Abstract
Til tross for at et viktig vitamin, folat har vært innblandet å forbedre tumor vekst, noe som gjenspeiles av rapporter om overekspresjon av folat reseptor alfa (FRα) i karsinomer. Rollen til en annen transporter folat, redusert folat bærer (RFC), er stort sett ukjent. Denne studien undersøkte rollene til folat, FRα og RFC i eggstokkreft. Vi demonstrerte FRα mRNA og protein overekspresjon og redusert RFC uttrykk i forbindelse med FRα genamplifisering og RFC promoter hypermethylation hhv. FRα overekspresjon var assosiert med tumorprogresjon mens RFC uttrykk pådratt seg en gunstig klinisk resultat. En slik gjensidig uttrykk mønsteret ble også observert i eggstokkreft cellelinjer. Folat ble vist å fremme kreftcelle spredning, migrasjon og invasjon
in vitro
, og ned-regulere E-cadherin uttrykk. Denne effekten ble blokkert etter enten stabil knockdown av FRα eller ektopisk overekspresjon av RFC. Dette hittil urapportert fenomen tyder på at RFC kan tjene som en balanse partner av FRα og gi en beskyttende effekt hos pasienter med høye FRα-uttrykke eggstokkene karsinomer, som gjenspeiles av deres langvarige totale og sykdomsfrie overlevelse. I konklusjonen, rapporterer vi på den paradoksale effekten av FRα (antatt onkogen) og RFC (antatte svulst undertrykkende) i menneskelige kreftformer. FRα og RFC kan potensielt bli utforsket som terapeutisk mål eller prognostisk markør hhv. Vi anbefaler forsiktighet og ytterligere forskning på folattilskudd i kreftpasienter
Citation. Siu MKY, Kong DSH, Chan HY, Wong ESY, Ip PPC, Jiang L, et al. (2012) Paradoksal Impact of Two Folat reseptorer, FRα og RFC, i Eggstokkreft: Effekt på celleproliferasjon, Invasion og klinisk utfall. PLoS ONE 7 (11): e47201. doi: 10,1371 /journal.pone.0047201
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 1 juni 2012; Godkjent: 10 september 2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 Siu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av midler fra American Institute for Cancer Research postdoktor Award og University of Hong Kong Seed finansiering, og konferansen og stipend fra University of Hong Kong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokk karsinomer står for den høyeste dødeligheten blant alle gynekologisk kreft i verden [1], [2]. Mens forekomsten av eggstokkreft karsinom varierer mellom ulike etniske grupper, er dens forekomst i asiatiske land på en stigende trend [3], [4]. Årsakene til dette er fortsatt i stor grad ukjent eller kontroversielt. Flere livsstil risikofaktorer har vært innblandet. Disse inkluderer kosthold, fedme, fruktbarhet og paritet statuser. På den annen side har det blitt en generell oppfatning at høyt inntak av mikronæringsstoffer som folat, vitamin C, vitamin E kan beskytte mot kreft [5]. Som sådan, er bedre forståelse av effektene av ernæringsmessige elementer på kreft viktig å forbedre strategier for kreftforebygging og ledelse.
Folat er et vannløselig B-vitamin finnes i de fleste grønnsaker. Et høyt kosttilskudd folat inntak har blitt rapportert å assosiere med en lavere risiko for å utvikle eggstokk-kreft, spesielt de som bruker alkohol [6], [7], [8], [9]. Det er nært knyttet til sin funksjon på DNA syntese og sitt engasjement i den relaterte metionin metabolismen viktig for DNA metylering. Folatmangel ville fører derfor til DNA hypometylering, forandret genekspresjon og misincorporation av uracil i DNA, som fører til kromosomskade, som alle er viktige faktorer for carcinogenese [10], [11]. Det synes som folat er en viktig vitamin vesentlig i normal funksjon av celler, og for å forhindre igangsetting av kreft. Men det er økende bevis for at folat kan faktisk forbedre kreft progresjon i etablerte karsinomer i tykktarm og endetarm, bryst og prostata [12], [13], [14].
Folat uptake involverer flere transportører , slik som folatreseptorer, og redusert folat bærer (RFC) [15], [16]. Folat-reseptor alfa (FRα), en enkelt kjede glykosyl-fosfatidylinositol-forankret membranprotein, forsterker folat opptak gjennom endocytose. Dets overekspresjon har blitt rapportert i eggstokk-kreft, noe som tyder på at det kan fremme tumorvekst [17], [18], [19], [20]. RFC er en allestedsnærværende uttrykt transportør for naturlige folates og klassiske antifolater, og kan styre folat opptak i en toveis måte [16]. Tap av RFC med påfølgende effekter av folatmangel ble funnet å fremme kreft progresjon i endetarmskreft [16], [21]. Det vil derfor være naturlig å anta at disse to folat transportører, FRα og RFC, utøve ulike effekter i kreft progresjon.
Selv om det er etablert overekspresjon av FRα i eggstokkreft, uttrykket status og funksjonelle roller RFC forbli i stor grad ukjent. I denne studien undersøkte vi uttrykket, genetiske og epigenetiske profiler av FRα og RFC i normal ovarie epitel og eggstokk-kreft, og korreleres med clinicopathological parametere. Deres funksjonelle roller og mulige nedstrøms mål på celleproliferasjon, migrasjon og invasjon i forhold til folat i eggstokkreft ble også vurdert. Vi forsøkt å bedre forstå rollene til folat og sine transportører i eggstokkene kreftutvikling, og utforske mulige effekter av folat inntak hos kreftpasienter.
Materialer og metoder
kliniske prøver og cellelinjer
Ett hundre og femti tre formalinfiksert parafin innebygd prøver av ovarietumorer, inkludert 11 inklusjons cyster /godartede cystadenomas (22-63 år, gjennomsnittsalder, 50 år), 19 borderline tumorer (20~46 år, gjennomsnittsalder , 30 år), 83 karsinom (34 til 83 år, med en gjennomsnittlig 51 år) med ulike histologiske subtyper og 44 tilsvarende metastaser (tabell 1), ble hentet fra Avdeling for patologi, Queen Mary Hospital, University of Hong Kong. Alle pasienter ble operert og 67 pasienter med eggstokkreft ble også behandlet med kjemoterapi, inkludert platina /paclitaxel. Oppfølgingen perioden varierte fra fem til 209 måneder (gjennomsnittlig 63 måneder). Tretti tre tilfeldig utvalgte kliniske prøver av ovarietumorer og tilhørende normale motstykker, inkludert egglederne og /eller kontralaterale eggstokker, med tilgjengelige frosne blokker ble også hentet. Informert samtykke ble innhentet av alle pasienter og bruken av disse kliniske prøvene ble godkjent av Institutional Review Board ved University of Hong Kong /Hospital Authority Hong Kong West Cluster (HKU /HA HKW IRB) (Institutional Review Board Nummer: UW10-129) . Haematoxylin eosin farget deler av frosne blokker av hver prøve ble gjennomgått av to av oss (ANYC og PPCI) for å bekrefte diagnosen og for å sikre at mer enn 80% tumorceller var tilstede i tumorvev.
To foreviget på eggstokkene epiteliale cellelinjer, slange 6-3 og SLANGE 17-1, og ni eggstokkreft cellelinjer, Skov-3, ovčar-3, OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626 (ATCC, Manassas, VA). ble dyrket som beskrevet tidligere [22], [23]
real-time PCR (qPCR)
Total RNA fra frosne kliniske prøver og kreft cellelinjer var hentet ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen). Genomisk DNA-forurensning ble fjernet ved behandling med DNase I (Invitrogen) behandling. 2,5 mikrogram total RNA ble revers transkribert av Super revers transkriptase (Invitrogen, San Diego, California). Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av fenol /kloroform (Invitrogen). qPCR ble utført med ABI Prism 7700 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, Foster City, CA) som beskrevet [22], [23], [24]. Primersekvenser for evaluering av mRNA-ekspresjon av FRα, RFC og GAPDH (som intern kontroll) var som følger: FRα forstand, 5′- AAGTGCGCAGTGGGAGCT -3 «, og antisense, 5′- CATTGCACAGAACAGTGGGTG -3»; RFC forstand, 5’CGAAACCTCGGCTTCGGAGC -3 «, og antisense, 5’GCACGTAGTAGACCACCAGG -3»; GAPDH forstand, 5’TCCATGACAACTTTGGTATCGTG -3 «, og antisense, 5’ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG -3». PCR renhet ble bekreftet ved gelelektroforese. Primer sekvenser (følelse, 5’GTATGCATGGCTTCCTGCAGG -3 «, og antisense, 5’ACTTGTTAAACCCTGTAGAGAGG -3») for å vurdere FRα genkopitallet ble utformet basert på genomsekvens intron 3 og intron 4 av FRα (Ensemble database). TRAT1 ble anvendt som referanse-genet [25]. Eggstokkreft prøver med ≥ dobling fra deres tilsvarende normale kolleger ble ansett som positivt for FRα genamplifikasjon.
Immunoblotting
Celler ble høstet med lysebuffer (0,125 M Tris, pH 6,8 på 22 ° C inneholdende 1% NP-40 (v /v), 2 mM EDTA, 2 mM N-etylmaleimid, 2 mM PMSF, 1 mM natriumortovanadat og 0,1 mM natrium-okadate], og fjernet ved sentrifugering ved 4 ° C. Protein konsentrasjonen ble bestemt ved DC (vaskemiddel PC) proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 20 ug protein ble løst ved hjelp av SDS-PAGE, overført til polyvinylidendifluorid-membran og hybridisert med antistoffer som er spesifikke til FRα (1:1000.; Alexis Biochemical, San Diego, CA, ALX-804-439), RFC (1:1000, Affinity BioReagents, Golden, CO, PA1-9553), E-cadherin (1:5000, BD Biosciences, Palo Alto, CA, 610182 ), og aktin (1:1000, Sigma, St. Louis, MO,. A5060) og passende sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) Flekkene ble utviklet av Enhanced Chemiluminescence (ECL) Pluss deteksjon system (Amersham, Arlington Heights, UK), og visualisert med X-ray film (Galen Medical Group, Chattanooga, Tennessee) [22], [23], [24].
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk farging var utført som beskrevet i tidligere rapporter [22], [23], [24]. For FRα immunhistokjemi, ble parafinsnitt behandlet med geit anti-folat reseptor antistoff konjugert med pepperrotperoksidase (1:200, Abcam, Cambridge, MA, ab20572). Siden anti-FRα antistoff fra Alexis Biochemical anvendt for immunblotting ble ikke ha tilfredsstillende resultat på immunfarging ved hjelp av parafinsnitt, ble et annet antistoff fra Abcam anvendt. Selv om dette antistoff kan gjenkjenne andre isoformer av FR, ble beta og gamme isoformer av FR rapportert å være overveiende uttrykt i placenta og hematopoetiske celler, men ikke på andre vev [26], [27]. Dette antistoffet kan derfor brukes til å detektere FRα immunreaktivitet i eggstokk-kreft. For RFC immunhistokjemi, kylling anti-RFC-antistoff (1:200; Affinity BioReagents) ble påført, etterfulgt av biotin-kanin-anti-kylling-IgG (H + L). 3-diaminobenzidin-hydrogenperoksyd ble anvendt som kromogen. Mikrobølgeovn antigen-utvinning ved hjelp av citrat-buffer (pH 6,0) ble utført. Utelatelse eller substitusjon av det primære antistoff med preimmun IgG serum ble anvendt som en negativ kontroll. Intensitet i farget epitelceller ble scoret som 0 (negativ), en (svak), 2 (moderat), og 3 (sterk). Prosentandelen av fargede celler ble vurdert som 0 (mindre enn 5%), en (5% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%) og 4 ( 75%) . Immunreaktiviteten ble bedømt ved å multiplisere fargeintensitet ved prosentandelen av fargede celler for å gi et kompositt et sammensatt «Histoscore» [22], [23]. Høye og lave nivåer av FRα og RFC ble definert av «HistoScores» cut off på gjennomsnittet.
Demetyler behandling
Skov-3 og OVCA420 celler ble behandlet med 0, 5 eller 10 mm 5- aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dc, en DNA-metylering inhibitor) i 72 timer [28]. Kontrollceller ble behandlet med tilsvarende volum av dimetylsulfoksid (DMSO). Total RNA ble ekstrahert fra cellene. Transkripsjonen aktivitet av RFC ble bestemt av qPCR.
DNA forberedelse, bisulfitt behandling og metylering spesifikke PCR (MSP) analyse
Genomisk DNA fra frosne kliniske prøver ble hentet ved hjelp av fenol /kloroform. Bisulfitt behandling ble utført som beskrevet [28]. Primere spesifikke for metylert (forstand, 5’TTCGTCGTAGTTTGCGAATG -3 «, og antisense, 5’CAACACGTACCTAAACGCGA -3») og unmethylated (fornuft, 5’TTTGTTGTAGTTTGTGAATGG -3 «, og antisense, 5’ACAACACATACCTAAACACAA -3» ) RFC promoter A ble rapportert tidligere [29]. Glødetemperaturen var 52 ° C og 56 ° C i denaturert og unmethylated promoter A hhv. MSP-produkter ble påvist ved elektroforese på 2% agarosegel med etidiumbromid-farging. Normal lymfocytt DNA metylert med SSSL metyltransferase ble brukt som positiv kontroll. Ubehandlede genomisk DNA og vann blanks uten DNA ble brukt som negative kontroller.
Stall knockdown av FRα, ektopisk overekspresjon av RFC og folat behandling i Skov-3
Skov-3, en eggstokkreft celle linje med forholdsvis høy FRα og lav RFC ekspresjon, ble anvendt. Til stabil knockdown FRα ble celler transfektert med et sett med shRNA-konstruksjoner mot humant FRα, PRS-sh FRα (Origene, Rockville, MD), valgt med puromycin (1,5 ug /ml) [22], [23], [24] . PRS-vektoren ble anvendt som kontroller. Å forbigående overuttrykker RFC ble pcDNA3-RFC plasmid (vennlig levert av Prof L Matherly, Michigan Cancer Foundation) og den tomme pcDNA3 vektor (kontroll) transfektert inn i kontroll Skov-3 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) [22], [23] , [24]. Celler ble dyrket i Medium 199 (Invitrogen) /MCDB 105 (Sigma) medium inneholdende 22,7 nM folsyre og supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) [22], [23]. shFRα celler og RFC overuttrykker celler (2 dager etter transfeksjon) ble forbehandlet med folat-fritt RPMI 1640-medium (Invitrogen) supplementert med 10% dialysert FBS inneholdende 0,6 nM folsyre (Invitrogen) i 2 dager, trysinized, telles belagt for funksjonelle analyser og deretter behandlet med forskjellige doser av folsyre, et syntetisk folat, blant 0, 6, 12 og 60 nM. De folsyre konsentrasjonene som benyttes er basert på det fysiologiske området i plasma, som strekker seg fra 7 nM i individer med en negativ folat saldo til 50 nM i personer med 400 ug /d av folat forbruk [30], hvilken er estimert folatinntaket med supplement nonusers i Nord-Amerika [13]. Den folinsyre konsentrasjon valgt (12 nM) var basert på den observasjon at en slik konsentrasjon er den laveste behov for cellevekst [31]. Protein ble ekstrahert 2 dager etter behandling.
MTT (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid) -analyse
celle proliferasjon ble bestemt ved hjelp MTT-analyse (Sigma) som beskrevet [22], [24]. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater med 2000 celler /brønn. Ved bestemte tidspunkter ble 10 ul MTT tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer, etterfulgt av tilsetning av 100 ul DMSO til hver brønn for utvinning fargestoff. Celleproliferasjon ble bestemt ved å måle absorbans av prøver ved 570 nm med 630 nm som referanse bølgelengde.
In vitro
migrasjon og invasjon analyser
In vitro
migrering og invasjon analyser ble utført som beskrevet [22], [23], [24]. 1,25 x 10
5-celler ble sådd ut på oversiden av en Transwell sette inn og tillates å migrere gjennom et 8 um porestørrelse membran (migrasjon analyser) eller invadere gjennom en Matrigel-belagte membran (invasjons assays). Celler ved den øvre side av membranen ble fjernet, og de migrerte eller invaderte celler ble fiksert med metanol, farget med 0,5% krystallfiolett og tellet under et lysmikroskop i 5 tilfeldige områder etter henholdsvis 24 timer eller 48 timer.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 15.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Mann-Whitney-testen ble benyttet for sammenligning mellom to grupper, mens Kruskal-Wallis rank test ble benyttet for sammenligning mellom flere grupper. Survival analyse ble utført av Kaplan-Meier analyse og log-rank test. Cox regresjonsanalyse ble benyttet for multivariat overlevelsesanalyse.
P
verdier. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Overuttrykte FRα var assosiert med eggstokkreft tumorprogresjon
Etter qPCR, betydelig høyere FRα mRNA ble funnet i kreftprøver sammenlignet med tilsvarende ikke-tumor kolleger etter normalisering med GAPDH (
P
= 0,015) (figur 1A). Ved immunhistokjemi, ble sterk FRα immunoreaktivitets observert i eggstokkreft i motsetning til moderat farging av FRα i borderline tumorer og svak eller fravær av flekker i godartede cystadenomas /inkludering cyster (figur 1C). Faktisk var signifikant høyere FRα immunoreaktivitets oppdaget i eggstokkreft og borderline tumorer enn i godartede cystadenomas /inkludering cyster (alle
P
0,05, tabell 1). På cellelinjer nivå, seks av ni ovarie cancer-cellelinjer viste også oppregulering av FRα mRNA og protein ekspresjon med SKOV-3, OVCAR-3 og SW626 viser sterk ekspresjon mens OVCA 420, Dov13 og TOV21G viste svak ekspresjon sammenlignet med to normale eggstokkene epitel cellelinjer hvor ingen FRα mRNA og protein uttrykk er registrert (Figur 1B).
(A) qPCR analyse av FRα mRNA i ovarietumorer og tilsvarende ikke-tumor kolleger. (B) mRNA (øvre panel) og protein (nedre panel) uttrykk for FRα i to foreviget på eggstokkene epiteliale cellelinjer, slange 6-3 og slange 17-1, og ni eggstokkreft cellelinjer, OVCAR-3, Skov-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, som vurdert av qPCR og immunoblotting hhv. (C) immunreaktivitet av FRα i serøs (a) og mucinous (e) godartede eggstokkene cystadenomas, serøs (b) og mucinous (f) border ovarietumorer og serøs (c), mucinous (g), klare celle (d) og endometrioid (h) ovariekarsinomer. Scale bar = 100 mikrometer. (D) Kaplan-Meier samlet (venstre panel) og sykdomsfri (høyre panel) overlevelseskurver for eggstokkreft pasienter med høye og lave nivåer av FRα (avkortet i gjennomsnitt).
I klinisk prøvene ble høy FRα mRNA uttrykk og immunoreaktivitets funnet å være signifikant assosiert med avanserte stadier av sykdom og dårlig histologisk grad, faktorer assosiert med tumor aggressivitet (tabell 1 og 2). Imidlertid ble ingen signifikant forskjell på FRα immunoreaktivitets funnet mellom kjemosensitiv og kjemoresistent tilfeller (tabell 1). Kaplan-Meier-overlevelsesanalyser heller ikke avsløre sammenheng mellom høy FRα uttrykk og total eller sykdomsfri overlevelse (figur 1D).
RFC ble nedregulert i eggstokkreft og korrelert med god prognose av pasienter
i motsetning til FRα, eggstokkreft prøvene viste signifikant lavere RFC mRNA sammenlignet med tilsvarende ikke-tumor kolleger som vurderes av qPCR (
P
= 0,001) (figur 2A). Immunhistokjemisk analyse avslørte også sterk RFC immunoreaktivitets i inklusjons cyster /godartede cystadenomas og svak uttrykk i eggstokkreft (Figur 2C). Seks av ni ovarie cancer-cellelinjer vises også nedregulering av RFC mRNA og protein ekspresjon sammenlignet med to vanlige ovarie-epitel cellelinjer (figur 2B).
(A) qPCR-analyse av mRNA i RFC ovarietumorer og de tilsvarende ikke-tumor motstykker. (B) mRNA (øvre panel) og protein (nedre panel) uttrykk for RFC i to foreviget på eggstokkene epiteliale cellelinjer, slange 6-3 og slange 17-1, og ni eggstokkreft cellelinjer, Skov-3, OVCAR-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, som vurdert av qPCR og immunoblotting hhv. (C) Immunreaktiviteten av RFCin inkludering cyste (a) og serøs ovariekarsinomer (b). Scale bar = 100 mikrometer. (D) Kaplan-Meier samlet (venstre panel) og sykdomsfri (høyre panel) overlevelseskurver for eggstokkreft pasienter med høye og lave nivåer av RFC (avkortet i gjennomsnitt). (E) Kaplan-Meier samlet (venstre panel) og sykdomsfri (høyre panel) overlevelseskurver for høy FRα uttrykt eggstokkreft pasienter med høye og lave nivåer av RFC (avkortet i gjennomsnitt).
RFC mRNA og immunoreaktivitets korrelerte ikke med stadier av sykdommen, histologisk grad og histologiske undergrupper (tabell 1 og 2). Interessant, var det en signifikant sammenheng mellom lav uttrykk for RFC, og kortere samlet (
P
= 0,034) og sykdomsfri (
P
= 0,011) overlevelse (figur 2D). Videre blant eggstokkreft med høy FRα uttrykk, den generelle (
P
= 0,007) og sykdomsfri (
P
= 0,008) overlevelse signifikant lenger i de med høy RFC uttrykk (Figur 2E).
FRα genamplifisering og RFC promoter metylering bidratt til feilregulert genekspresjon i eggstokkreft
etter qPCR, 11 av 33 (33,3%) kreftprøver viste FRα genet (FOLR1, kromosom 11q13.3) amplifisering sammenlignet med de tilsvarende ikke-tumor motstykker. Alle forsterkede tilfeller viste forhøyet mRNA uttrykk. FRα forsterkning ble korrelert med sin mRNA uttrykk (
P
0,001, Fishers eksakte test) (tabell 3)
På den annen side, redusert uttrykk for RFC i eggstokkreft. var relatert til hypermethylation. Etter behandling av SKOV-3 og OVCA420 eggstokkreft celler av 5-aza-dc, en DNA-metylering inhibitor, to ganger og 2,5-ganger økning av RFC genekspresjon ble påvist henholdsvis (figur 3A). Videre ble arrangøren hypermethylation av RFC-genet (kromosom 21q22.2) funnet i 14 av 33 (42,4%) eggstokkreft prøver av MSP. Representative eksempler på MSP er vist i figur 3B. I motsetning til bare 3 av 33 (9%) av ikke-tumorprøver viste hypermethylation. Unmethylated alleler ble påvist i alle kreft og ikke-tumorprøver. Arrangøren hypermethylation av RFC signifikant negativt korrelert med sin mRNA uttrykk (
P
= 0.005, Fishers eksakte test) (tabell 3). Ved MSP, vi også oppdaget RFC promoter hypermethylation i fem eggstokkreft cellelinjer Skov-3, OVCA 420, OVCA433, TOV21G og SW626 (figur 3B), alle av dem viste nedregulert RFC mRNA og protein uttrykk (figur 2B). I motsetning til dette ble det ikke denaturert alleler påvises (figur 3B) i den normale eggstokk-epitel cellelinje SLANGE 6-3 og to kreftcellelinjer OVCAR-3 og OC316, som vist RFC mRNA og protein ekspresjon (figur 2B), etter
(A) Den relative mRNA-ekspresjon av RFC i SKOV-3 og OVCA 420 etter 5-aza-dc behandling med indikerte konsentrasjoner i 72 timer. Hvert forsøk ble utført in triplo. Barer, gjennom ganger endring ± SD. *,
P
0,05. (B) Representative eggstokkreft (CA) (øvre panel) og eggstokkcellelinjer (nedre panel) av MSP på RFC metylering status. M, men da DNA; P, positiv kontroll; N, negativ kontroll; M, denaturert alleler; U, unmethylated alleler.
knockdown av FRα endret folat-mediert celleproliferasjon i Skov-3 celler
Etter å ha bekreftet det spesifikke knockdown av FRα mRNA og protein uttrykk i Skov-3 celler (Figur 4A), vi først bestemt virkningene av FRα for folat-mediert celle proliferasjon av MTT-analysen. På dag 2 og 4, ble ingen vesentlig endring av celleproliferasjon som finnes i kontroll og shFRα SKOV-3-celler etter behandling folat. Etter dag 6, kontrollceller viste spredning i 12 og 60 nM folat behandling. På dag 8, 6, 12 og 60 nM folat-behandlede kontrollceller viste ikke-avhengig proliferasjon. I motsetning til dette, knockdown av FRα blokkert folat-mediert celleproliferering (figur 4B).
(A) Stabil knockdown av FRα mRNA og protein i SKOV-3 som detektert ved qPCR (venstre panel) og immunoblotting (høyre panel ) hhv. **
P
0,005. (B) Celleformeringshastigheten av kontroll og shFRα SKOV-3-celler behandlet med 6, 12 og 60 nM folat ved 2, 4, 6 og 8 dager vises som gangers forandring i forhold til kontroll uten folat behandling (0 nM). n = 3; *,
P
0,05. (C)
In vitro
migrasjon (venstre panel) og invasjonsanalyser (panel høyre) i kontroll- og shFRα Skov-3 celler behandlet med 0, 12 og 60 nM folat bruker Transwell membran uten eller med Matrigel belegg hhv. Øvre paneler: representative bilder av trekkende eller invadere Skov-3 celler. Lavere paneler: Cell migrasjon eller invasjon fra Skov-3 presenteres som prosent av kontroll behandles med 0 nM folat; n = 3; *,
P
0,05; **
P
0,005. (D) Immunoblotting på FRα og E-cadherin bruker proteinlysatene fremstilt av kontroll og shFRα Skov-3 (venstre panel). Relativ E-cadherin protein nivå som analyseres av ImageJ programvare (US National Institutes of Health); n = 3; *,
P
0,05; **
P
. 0,005 (høyre panel)
Folat gjennom FRα indusert Skov-3 celle migrasjon og invasjon og ned-regulert E-cadherin
Deretter testet vi effekten av folat og FRα på SKOV-3 celle migrasjon og invasjon. Basert på effekten av folat på celleproliferasjon, 12 og 60 Nm doser ble valgt for behandling av kontroll og shFRα Skov-3 celler. Transwell migrasjon og invasjon analyser viste at 12 og 60 nM folat betydelig indusert celle migrasjon og invasjon i kontrollceller mens knockdown av FRα blokkert folat-mediert celle migrasjon og invasjon (figur 4C). Deretter bestemmes det mulig nedstrøms mål for folat-mediert effekt på cellemigrering og invasjon. Den ekspresjon av E-cadherin, en viktig celle-celle adhesjonsmolekyl viktig for å regulere celle motilitet, ble funnet å være redusert gjør avhengig måte etter folat behandling (figur 4D). Slik nedregulering av E-cadherin etter folat behandling ble også opphevet etter knockdown av FRα.
ektopisk overekspresjon av RFC i høy FRα-uttrykkende SKOV-3 motvirkes folat-mediert celle proliferasjon, migrering og invasjon og gjenopprettet E -cadherin uttrykk
Vi har vist overekspresjon av FRα og redusert uttrykk for RFC i eggstokkreft, noe som tyder på at de kan utøve motsatt rolle i utviklingen av eggstokkreft. Enda viktigere, hos pasienter med høye FRα, generell og sykdomsfri overlevelse signifikant lenger i de med høy RFC uttrykk, impliserer den beskyttende rolle RFC i høye FRα kreft. For å belyse slike beskyttende rolle,
in vitro
funksjonelle studier ble utført på FRα-positive Skov-3 celler med ectopically uttrykt RFC etter folat behandling. RFC ble funnet å motvirke folat-mediert celleproliferering (figur 5A), migrering og invasjon (figur 5B). Dessuten, nedregulering av E-cadherin i celler etter folat behandling ble også opphevet etter overekspresjon RFC (figur 5C).
(A) Celleformeringshastigheten av SKOV-3-celler med ectopically uttrykt RFC eller kontroll-vektor ( kontroll) ble behandlet med 60 nM folat etter 5 dager vises som ganger endring i forhold til kontroll uten folat behandling (0 nM); n = 3; *,
P
0,05. (B)
In vitro
migrasjon (venstre panel) og invasjonsanalyser (panel høyre) i Skov-3 celler med ectopically uttrykt RFC eller kontroll vektor behandlet med 0 og 60 nM folat vises som prosent av kontroll behandles med 0 nM folat; n = 3; *,
P
0,05; **
P
0,005. (C) Immunoblotting av RFC og E-cadherin bruker proteinlysatene fremstilt fra Skov-3 celler med ectopically uttrykt RFC eller kontroll vektor (venstre panel). Relativ E-cadherin protein nivå som analyseres av ImageJ programvare (US National Institutes of Health); n = 3; **
P
. 0,005 (høyre panel)
Diskusjoner
I denne studien viste vi den progressive økningen i FRα mRNA og protein uttrykk fra non-tumorvev, godartede og borderline tumorer til karsinom. I tillegg ble FRα genamplifikasjon som en mulig mekanisme for dets overekspresjon også påvist for første gang i eggstokk-kreft. Overekspresjon av FRα i eggstokk-kreft [19], [20], så vel som i kreft i nyre, lunge og bryst, har tidligere blitt rapportert [32]. Våre resultater tyder også på at et høyt FRα uttrykk korrelerer med dårlig histologisk grad og avanserte stadier av sykdommen, noe som tyder på sine roller i eggstokktumorprogresjon.
I motsetning til FRα, en lavere RFC mRNA og protein uttrykk i eggstokkreft var funnet når man sammenligner med normalt vev eller godartede svulster. RFC er ubikvitært uttrykt i normalt vev, og er den viktigste folat transportsystem for transport av naturlige folater som 5-metyl eller 5-formyl-tetrahydrofolat (THF), og antifolater som metotreksat (MTX) og pemetrexed [16]. 5-metyl THF er en kofaktor essensiell for DNA-metylering som normalt fører til undertrykkelse av onkogener [33]. Således tap av RFC er blitt beskrevet for å bidra til å kolonkreft [21]. I denne studien fant vi at redusert uttrykk for RFC ble signifikant assosiert med kortere overordnede og sykdomsfrie overlevelse, noe som tyder på at RFC kan betraktes som en markør for god prognose i eggstokkreft pasienter. Videre blant pasienter med høye FRα uttrykke eggstokkreft, generell og sykdomsfri overlevelse var betydelig bedre i de med høy RFC uttrykk enn de uten, impliserer den beskyttende rollen RFC for pasienter med disse svulstene.
viste også at FRα forsterkning og RFC promoter metylering korrelert med mRNA uttrykk i eggstokkreft. I tidligere rapporter har RFC arrangøren metylering blitt funnet i brystkreftceller [34] og primær lymfomer [35]. Våre funn antydet at oppregulering av FRα (en antatt onkogen folat transporter) og nedregulering av RFC (en antatt tumor suppressor typen folat transporter) ble kontrollert genetisk og epigenetiske henholdsvis i løpet av eggstokkreft utvikling.
Som nevnt i innledningen ovenfor, er folat essensiell for DNA-syntese [12], [13], [14], utøver dermed indirekte dens effekt på celleproliferasjon. Overekspresjon av FRα i NIH /3T3-celler er blitt rapportert å indusere økt cellevekst in vitro og in vivo [36]. Ved hjelp av folat på ulike doser fra 12 nM (regnes som kosttilskudd mangelfull i Nord-Amerika) til 60 nM (regnes normalt for supplement ikke-brukere), var vi i stand til å demonstrere celleproliferasjon i FRα-positive Skov-3 celler [13]. Omvendt, når FRα ble knockdown etter shRNA tilnærming, ble dette folat-mediert celle proliferasjon i SKOV-3-celler tapt, noe som bekrefter det faktum at folat faktisk transporterer gjennom FRα under prosessen for ovarial cancer celleproliferasjon. Tilsvarende har intracellulær ekspresjon av anti-antistoffer i FR eggstokkreft celler er rapportert å utøve vekstinhibitoriske effekter slik som vist ved redusert kolonidannelse i myk agar [37].
I tillegg til dets virkning på celleformering, vi også demonstrert
