Abstract
Bakgrunn
Blant de mer vanlige menneskelige kreftformer, invasive ductal carcinoma i bukspyttkjertelen har den verste prognosen. De fattige resultatet synes å være knyttet til problemer i tidlig deteksjon.
Metoder
Vi sammenlignet plasma protein profiler av 112 bukspyttkjertelen kreftpasienter med de av 103 sex-og alderstilpassede friske kontroller ( Cohort 1) ved hjelp av en nyutviklet matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering (oMALDI) QqTOF (kvadrupol time-of-flight) massespektrometri (MS) system.
Resultater
Vi fant at hemi -truncated apolipoprotein AII dimer (apoAII-2; 17252
m /z
), ikke-glykosylerte apolipoprotein CIII (ApoCIII-0; 8766
m /z
), og deres summert verdi ble betydelig redusert i bukspyttkjertelen kreftpasienter [
P
= 1,36 × 10
-21
P
= 4,35 × 10
-14, og
P
= 1,83 × 10
-24 (Mann-Whitney
U
-test); areal-under-kurven verdier på 0,877, 0,798 og 0,903, respektivt]. Betydningen ble ytterligere validert i totalt 1099 plasma /serumprøver, som består av 2 retrospektive kohorter [Kohort 2 (
n
= 103) og Cohort 3 (
n
= 163)] og en prospektiv kohort [Cohort 4 (
n
= 833)] innsamlet fra 8 medisinske institusjoner i Japan og Tyskland.
Konklusjoner
Vi har bygget en robust kvantitativ MS profileringssystem og brukte den til å validere endringer av modifiserte apolipoproteins i flere kohorter av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Honda K, Okusaka T, Felix K, Nakamori S, Sata N, Nagai H, et al. (2012) Altered Plasma apolipoprotein Endringer i pasienter med kreft i bukspyttkjertelen: Protein karakterisering og Multi-Institutional validering. PLoS ONE 7 (10): e46908. doi: 10,1371 /journal.pone.0046908
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: May 30, 2012; Godkjent: 06.09.2012; Publisert: 08.10.2012
Copyright: © Honda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Program for fremme av grunnleggende studier i helsefag utført av National Institute of Biomedical Innovation of Japan, Helse og Labour Sciences stipend fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan, National Cancer Center Research and Development Fund og delvis av den tyske Research Foundation (DFG) (FE 940 /2-1). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. HK og TS er de ansatte i Mitsui kunnskapsindustri, og kast og NO brukes til tilhører Molecuence Corporation. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne har erklært at ingen andre konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Med en 5-års overlevelse på mindre enn 10%, invasive ductal carcinoma i bukspyttkjertelen har den verste prognosen blant de mer vanlige humane maligniteter [1], [2], [3]. Den dårlige utfallet av bukspyttkjertelen kreftpasienter synes å være knyttet til problemer med tidlig oppdagelse. De fleste pasienter med tidlig stadium bukspyttkjertelkreft har ingen symptomer, og ikke besøker klinikker før sykdommen har kommet til et avansert stadium. Fordi kirurgisk reseksjon er foreløpig den eneste kurative behandling for kreft i bukspyttkjertelen, er tidlig diagnose før utviklingen av metastase avgjørende for å forbedre resultatet. Men ikke etablert en screening metode for kreft i bukspyttkjertelen [2]. Forbedret computertomografi (CT) og positronemisjonstomografi (PET) er nyttige for diagnostisering av pankreatiske sykdommer, men disse modaliteter er potensielt farlige og vil trolig være altfor arbeidskrevende og kost ineffektiv for massescreening, på grunn av den forholdsvis lave forekomsten for kreft i bukspyttkjertelen.
sirkulerende blod proteom- har store løftet som et reservoar av informasjon som kan bli brukt for diagnostisering av forskjellige fysiologiske og patologiske tilstander [4]. Vi har tidligere funnet en plasma biomarkør sett som var i stand til å skille bukspyttkjertelkreft pasienter, inkludert de med stadium I og II sykdom fra friske personer ved massespektrometri (MS) -baserte proteomikk [5]. Det var imidlertid ikke mulig å identifisere markørproteiner, og tallene /kildene til saker og typer av sykdommen var begrenset [6].
I denne studien har vi bestemt aminosyre sekvenser og modifikasjoner av markør proteiner og validert deres betydning i større kohorter. Her rapporterer vi at de to modifiserte former av plasma /serum apolipoproteins er redusert hos pasienter med bukspyttkjertelsykdommer.
Materialer og metoder
Pasientprøver
Fire kohorter (nemlig Kohorter 1 -4) bestående av totalt 1314 plasma- eller serumprøver ble innsamlet på følgende medisinske institusjoner i to land (Japan og Tyskland) (Tabell S1 og S2):
Cohort 1.
215 plasmaprøver [sex-og alderstilpassede pasienter med histologisk eller cytologisk påvist bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (
n
= 103) og friske kontroller (
n
= 112)] samlet ved National Cancer center Hospital (senteret) (Tokyo, Japan) og Tokyo Medical University Hospital (TMUH) (Tokyo, Japan) mellom august 2002 og februar 2005, som rapportert tidligere [5].
Cohort 2.
103 plasmaprøver [sex-og alderstilpassede bukspyttkjertelkreft pasienter (
n
= 62) og friske kontroller (
n
= 41)] nylig samlet på Senteret mellom august 2003 og mai 2005.
Kohort 3.
163 serumprøver [bukspyttkjertelen kreftpasienter (
n
= 52), pasienter med kronisk pankreatitt (
n
= 58) og friske kontroller (
n
= 53)] samlet ved Institutt for generell kirurgi, Universitetet i Heidelberg (Heidelberg, Tyskland) mellom 2003 og 2006 [7], [8].
Cohort 4.
833 plasma (og serum) prøver samlet inn prospektivt fra 7 medisinske institusjoner i Japan [Senteret, Osaka Rikshospitalet (Osaka, Japan), Jichi Medical School Hospital (Shimotsuke, Japan), Osaka Medical Center for kreft og hjerte- og karsykdommer (Osaka, Japan), TMUH, Osaka Medical College Hospital (Osaka, Japan), og Fukuoka universitetssykehus (Fukuoka, Japan)] mellom august 2006 og oktober 2008 for denne studien. Et dokument detaljering standard operasjonsprosedyrer ble distribuert til hvert institutt, og alle plasmaprøver ble samlet inn prospektivt under identiske forhold. Dette var en vesentlig sykehusbasert kohort bestående av friske frivillige og nykommere til hovedsakelig gastrointestinale tjenester på de deltakende sykehus. De endelige diagnoser av pasientene ble samlet separat fra sine blodprøver. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle fag. Studien Protokollen ble gjennomgått og godkjent av etisk komité av hver deltakende institusjon.
innsamlings- og oppbevaringsbetingelser (for eksempel samling rør, antikoagulantia, temperatur og antall fryser og tiner sykluser) ble holdt strengt identisk blant plasmaprøver innen samme kullet. Tilsynelatende hemolyserte prøver ble ekskludert. Alle prøvene ble blindet og randomisert før MS-analyse (detaljerte prosedyrer er tilgjengelige i Methods S1). Kun plasmaprøver ble anvendt for MS-analyse av kohort 4. For å sikre reproduserbarhet av målingene, ble prøvene i kohort 4 analyseres uavhengig ved hjelp av to undersøkte lagene ved forskjellige laboratorier [NCCRI (Tokyo, Japan) og Molecuence Corporation (Yokohama, Japan)] .
Immunpresipitasjon og Immunoblotting
Anti-pan apoAII kanin polyklonale antistoff ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, UK). Immunoutfelling ble utført ved anvendelse av immunoaffinitetskromatografi (IAC) Protein G-perler (Bruker Daltonics). To kanin polyklonale antistoffer ble reist mot apoAII monomere peptider med -ATQ og -at C-endene. cDNA fragmenter av apoAII (koding aminosyrer 1-100 og 1-99; NP_001634) ble forsterket av PCR og subklonet inn pGEX-6P-2 plasmider (GE Healthcare). N-terminalt glutation S-transferase (GST) -tagged fusjonsproteiner ble uttrykt i
Escherichia coli Hotell og affinitetsrenset på glutation-Sepharose 4B (GE Healthcare) som beskrevet tidligere [9]. Reaktiviteten av antistoffer med de GST-merkede proteiner ble bestemt som tidligere beskrevet [10].
Proteinprøver ble separert ved SDS-PAGE og elektroblottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, Massachusetts). Blottene ble visualisert med en forbedret kjemiluminescens kit (GE Healthcare) og kvantifisert som tidligere beskrevet [11].
CA19-9 Måling
serumprøver i kohort 4 ble analysert ved hjelp av kommersielt tilgjengelig enzymimmunoassay kjemiluminescens sett for CA19-9 (LUMIPULSE Presto CA19-9, Fujirebio Inc., Tokyo, Japan) [5].
statistikker
Statistisk signifikante forskjeller ble oppdaget ved hjelp av Mann-Whitney
U
-, student
t
– og χ
2 tester. Mottaker operatør karakteristiske (ROC) kurver ble generert og AUC-verdier ble beregnet ved hjelp StatFlexs programvare (versjon 5.0, Artech, Osaka, Japan) og moduler av R-prosjekt (https://www.r-project.org/) [5 ], [12], [13].
Resultater
Utvikling av MS Måling med høy reproduserbarhet
Vi utviklet et plasmaprotein profilering system ved å bruke automatisert hydrofob kromatografi og oMALDI QqTOF-MS. I en kvalitetskontroll eksperiment, ble 2173 uavhengig lav molekylvekt (i området 1000-30,000
m /z
) proteintopper detektert fra en 5 pl prøve av blandet plasma fra friske forsøkspersoner. Den gjennomsnittlige korrelasjonskoeffisient (CC) verdi for alle 2173 topper blant tredoble målinger var 0,983 (Fig. 1a). Reproduserbarheten av målingen ble ytterligere bekreftet ved beregning av variasjonskoeffisienten (CV) verdier for toppene av interesse (se nedenfor) (Fig. 1B).
(A) To-dimensjonal plott analyse som viser korrelasjonen av 2173 tilsvarende topper mellom to av de tre eksemplarer målinger (markert i rødt, blått og grønt) av en standard plasma blanding. Linjene indikerer to-fold forskjeller. (B) En standard plasma blanding ble analysert 24 ganger, og CV-verdiene [= SD (søyler) /middel (spalter)] av representative proteintopper (apoAI, apoAII-2ox, apoAII-2, og ApoCIII-0) ble beregnet . (C) Overgang av CC-verdier mellom de duplikate målinger av en standard plasma-blanding i 12 plater (24 målinger) av kohort 1. (D og E) korrelasjonsmatrisen (D) og fordeling (E) av innbyrdes likhet (CC-verdier) for de 24 duplikat målinger (1-24) 0,18.
Vi har utarbeidet et stort lager av plasma blanding som en kvalitetskontroll standard, og to prøver av bestanden ble behandlet samtidig med hver 22 testprøver . CC verdi av standard ble overvåket for å sikre konsistens i målingen for hver plate (Fig. 1C-E).
Protein Identifikasjon av Tandem massespektrometri (MS /MS)
Kvantitativ plasma MS data ble innhentet fra 103 pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og 112 sex-og alderstilpassede friske kontroller (gruppe 1). Vi fant en 17252-
m /z
MS topp (fig. 2, angitt med doble stjerne) som skilte seg ut som å ha den høyeste statistisk signifikans (
P
= 1,36 × 10
-21, Mann-Whitney
U
-test) (fig. S1). Molekylvekten var nesten identisk med den til et markørprotein vi hadde identifisert tidligere ved hjelp av et annet system MS [5]. MS /MS-analyse og database /litteratur søkene viste at 17 252-m /z protein var en heterodimer av apoAII, en peptidkjede av som manglet et glutamin (Q) resten ved C-terminalen (-ATQ /-At) (nemlig , apoAII-2) (fig. S2 og S3) [7], [14]. Oksidert form av apoAII-2 (17 269
m /z
, apoAII-2ox) [14] viste den nest høyeste statistisk signifikans (
P
= 5.14 × 10
-20) (tabell S3).
(A) Spectra for representative bukspyttkjertelkreft pasienter og kontroller innenfor områdene 16 900 til 17 500
m /z product: (øverst) og 8500-9250
m /z product: (nederst). (B) Gel-lignende bilder av apoAII og ApoCIII-0 i Cohort 1 (215 tilfeller). (A og B) Svarte enkle stjerne (*), røde doble stjerner (**), svart trippel stjerner (***), og røde firemannsrom stjerner (****) indikerer MS toppene apoAII-en, apoAII-2 , apoAII-3, og ApoCIII-0, respektivt.
for å bekrefte identiteten av proteinet, gjennomførte vi immunopresipitering med et antistoff spesifikt for apoAII, og de immunoutfelte proteinene ble analysert ved oMALDI -QqTOF-MS (fig. S4). ApoAII-2 (-ATQ /-På) og oksidert form (apoAII-2ox) ble oppdaget sammen med andre etter translatorisk modifiserte former av apoAII [AII-en (17380
m /z
) og AII- 3 (17 124
m /z
)]. ApoAII-en er en homodimer av untruncated apoAII peptider med C-terminal ende av -ATQ /-ATQ. ApoAII-3 er en homodimer av AII-peptidkjeder, både de C-terminale ender mangler glutamin (Q) rester (-At /-At) (Fig. 3) [14].
(A) beregnet tre-dimensjonale struktur av dimerisert apoAII protein. Modellen ble bygget ved hjelp av MOE programvarepakken (Ryoka Systems Inc., Tokyo, Japan). Rød farge indikerer en disulfidbinding. (B) Aminosyresekvenser og beregnede teoretiske molekylmasser av apoAII homo /heterodimerer (apoAII-1 til -5). To peptider ble dimerisert via en N-terminal disulfidbinding.
Et annet protein med en molekylstørrelse på 8766
m /z
viste også en svært signifikant forskjell (
P
= 4,35 × 10
-14) mellom kreft i bukspyttkjertelen pasienter og friske kontroller (fig. 2, angitt med firemannsrom stjerne). Molekylstørrelsen av proteinet var også nesten identisk med den i en av 4 markørproteiner som vi hadde rapportert i vårt tidligere studium [5]. MS /MS-analyse (Fig. S5) identifisert 8766-
m /z
protein som ApoCIII, som er en 79-amino-syre glykoprotein kjent for å ha tre forskjellig glykosylerte isoformer {ikke-glykosylerte (CIII-0), monosialyated (CIII-2), og disialylated (CIII-2) [15], [16]}, og den 8766-
m /z
protein tilsvarer ApoCIII-0. Identiteten ble bekreftet ved MS-analyse av proteiner immunoutfelt med anti-ApoCIII antistoff (data ikke vist).
Kombinasjon av apoAII-2 og ApoCIII-0 og dens validering
apoAII-2 og ApoCIII -0 var i stand til å skille de 103 bukspyttkjertelen kreftpasienter fra de 112 friske kontroller (gruppe 1) med et areal-under-kurven (AUC) verdi av 0,877 og 0,798, henholdsvis (fig. 4A og Tabell S3). Fordi både apoAII-2 og ApoCIII-0 ble redusert i bukspyttkjertelen kreftpasienter og fordelingen var gjensidig uavhengige (Fig. S6), enkel summering av de to biomarkører forbedret AUC-verdien til 0,903.
(A og B ) ROC analyse av apoAII-2, ApoCIII-0, og deres kombinasjon (apoAII-2 + CIII-0) i Kohorter 1 (A) og 2 (B). (C) ROC-analyse som viser kapasiteten til apoAII-2, ApoCIII-0, apoAII-2 + CIII-0, og CA19-9 for diskriminering av kreft i bukspyttkjertelen pasienter fra friske kontroller i den tyske kohorten (Cohort 3). (D) ROC analyse av apoAII-2 + CIII-0 i Cohort 4 i henhold til klinisk stadium (Cohort 4). (E) Fordeling av apoAII-2 + CIII-0 i henhold til klinisk stadium. Linjene indikerer medianverdier (gruppe 4).
Den høye diskriminering evnen til apoAII-2, ApoCIII-0, og deres summert verdi (heretter betegnet som apoAII-2 + CIII-0) mellom kreft i bukspyttkjertelen pasienter og kontroller ble validert i en uavhengig kohort bestående av 41 sex-og alderstilpassede friske kontroller og 62 bukspyttkjertelen kreftpasienter (Cohort 2) (fig. 4B og Tabell S3).
for å bekrefte universalitet dette diskriminering på tvers av ulike etnisiteter, vi neste undersøkt 163 serumprøver samlet inn i Tyskland (gruppe 3) (fig. 4C og tabell S4) [7], [8]. Reduksjonen av apoAII-2 og ApoCIII-0 i bukspyttkjertelen kreftpasienter var tydelig selv i denne kohorten. Imidlertid var reduksjonen av apoAII-2 og ApoCIII-0 syntes ikke å være spesifikk for kreft i bukspyttkjertelen. ApoAII-2 + CIII-0 ble betydelig redusert hos pasienter med kronisk pankreatitt (
P
= 8,86 × 10
-11).
Gjennomsnittsalderen for friske kontroller i Cohort 3 ( 39,1 år) var signifikant lavere enn den til pasienter med kreft i bukspyttkjertelen (63,1 år) eller pankreatitt (50,3 år) (tabell S1). Derfor kan muligheten for at den ekstremt høye verdien av apoAII-2 (0,958) i denne kohorten var tilskrives denne aldersforskjellen ikke utelukkes.
Prospective Multi-institusjonelle Validering
Plasma /serum protein profilering ved direkte MS ble innført som et revolusjonerende nytt verktøy for biomarkører [17], [18]. Imidlertid har sin gyldighet blitt hyppig diskutert [6], [19], hovedsakelig på grunnlag av mulige skjevheter i utvalget innsamling, lagring og fryse /tine, samt dårlig masse nøyaktighet, og dermed skape problemer med protein identifikasjon. For å sikre fravær av sampling bias, vi deretter samlet plasmaprøver prospektivt fra 7 medisinske institusjoner i Japan (Cohort 4) med samme forhåndsbestemt protokollen for blodprøvetaking, lagring og fryse /tining. Denne multi-institusjonelle samarbeidsstudie Gruppen ble organisert av «Third-Term omfattende kontroll Research for kreft» utført av MHLWJ og tilknyttet International Cancer Biomarker Consortium (ICBC) (https://www.fhcrc.org/science/international_biomarker /) og følger prinsippet om probe design (potensiell prøvetaking før utfallet konstatering og retrospektiv blindet evaluering).
Alle prospektivt innsamlede prøvene ble blindet, randomisert, og sendes til et laboratorium på Molecuence Corporation. Selv dette uavhengig /blindet validering viste at kreft i bukspyttkjertelen pasienter, inkludert de med tidlig stadium sykdommen, var lett skilles fra friske kontroller ved hjelp av en kombinasjon av apoAII-2 og ApoCIII-0 (apoAII-2 + cIII-0). de AUC-verdier for apoAII -2 + CIII-0 var 0,920, 0,918 og 0,919 for kreft i bukspyttkjertelen pasienter ved kliniske faser i-II, III-IV, og alle faser [TNM klassifisering, UICC (International Union mot kreft)] henholdsvis (fig. 4D).
Sammenligning og Kombinasjon med CA19-9
Kombinasjonen av apoAII-2 og ApoCIII-0 (apoAII-2 + CIII-0) var i stand til å oppdage 66,1% (160 /242) av kreft i bukspyttkjertelen pasientene, i forhold til friske individer (tabell S5) på en cut-off verdi [189 vilkårlige enheter (AU)] som var blitt vilkårlig bestemt for å oppnå en spesifisitet på 95% eller høyere [97,5% (115/118) ]. Med denne cut-off, følsomheten av apoAII-2 + CIII-0 ble dårligere enn CA19-9 [79,8% (193/242)], men spesifisiteten var bedre enn for CA19-9 [94,9% (112 /118)], og AUC-verdien av apoAII-2 + CIII-0 var omtrent lik den til CA19-9. Men reduksjonen av apoAII-2 + CIII-0 ble ikke påvirket av den kliniske stadium av sykdommen, og var påvisbar selv hos pasienter med stadium I kreft i bukspyttkjertelen (fig. 4E). AUC-verdien av apoAII-2 + ApoCIII0 for trinn I pankreaskreft (0,868) var høyere enn den til CA19-9 (0,774) (tabell S5), noe som antyder den potensielle fordel av apoAII-2 + ApoCIII0 spissen CA19-9 for deteksjon av tidlig stadium kreft i bukspyttkjertelen. Men antall scenen jeg bukspyttkjertelen kreftpasienter undersøkt i denne studien var fortsatt små (7 tilfeller), og dette problemet gjenstår å bli bekreftet.
Det var bemerkelsesverdig at 93,4% (226/242) av pasientene med bukspyttkjertelkreft ble påvist enten ved apoAII-2 + CIII-0 eller ved CA19-9 uten at spesifisitet for friske individer [93,2% (110/118)]. Videre apoAII-2 + CIII-0 var i stand til å detektere et bredt spekter av sykdommer i bukspyttkjertelen og hepatobiliære region med en følsomhet på 60% (tabell 1). Men reduksjon av apoAII-2 + CIII-0 så ikke ut til å være spesifikke for bukspyttkjertelen og gallesykdommer. Pasienter med øsofageal, gastrisk og kolorektal kreft viste også reduksjon av plasma apoAII-2 + CIII-0 med en frekvens på 36,4% (4/11), 23,9% (34/142), og 32,4% (46/142) henholdsvis.
i likhet signifikans ble reproduserbart oppnådd ved MS målinger utført uavhengig ved National Cancer Center Research Institute (NCCRI) (fig. 5 og data ikke vist).
Distribution (peak intensitet i vilkårlige enheter) (A), spektra av representative tilfeller (B), og ROC analyse (C) av de angitte modifiserte former av apoAII i Cohort 4. C, sunn kontroll (
n
= 128); P, kreft i bukspyttkjertelen (
n
= 249)
Novel Modifisering av apoAII
De fleste ( 95%). Sirkulerende apoAII proteinmolekyler danne N -terminally disulfid-bundne dimerer. I tillegg til de 3 kjente isoformer av apoAII (apoAII-1 til -3) [14] vi nylig identifisert to andre på en annen måte modifiserte apoAII dimerer (apoAII-4 og AII-5) (fig 3 og 5).:
p> apoAII-4 (17 023
m /z
), som mangler C-terminal glutamin (Q) og treonin (T) rester fra en peptid og glutamin rester fra den andre (-A /-På) .
apoAII-5 (16922
m /z
), som mangler C-terminal glutamin og treoninresiduer fra begge peptider (-A /-A).
apoAII -1 (intakte apoAII med -ATQ /-ATQ termini) ble ikke redusert i bukspyttkjertelcancerpasienter (fig. 5A), som indikerer at reduksjon av apoAII-2 ikke er forårsaket av en enkel reduksjon av den totale proteinproduksjon, men ved proteinmodifisering . Den spesifikke økning på apoAII-5 i bukspyttkjertelcancerpasienter indikerer at akselerert spaltning kan være en av de mekanismene som er ansvarlige for reduksjonen av apoAII-2 (se Diskusjon avsnitt).
Produksjon av antistoff som er spesifikke for peptidet med apoAII en -ATQ eller -På slutten.
for å verifisere avkutting av apoAII hos pasienter med bukspyttkjertelsykdommer, vi nylig produsert en polyklonale antistoff som spesifikt gjenkjenner apoAII peptid med en intakt C-terminalen (-ATQ), men ikke at med en spaltet C-terminus (-At) (fig. 6A), samt et polyklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner Apo-AII peptid med en spaltet (-At) C-terminus, men ikke det med en intakt ( -ATQ) C-terminale ende (fig. 6B).
(A og B) Reaktivitet av anti-apoAII (-ATQ) (A) og anti-apoAII (-At) (B) peptidantistoffer med GST -tagged apoAII monomerer som bærer -ATQ (GST-ATQ) (aminosyrer 1-100) og -at (GST-AT) (aminosyrene 1-99) termini. (C) Ikke-denaturering immunoblot analyse av plasmaprøver fra friske kontroller (baner af) og representative bukspyttkjertelen kreftpasienter (sporene GL) med antistoffer mot pannen apoAII protein (øverst), apoAII (-ATQ) peptid (i midten), og apoAII ( -ATQ) peptid (nederst). En kreft i bukspyttkjertelen pasient (spor i) viser en langsommere-migrerende apoAII protein (angitt med ‡), men dets molekyl natur gjenstår å bli bestemt. (D) Gel-aktig bilde av oMALDI-QqTOF-MS spektra innenfor området 16,900-18,100 m /z for representative friske kontroller (baner af tilsvarer C) og bukspyttkjertelen kreftpasienter (baner GL tilsvarer C).
resultatet av immunoblot analyser ved hjelp av disse antistoffene (fig. 6C) var i samsvar med de som ble oppnådd ved oMALDI-QqTOF-MS (fig. 6D). I 2 bukspyttkjertelkreft pasienter (baner g og h) som manglet apoAII-en og apoAII-2, men besatt apoAII-4 og apoAII-5 (Fig. 6D), immunoblot analyse under ikke-denaturerende (native) forhold avdekket tap av 17 -kDa apoAII peptidet kan påvises med anti-apoAII (-ATQ) antistoff (i midten, fig. 6C), og en raskere migrerende (mindre) apoAII peptid ble påvist med anti-Apo Pan-AII-antistoff (topp, merket med en stjerne, fig . 6C).
Diskusjoner
kreft i bukspyttkjertelen er en ødeleggende sykdom, men en betydelig andel av pasientene kan kureres hvis deteksjon er mulig på et tidlig stadium [20], [21]. For å forbedre resultatet av kreft i bukspyttkjertelen, er opprettelse av en effektiv screening-metode avgjørende. Selv om reduksjon av de modifiserte plasma /serum apolipoproteiner som rapporteres her er ikke spesifikke for kreft i bukspyttkjertelen, er denne testen minimal invasiv og i denne forstand kan komme i betraktning for anvendelse til primær screening av asymptomatiske pasienter med kreft i bukspyttkjertelen, så vel som andre gastrointestinale sykdommer blant generelt (tilsynelatende friske) befolkningen, hvis de følges av en passende andre screening for differensialdiagnose, for eksempel forbedret CT eller ultralyd [22]. Screening av blod ved MS ville gi asymptomatiske pasienter med en dyrebar mulighet til å motta klinisk oppmerksomhet og eventuelt øke frekvensen av oppdagelsen av tidlig stadium kreft i bukspyttkjertelen. Imidlertid sensitiviteten og spesifisiteten av det aktuelle settet (apoAII-2 + CIII-0), selv når det kombineres med CA19-9, synes ikke å være tilstrekkelig, og det antall pasienter med tidlig stadium kreft i bukspyttkjertelen undersøkt i dette studiet var liten. Det vil være nødvendig å gjennomføre en prospektiv randomisert studie før sikre konklusjoner kan trekkes om nytten av redusert apoAII-2 og ApoCIII-0 i innstillingen av kreft screening.
De fleste tumormarkører utskilt av kreftceller inn i sirkulasjon ikke viser et signifikant økning når kreft på et tidlig stadium, og den tumorbelastning i forhold til hele kroppen er liten. Denne arten av de fleste konvensjonelle tumor markører gjør deres søknad til kreft screening vanskelig [3], [23]. Men i motsetning til konvensjonelle tumormarkører, ble de modifiserte apolipoproteiner redusert hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og andre gastrointestinale sykdommer. Apolipoproteiner produseres hovedsakelig i leveren, og apoAII og ApoCIII proteiner er usannsynlig å bli produsert av cancerceller. Men 17252-
m /z
apoAII heterodimer med -På /-ATQ C-terminale endene (apoAII-2) og 8766-
m /z
glykosylerte ApoCIII (ApoCIII-0) protein ble funnet å være redusert mest signifikant hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen, inkludert de med tidlig stadium (trinn i og II) sykdom. Disse funnene indikerer at reduksjon av disse spesifikke former for apolipoprotein ikke er en følge av redusert proteinproduksjon på grunn av ødeleggelse av pankreatisk vev, men skyldes visse post-translasjonelle mekanismer.
Det har blitt rapportert at økt serum karboksyl- og aminopeptidase aktiviteter generere kreftspesifikke peptidome mønstre gjennom spalting av C- eller N-termini av ulike plasma /serumproteiner [24]. Økt serum karboksypeptidase A-aktivitet har blitt rapportert hos pasienter med tidlig stadium bukspyttkjertelkreft [25]. Syntetisk
N
-acetyl-fenyl-L-3-thiaphenylamine har vært brukt som et følsomt substrat for å måle aktiviteten av enzymet, men liten innledende spalting av en C-terminal Glutamin (Q) rest kan prime /sensibilisere apoAII protein til ytterligere proteolytisk fordøyelse, og således nedbrytning /reduksjon av apoAII-2 kan være påvisbart følsomt selv hos pasienter med tidlig stadium kreft i bukspyttkjertelen. Den gjensidige økning av apoAII homodimer med -A /-En ender (apoAII-5) støtter denne oppfatningen (Fig. 5A). Noen kreft i bukspyttkjertelen pasienter selv viste fullstendig uttømming av apoAII-1 og -2-proteiner og tilsynekomsten av nye apoAII-4 og -5 proteiner (spor f og g, fig. 6C og 6D), som indikerer at forbedringen av proteolytisk fordøyelse er ansvarlig for reduksjon av apoAII-2 hos disse pasientene.
det er en svakhet som må overvinnes før de nåværende funnene kan brukes klinisk. Det er generelt akseptert at en reduksjon i nivået av en hvilken som helst biomarkør er vanskelig å anvende som et diagnostisk mål, fordi en meget reproduserbar målesystem er nødvendig for å unngå falsk negativitet. De små protein modifikasjoner som presenteres her, kan tiden bli oppdaget og kvantifisert bare ved MS. Vi bygget et robust analysesystem som benytter automatisert prøveopparbeidelse ved hjelp av magnetiske kuler [26]. Denne automat reduserte svingninger i håndtering, og bruk av ortogonale MS utryddet noen masse unøyaktigheter som følge av den litt ujevne overflater av MALDI platene. Vi har også nøye eliminert eventuelle pre-analytisk skjevhet av prøvetakingsprosedyrer og unngått å bruke kompliserte beregningsalgoritmer. Imidlertid er MS-baserte protein kvantifisering fremdeles en komplisert teknologi for rutinemessig klinisk bruk, og dens anvendelse i cancer screening krever ytterligere forbedring av robusthet, gjennomstrømning, og kostnadseffektivitet.
I denne studien med hell produsert vi et par antistoffer som spesifikt gjenkjenner intakt apoAII peptidet med en -ATQ terminus og den avkortet apoAII peptidet med en -at terminus (fig. 6). Vi er nå i ferd med å etablere en sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for å kvantifisere den apoAII-2-heterodimer med en hemi-avkortet C-terminale ende (-ATQ /-At) ved hjelp av disse antistoffer. Vi tror at perfeksjon av denne analysen vil i stor grad legge til rette for klinisk anvendelse av dagens funn.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Nedgang på 17 252-m /z topp hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s001 product: (PDF)
Figur S2.
Identifisering av apoAII-2 heterodimer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s002 product: (PDF)
Figur S3.
Identifisering av apoAII-2 heterodimer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s003 product: (PDF)
Figur S4.
Bekreftelse av protein identitet ved immunoprecipitation og MS
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s004 product: (PDF)
Figur S5.
Identifikasjon av ApoCIII
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s005 product: (PDF)
Figur S6. .
Korrelasjon av apoAII-2 og ApoCIII0
doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s006 product: (PDF)
Tabell S1.
Kliniske kjennetegn ved individer i Kohorter 1 til 3.
doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s007 product: (PDF)
Tabell S2.
Kliniske kjennetegn ved individer i Cohort 4 (n = 833)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s008 product: (PDF)
tabell S3.
Reduksjon av plasma apoAII-2 og ApoCIII-0 i pasienter med kreft i bukspyttkjertelen (Kohorter 1 og 2)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s009 product: (PDF)
Tabell S4 .
Validering av apoAII-2 og ApoCIII-0 i den tyske kohorten (Cohort 3)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s010 product: (PDF)
Tabell S5.
Reduksjon av apoAII-2 + ApoCIII-0 hos pasienter med tidlig stadium kreft i bukspyttkjertelen (Cohort 4)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0046908.s011 product: (PDF)
Metoder S1 .
doi: 10,1371 /journal.pone.0046908.s012 product: (PDF)
Takk
Vi takker legene. T. Yoshida, S. Hirohashi, N. Moriyama, og T. Kakizoe (NCC) for nyttig diskusjon og oppmuntring; Ms T. Umaki, og Ms Y. Nakamura (NCC) for å få hjelp; Ms C. Ebihara (Molecuence), Mr. T. Goto, M. Kikuchi, M. Hirata (PerkinElmer), Mr. I. Nakajima, Ms Y. Matsuyama (Bruker Daltonics), og Ms I. Sakurai (Beckman Coulter) for teknisk støtte; og Mr. T. Hatakeyama (SRL Inc., Tokyo, Japan) for transport av prøvene.
