT-1 celler: bare proforms av caspase-3 og -9 ble oppdaget på western blot (Fig. 5A) og ingen caspase aktivitet ble målt (figur 5B.). Den fermenterte melk ultrafiltrat supernatant, så vel som camptothecin eller blandingen av propionat og acetat i en [2: 1] molforhold, indusert spaltning av pro-kaspase 3 og genereringen av de aktive former av caspase-3, subenhetene p17 og p12 (fig. 5A). Aktiveringen av caspase-3, som er en effektor caspase, bekreftet den apoptose-induksjon. I tillegg er gjæret melk ultrafiltrat indusert spaltning av procaspase-9, som fører til at 35 og 37 kDa bearbeidede former. Caspase-8 ble ikke påvist i kontroll ubehandlede HGT-1 celler. Men behandling med propionibacterial supernatanter eller C2 /C3 blanding ført til en klar påvisning av 54 kDa proform, etterfulgt av sin spalting etter 48 timers behandling.
Behandling av effektor caspase 3 og initiativtaker caspases 8 og 9 ble etterfulgt av western blotting og spesifikk enzymatisk aktivitet overvåking i HGT-1 celler. (A) De proforms og spaltede subenheter av kaspase 3, 8 og 9 ble påvist ved western blotting i lysater av HGT-1-celler behandlet med
P. freudenreichii
gjæret melk ultra supernatant ½. Ikke-fermentert melk ultrafiltrat (UF ½, 48 h), en blanding av acetat og propionat (C2 /C3, 15/30 mM, 48 h) og camptothecin (4 uM, 48 t) ble anvendt som kontroller. Antistoffer rettet mot Hsc-70 ble anvendt som en kontroll lasting. (B) caspaser spesifikke aktiviteter av lysater fra celler behandlet som ovenfor, ble undersøkt ved hjelp av angitte peptider og beregnet som beskrevet i materialer og metoder. Resultatene er middelverdier av tre forsøk ± sd. *
P
0,05, **
P
. 0,01, behandlet versus kontroll (0 h)
Kvantifisering av caspase-3, -8 og -9 enzymatiske aktiviteter bekreftet caspaseaktivering av begge propionibacterial metabolitter og ved camptothecin. Faktisk ble caspases-9 og -3 aktivert på de tidligste stadiene av behandlingen, mens caspase-8 virket aktiveres senere (Fig. 5B). Camptothecin og den SCFA blandingen aktiveres alle de tre undersøkte caspaser. Disse data bekreftet aktiveringen av den indre reaksjonsvei av apoptose av fermentert melk ultrafiltrat behandling, med en tidlig aktivering av kaspase-9 og deretter av caspase-3 og -8.
P. freudenreichii
gjæret melk øker camptothecin cytotoksisitet
Campthotecin er et cytotoksisk kinolin alkaloid som inhiberer enzymet DNA-topoisomerase I (topo I) og er mye brukt i kjemoterapeutisk behandling av GC. Vi har vist ovenfor at propionibacterial metabolitter indusere apoptose i HGT-1-celler via mitokondrie død pathway. Vi neste studert apoptose indusert ved en kombinasjon av både camptothecin og gjæret melk ultrafiltrat i HGT-1-celler. Økte konsentrasjoner av camptothecin (0, 0,25, 0,5, 1, 2 uM) i kombinasjon med økt konsentrasjon av fermentert melk ultrafiltrat (0,, ⅛, ¼) ble testet på HGT-1-celle-levedyktighet og begge indusert tap av HGT-1 levedyktighet , på en doseavhengig måte (fig. 6). Videre, tilsetningen av gjæret melk ultrafiltrat forbedret signifikant cytotoksisitet av camptothecin i HGT-1-celler (fig. 6). For eksempel, 0,25 uM camptothecin og gjæret melk ultrafiltrat fortynnet til ⅛ førte til en levedyktighet tap på 8,6% og 18,6%, respektivt. Kombinasjonen av disse to forbindelser førte til en cellelevedyktighet tap på 29,8% (fig. 6), noe som tyder på en ekstra cytotoksisk effekt når camptothecin ble kombinert med fermentert melk ultrafiltrat i HGT-1-celler. Følgelig er kombinasjonen indeks (CI) beregnet som tidligere [28], har en verdi på 1, noe som indikerer en additiv effekt av camptothecin og fermentert melkeultrafiltrert behandlinger.
Levedyktighet av HGT-1 human magekreft behandlet i løpet av 24 timer ble fastslått ved metylenblått-analyse. HGT-1-cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av camptothecin (0 til 2 um) sammen med forskjellige fortynninger av
P. freudenreichii
gjæret melk ultra (UF) supernatant. Prosentandelen av levedyktighet ble beregnet ved den følgende formel: 100 x (optisk tetthetsverdier for behandlede celler densitetsverdier /optiske av ikke-behandlede celler). Resultatene er middelverdier av tre forsøk ± sd. *
P
0,05, **
P
. 0,01, behandlede cellene versus kontroller (samme camptothecin konsentrasjon uten gjæret melk ultra supernatanten og samme gjæret melk ultra supernatant fortynning uten camptothecin)
Diskusjoner
En ny gjæret melk, som inneholder
P. freudenreichii
som eneste bakterie, ble utviklet for å ytterligere undersøke probiotiske potensialet i denne meieri utarbeidelse av propionsyrebakterier (anmeldt i [29]). I denne studien, rapporterer vi at den vandige fase av dette fermentert melk dreper human colon og magekreftceller via metabolittene, inkludert propionat og acetat, utgitt av denne bakterien. Denne forestillingen er basert på de observerte cytotoksiske effekten av
P. freudenreichii
gjæret melk supernatanter på kultivert HT-29 og HGT-1 kreftceller. Denne effekten ble oppnådd med ultra-sentrifugerings supernatanter, dvs. den fermenterte melk vandige fase, blottet for kaseiner og bakterier, som viser at de aktive forbindelser utskilles, som tidligere beskrevet for propionsyrebakterier [19]. Av denne grunn ble de fleste av forsøkene i dette arbeidet som er utført med fermentert melk ultrafiltrat (fig. 1). Vi demonstrerte for første gang at
P. freudenreichii
gjæret melk supernatant induserte apoptose av HGT-1-celler i en tids- og doseavhengig måte med utseendet av klassisk morfologiske og biokjemiske funksjoner i apoptose (kondensert og fragmentert chromation, DNA ladde og akkumulering av celler i cellesyklus subG1 fase).
Vi så da hvis de cellulære mekanismene som er involvert i HGT-en celledød veien var lik den mitokondrielle dødsveien utløst i Caco-2 og HT-29 human tykktarm kreft celler med
P. freudenreichii
DMEMc dyrkningssupernatanter [19], [20]. Den sub-cellulære og biokjemiske hendelser som ble observert i de behandlede HGT-1-celler med gjæret melk ultrafiltrat var lik og er inkludert i det minste mitokondrie ΔΨm tap, ROS (O
2
-) generasjon, caspaser behandling og aktivering, cytokrom c flytting inn i cytoplasma (fig. 3, 4, 5). Fermentert melk supernatant induserte prosessering og aktivering av kaspase-8 i tillegg til caspaser -3 og -9.
